突變型PUMA（S10A）對Hela細(xì)胞的凋亡作用及其分子機制

熊為國，孫 潔，黃 偉，鄭澤琪，3

突變型PUMA（S10A）對Hela細(xì)胞的凋亡作用及其分子機制

熊為國1，孫 潔1，黃 偉2，鄭澤琪1，3

目的觀察突變型PUMA和野生型PUMA對Hela細(xì)胞在促凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面的生物學(xué)功能差異，并探討導(dǎo)致這些差異的分子機制。方法實驗隨機分為：空載體質(zhì)粒組、野生型PUMA組、突變型PUMA 3個實驗組，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法分別將空載質(zhì)粒、野生型PUMA質(zhì)粒、突變型PUMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24、48 h后用實時定量PCR和Western blot法檢測各組PUMA表達情況；野生型實驗組和突變型實驗組分別加入蛋白質(zhì)合成抑制劑放線菌酮后，Western blot法檢測PUMA蛋白的表達；MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測野生型PUMA與突變型PUMA對細(xì)胞增殖抑制和促凋亡作用。結(jié)果在相同轉(zhuǎn)染效率的情況下，通過Western blot法分析野生型PUMA組和突變型PUMA組的表達水平，結(jié)果表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個更高的穩(wěn)定狀態(tài)。轉(zhuǎn)染24 h后誘導(dǎo)表達野生型和突變型的PUMA細(xì)胞中均加入放線菌酮，結(jié)果表明，突變型PUMA蛋白降解延遲、半衰期延長；光密度值測定結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后，細(xì)胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒在24、48 h的存活率均比野生型PUMA組低（P＜0.05，P＜0.01）；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著PUMA轉(zhuǎn)染時間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細(xì)胞比野生型組細(xì)胞的凋亡率增加更加明顯（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論PUMA具有抑制Hela細(xì)胞增殖、促進其凋亡的作用，而其10號位的絲氨酸被丙氨酸取代后增加了突變型PUMA的穩(wěn)定性、延長了其半衰期，導(dǎo)致突變型比野生型PUMA對Hela細(xì)胞的抑制作用及促凋亡功能得到加強。

p53上調(diào)凋亡調(diào)制物；定點突變；蛋白穩(wěn)定性；細(xì)胞凋亡；Hela細(xì)胞

p53上調(diào)凋亡調(diào)制物（p53 up-regulated modulator of apoptosis，PUMA）蛋白屬于BCL-2家族、促凋亡蛋白亞家族中的重要成員之一，最早由余健等［1－3］在直結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因能被p53強大快速誘導(dǎo)，并且能通過線粒體途徑直接激活凋亡的基因，所以被稱之為PUMA。由于PUMA是細(xì)胞凋亡的主要介導(dǎo)者，具有強大的促凋亡能力，其轉(zhuǎn)錄體PUMA-α編碼一個全長為193個氨基酸的蛋白，近年研究［4］顯示一個重要的蛋白突變點位：即蛋白10號位絲氨酸磷酸化位點。該研究主要通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)等方法比較突變型PUMA和野生型PUMA對Hela細(xì)胞在抑制其增殖及促凋亡方面的生物學(xué)功能差異，并深入研究導(dǎo)致這些差異的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 野生型和突變型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA質(zhì)粒由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物教研室構(gòu)建及贈與［5］；Hela細(xì)胞由本教研室保存。

1.1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒、LipofectaminTM2000、TRIzol試劑均購自上海Invitrogen公司；1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司；PUMA-C末端抗體購自美國CST公司；PI、Hoechst 33342染料購自美國Sigma公司；MTT、DMSO購自美國Ameresco公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自中國全式金公司。

1.2 方法

1.2.1 Hela細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng) 從液氮中取出Hela細(xì)胞，37℃水浴解凍后，迅速放入含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 mg／ml鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，生長至80%以上密度時傳代，轉(zhuǎn)染前1 d更換無抗生素的1640培養(yǎng)基過夜。

1.2.2 野生型和突變型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA質(zhì)粒測序 將兩種質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)公司測序并進行BLAST比對。

1.2.3 實驗分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 ①空載體質(zhì)粒組：空載質(zhì)粒pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h或48 h實驗組。②24 h野生型PUMA組：野生型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h實驗組。③24 h突變型PUMA組：突變型pIRES2-EGFP-

（HA）2-PUMA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h實驗組。④48 h野生型PUMA組：野生型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48 h實驗組。⑤48 h突變型PUMA組：突變型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞48 h實驗組。以上實驗組按照Invitrogen公司提供的LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染protocol操作，以脂質(zhì)體（μl）：DNA（μg）＝3∶1比例轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。

