snRNA 在哺乳動(dòng)物中基因表達(dá)研究進(jìn)展

徐 妲，陳 璇，羅曉彤，金 一*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林延吉 133002；2.吉林市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林吉林 132001）

哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核和核仁輔助體中都含有一類小RNA 分子，即小核RNA（Small Nuclear RNA，snRNA）。snRNA 是一類非編碼RNA，有100～300 個(gè)堿基，每個(gè)細(xì)胞中可含有105～106 個(gè)RNA 分子。snRNA 的長(zhǎng)度在哺乳動(dòng)物中為100～215 個(gè)核苷酸。它們被RNA聚合酶II 或RNA 聚合酶III 轉(zhuǎn)錄[1]，其主要功能是參與mRNA 前體加工。snRNA 不參與蛋白質(zhì)合成，但能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成小核核糖核蛋白（Small Nuclear Ribonucleoprotein Particle，snRNP）。每個(gè)snRNP 顆粒由snRNA 和snRNP 特異性蛋白（包括Sm 蛋白，核蛋白家族）組成。snRNA 的蛋白質(zhì)部分具有核酸酶和連接酶活性，它能把轉(zhuǎn)錄在內(nèi)含子到外顯子的接點(diǎn)處切斷，并把2 個(gè)游離端連接起來(lái)。snRNA 一直存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中，與40 多種核內(nèi)蛋白質(zhì)共同組成RNA 剪接體，剪接體能催化哺乳動(dòng)物中前體mRNA 的成熟[2]。snRNA 還能影響哺乳動(dòng)物基因的表達(dá)，過量可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡和癌細(xì)胞增殖，而敲低可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖和癌細(xì)胞凋亡，這一發(fā)現(xiàn)為臨床治療帶來(lái)了新的希望。因此，了解snRNAs 的生物機(jī)制對(duì)于理解它們的調(diào)節(jié)和功能至關(guān)重要。本文綜述了snRNA 的分類、功能、基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄后修飾，為今后snRNA 在哺乳動(dòng)物中的研究提供理論參考。

1 snRNA 分類

1.1 Sm 類snRNA snRNA 在結(jié)構(gòu)上通常有Sm 蛋白結(jié)合位點(diǎn)，與一系列蛋白形成snRNP，主要剪切內(nèi)含子使mRNA 成熟[3]。Sm 類snRNA 被廣泛研究，由U1、U2、U4、U5、U7、U11 和U12 組成，由RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄[4]。前端snRNA 被轉(zhuǎn)錄到細(xì)胞核中，通常是5′末端加上7-甲基鳥苷酸構(gòu)成帽的結(jié)構(gòu)，然后通過核孔進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，Sm 類snRNA 由5'末端1個(gè)三甲基鳥苷酸（TMG）、3'末端莖環(huán)和1 組7 個(gè)Sm蛋白的結(jié)合形成異七聚體環(huán)結(jié)構(gòu)（圖1-A）[5]。3'末端莖環(huán)結(jié)構(gòu)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白存活識(shí)別所必需的，它能將snRNA 組裝成穩(wěn)定的核糖核蛋白，然后通過5' 末端1個(gè)三甲基鳥苷酸的類似“帽”結(jié)構(gòu)，將snRNP 導(dǎo)回到細(xì)胞核中。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核中，剪接或去除內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄后修飾的主要方面。

1.2 Lsm 類snRNA Lsm 蛋白是廣泛存在于多種生物體中的RNA 結(jié)合蛋白。Lsm 類snRNA 主要由U6 和U6atac 組成，參與各種與RNA 代謝相關(guān)的信號(hào)通路。在真核細(xì)胞中，Lsm 類snRNA 能夠特異地識(shí)別U6 RNA 的3′末端序列，并幫助U6 RNA 與剪切體其他成員相互作用，催化RNA 的剪接過程。與Sm 類snRNA相反，Lsm 類snRNA 由RNA 聚合酶III 轉(zhuǎn)錄但不會(huì)離開細(xì)胞核[6]。Lsm 類snRNA 含有1 個(gè)單甲基磷酸酯帽和1 個(gè)3'末端莖環(huán)，終止于一段尿嘧啶形成Lsm 蛋白的獨(dú)特異三聚體環(huán)的結(jié)合位點(diǎn)（圖1-B）[5]。在3'末端形成Lsm 結(jié)合位點(diǎn)，尿苷的運(yùn)行是轉(zhuǎn)錄終止子的2 倍。因此，Lsm 類snRNA 與Sm 類snRNA 是2 種不一樣的snRNA，但在RNA 轉(zhuǎn)錄后加工中都起到重要作用。

2 snRNA 在mRNA 前體剪接中的作用

剪接體是哺乳動(dòng)物mRNA 前體成熟過程中不可或缺的一部分，是由U1、U2、U4、U5、U6 snRNA 和超過150 多種蛋白組成的RNA 復(fù)合體[7]。在剪接體組裝和催化過程中，snRNA 與蛋白質(zhì)結(jié)合形成snRNP，與mRNA 前體底物上的特定序列結(jié)合，產(chǎn)生催化能力剪接體[8]。snRNA 在識(shí)別位點(diǎn)和催化剪接方面起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[9]，其中核心snRNA（U2、U5 和U6）參與底物定位和催化。剪接包括