1.2.4 實時定量PCR檢測各組細(xì)胞PUMA的轉(zhuǎn)錄

總RNA的抽提采用Invitrogen公司的TRIzol Reagent，根據(jù)說明書操作，紫外分光光度儀檢測總RNA濃度，A260／A280為1.79～2.00，并計算RNA含量，所提取RNA于－80℃保存?zhèn)溆?。制備PUMA和βactin的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Light Cycler RealTime PCR擴增儀進行反應(yīng)，制作融解曲線，確定擴增產(chǎn)物的特異性。分別測定每個樣品野生型PUMA、突變型PUMA、β-actin mRNA的CT值，每個樣品均作復(fù)管以減少操作誤差。采用相對定量方式表示各樣品目的基因的ΔCT，再根據(jù)ΔΔCT計算2－ΔΔCT。ΔCT＝目的基因CT－內(nèi)參基因CT，ΔΔCT＝目的基因ΔCT－內(nèi)參基因ΔCT。擴增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸10 s，40個循環(huán)后，72℃延伸10 min。Gen-Bank中查找目的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列，由英駿公司合成。PUMA上游引物：5’-GCGGGGAGGAGGAACAGT-3’，下游引物：5’-TGTGGCCCCTGGG TAAGG-3’；β-actin上游引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。

1.2.5 Western blot法檢測細(xì)胞中突變型、野生型PUMA蛋白的表達 轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24、48 h，提取蛋白裂解液，測定蛋白濃度，Western blot法分別檢測突變型與野生型PUMA在細(xì)胞中的表達。

1.2.6 Western blot法檢測細(xì)胞中突變型、野生型PUMA蛋白的降解 將1 g放線菌酮溶解于10 ml DMSO，將其配制成100 mg／ml母液，在轉(zhuǎn)染突變型、野生型PUMA質(zhì)粒24 h后的Hela細(xì)胞中均加入100 mg／ml母液使其終濃度為10～20 μg／ml，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、6、12、24、48 h后使用Western blot法檢測突變型、野生型PUMA蛋白的降解情況。

1.2.7 MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖的抑制情況

轉(zhuǎn)染后24、48 h，96孔培養(yǎng)板各組的每孔分別加入MTT溶液20 μl（終濃度0.5 mg／ml），37℃繼續(xù)孵育4 h，棄盡板中的培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。同時設(shè)置不加細(xì)胞的調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。以每組6個孔（OD值－空白對照組OD值）的平均值作為各組的平均OD值。細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－轉(zhuǎn)染組OD值／細(xì)胞對照組OD值）×100%。

1.2.8 AnnexinⅤ-FITC／PI雙標(biāo)記法檢測各組細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染后24、48 h細(xì)胞，進行AnnexinⅤ檢測。將細(xì)胞懸浮于結(jié)合緩沖液中，調(diào)整濃度為2.5 ×105／ml，與FITC標(biāo)記的AnnexinⅤ混合，室溫孵育10 min后，1 000 r／min離心10 min，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，緩沖液重懸細(xì)胞，PI染色，上機測試分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間差異比較用單因素方差分析，各組組間比較用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 野生型、突變型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA質(zhì)粒測序結(jié)果野生型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA質(zhì)粒測序后在線比對，結(jié)果顯示PUMA全基因序列堿基完全正確，而突變型pIRES2-EGFP-（HA）2-PUMA質(zhì)粒測序結(jié)果顯示：第28～30位堿基由TCC突變?yōu)镚CC，其他堿基均無突變，見圖1。

圖1 野生型和突變型PUMA質(zhì)粒的測序結(jié)果比較

2.2 實時定量PCR檢測突變型PUMA質(zhì)粒與野

生型PUMA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄效率結(jié)果顯示：突變型PUMA與野生型PUMA轉(zhuǎn)染24 h后，實時定量PCR檢測野生型PUMA 24 h過表達量相對于空載體質(zhì)粒ΔΔCT為－9.999，而突變型PUMA24 h過表達量相對于空載體質(zhì)粒ΔΔCT為－9.869；野生型PUMA 48 h過表達量相對于空載體質(zhì)粒ΔΔCT為－13.880，而突變型PUMA 48 h過表達量相對于空載體質(zhì)粒ΔΔCT為－15.082。實驗表明突變型PUMA質(zhì)粒與野生型PUMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)錄效率一致。見表1。PCR檢測顯示在相同轉(zhuǎn)染率的情況下，突變型PUMA質(zhì)粒與野生型PUMA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄效率相同，因此，PUMA質(zhì)粒并沒因為該基因的第28號堿基發(fā)生突變其轉(zhuǎn)錄效率發(fā)生改變，提示突變型PUMA蛋白表達升高可能是因為突變型PUMA蛋白穩(wěn)定性較野生型PUMA蛋白的穩(wěn)定性高，見圖2。

表1 各實驗組CT值

圖2 突變型與野生型PUMA質(zhì)粒的實時定量PCR結(jié)果

2.3 Western blot法檢測突變型與野生型PUMA蛋白表達情況突變型PUMA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞24 h后表達較野生型PUMA質(zhì)粒組表達量升高（P＜0.05），48 h后更明顯（P＜0.05）。之前，PCR檢測發(fā)現(xiàn)在相同轉(zhuǎn)染率的情況下，突變型PUMA質(zhì)粒與野生型PUMA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄效率相同，因此，PUMA質(zhì)粒并沒因為該基因的第28號堿基發(fā)生突變其轉(zhuǎn)錄效率發(fā)生改變，這表明突變型PUMA蛋白表達升高可能是因為突變型PUMA蛋白穩(wěn)定性較野生型PUMA蛋白的穩(wěn)定性高，見圖3。

圖3 Western blot法檢測突變型與野生型PUMA蛋白表達情況

2.4 Western blot檢測突變型與野生型PUMA蛋白降解情況突變型PUMA蛋白較野生型PUMA蛋白降解速度延遲，見圖4，表明突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白穩(wěn)定性更強。由于改變了PUMA蛋白的磷酸化位點，導(dǎo)致PUMA蛋白的磷酸化程度下降進而導(dǎo)致PUMA蛋白的降解速率減慢，而這種降解的減慢很有可能是由于蛋白泛素化程度降低所致。

圖4 突變型與野生型PUMA蛋白降解情況

2.5 MTT檢測Hela細(xì)胞存活率結(jié)果顯示：細(xì)胞

轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后，細(xì)胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒在24、48 h的存活率均比野生型PUMA質(zhì)粒組低，見表2、圖5，表明突變型PUMA蛋白由于其穩(wěn)定性較野生型PUMA更強導(dǎo)致其抑制細(xì)胞增殖作用明顯增加。

表2 突變型PUMA與野生型PUMA對Hela細(xì)胞OD值的影響（n＝5，±s）

表2 突變型PUMA與野生型PUMA對Hela細(xì)胞OD值的影響（n＝5，±s）

與空載體質(zhì)粒組比較：*P＜0.05；與野生型PUMA組比較：＃P＜0.05

組別24 h48 h空載體質(zhì)粒0.763±0.0260.951±0.033野生型PUMA0.481±0.072*0.493±0.069*突變型PUMA0.395±0.065*＃0.341±0.062*＃

圖5 突變型與野生型PUMA抑制Hela細(xì)胞增殖柱狀圖

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測PUMA過表達誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染野生型24 h組凋亡率為（16.8± 2.1）%和突變型24 h組凋亡率為（21.5±2.7）%，高于轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒組的（9.7±1.9）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而轉(zhuǎn)染野生型48 h組凋亡率為（26.7±2.0）%和突變型48 h組凋亡率為（32.5 ±1.9）%，高于轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒組的（12.5± 0.8）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示突變型PUMA的促凋亡能力較野生型強，見圖6。

3 討論

本研究在突變型PUMA質(zhì)粒與野生型PUMA質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄效率基本一致情況下，通過MTT實驗顯示：Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后，細(xì)胞存活率隨著時間的延長逐漸下降，且轉(zhuǎn)染突變型PUMA質(zhì)粒在24、48 h的存活率均比野生型PUMA質(zhì)粒組低，這表明了突變型PUMA蛋白由于其穩(wěn)定性較野生型PUMA更強導(dǎo)致其抑制細(xì)胞增殖作用明顯增加。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，隨著PUMA轉(zhuǎn)染時間的增加，野生型和突變型兩組腫瘤細(xì)胞的凋亡率均逐漸升高，并且突變型組細(xì)胞比野生型組細(xì)胞的凋亡率增加更加明顯，表明突變型PUMA對Hela細(xì)胞促凋亡作用強于野生型PUMA。通過Western blot實驗顯示：突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一個更高的穩(wěn)定狀態(tài)，而突變型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白半衰期更長。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組Hela細(xì)胞凋亡結(jié)果

較早之前，PUMA研究多集中在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，主要通過一些如p53和非p53轉(zhuǎn)錄因子（如p73、E2F1和FOXO3a）上調(diào)其表達水平［6］。這些因素包括：基因毒性應(yīng)激、癌基因應(yīng)激、血清饑餓／細(xì)胞因子／生長因子撤離應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、缺血／再灌注等。而近年發(fā)現(xiàn)該蛋白存在翻譯后調(diào)節(jié)即蛋白磷酸化調(diào)節(jié)。Fricker et al［4］研究發(fā)現(xiàn)PUMA磷酸化位點位于10、96、106位的絲氨酸，其中10號位點的絲氨酸是主要的磷酸化位點。當(dāng)PUMA的10號位點的絲氨酸被磷酸化后可以促進其降解，其促凋亡作用減弱。

隨著對突變型PUMA研究的不斷深入，進一步研究PUMA在蛋白酶降解過程中的機制，如PUMA翻譯后調(diào)節(jié)是否存在磷酸化修飾及泛素化修飾雙調(diào)控？進一步闡明PUMA翻譯后磷酸化修飾調(diào)控機制，試圖尋找調(diào)節(jié)PUMA蛋白磷酸化相應(yīng)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，便可以使用相應(yīng)的磷酸激酶抑制劑增強腫瘤細(xì)胞凋亡，

為腫瘤治療找到一個新的治療靶點。最后，也將對PUMA其他的磷酸化位點進行深入研究。

［1］ Yu J，Zhang L，H Wang P M，et al.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells［J］.Mol Cell，2001，7（3）：673－82.

［2］ Nakano K，Vousden K H.PUMA，a novel proapoptotic gene，is induced by p53［J］.Mol Cell，2001，7（3）：683－94.

［3］ Han J，F(xiàn)lemington C，Houghton A B，et al.Expression of Bbc3， a pro-apoptotic BH3-only gene，is regulated by diverse cell death and suvival signals［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（20）：11318－23.

［4］ Fricker M，Prey O J，Tolkovsky A M，et al.Phosphorylation of puma modulates its apoptotic function by regulating protein stability［J］.Cell Death Dis，2010，1：e59.

［5］ 黃 偉，萬福生.突變型PUMA質(zhì)粒的構(gòu)建及表達［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，48（4）：341－5.

［6］ Yu J，Zhang L.PUMA，a potent killer with or without p53［J］.Oncogene，2008，27 suppl1：S71－83.

Mutant type PUMA can accelerate the apoptosis of Hela cells in vitro and its molecular mechanism

Xiong Weiguo1，Sun Jie1，Huang Wei2，et al
（1Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006；
2Clinical Laboratory，Children′s Hospital in Jiangxi Province，Nanchang 330006）

ObjectivTo investigate the differences of wild type PUMA protein mutant PUMA protein in apoptosis and proliferation inhibition function and to explore the molecular mechanism of these differences，which may pave the way for further study on tumor suppressor function of PUMA and its post-translational regulation on mechanism.MethodsHela cells were divided into 3 groups：wild type PUMA transfection group，mutant PUMA transfection group，and the empty vector control group.After transfection 24 h and 48 h the expression of PUMA was detected by Western blot and qPCR.The cellular proliferation inhibition was examined by MTT.The cellular apoptosis rates were examined by FCM.Wild type group and mutant group after joining protein synthesis inhibitors cycloheximide，degradation of PUMA protein were detected by Western blot，respectively.ResultsWe analyzed the expression levels of wild type PUMA and mutant PUMA by Western blot.This revealed that mutant PUMA was expressed at a higher steady state level than wild type PUMA in the same under the condition of transfection efficiency.Cells expressing wild type PUMA and mutant PUMA were treated with cycloheximide，and we then tested wild type PUMA and mutant PUMA protein degradation.This assay revealed that degradation of mutant PUMA protein delayed degradation and prolonged the half life.After mutant PUMA and WT plasmids cell transfection，the OD value results displayed certain degree proliferation inhibitory effect in a time-dependent manner Hela cells，and transfected with mutant PUMA was significantly lower than that after being transfected with WT at the 24 h and 48 h time point.There was significant difference（P＜0.05，P＜0.01）.FCM results showed that with the increase of transfection time，wild type and mutant of two groups of tumor cell apoptosis rate increased，and the mutant type group cell apoptosis rate increased more obviously，the difference was statistically significant（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionPUMA can inhibit Hela cells proliferation and promote its apoptosis.10 of serine was replaced by alanine can increase the stability of mutant PUMA，prolong its half-life，which results in inhibition and pro-apoptotic function strengthened in the mutant than wild type PUMA on Hela cells.

p53 up-regulated modulator of apoptosis；site-directed mutagenesis；protein stability；apoptosis；Hela cells

R 737.33；R 329.2；R 394.2

A

1000－1492（2014）11－1553－05

2014－08－11 接收

2012年江西省教育廳課題（編號：CJJ12101）

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院1心血管內(nèi)科、3高血壓病研究所，南昌 330006

2江西省兒童醫(yī)院檢驗科，南昌 330006

熊為國，男，主治醫(yī)師，碩士研究生；

鄭澤琪，女，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zeqizheng＠126.com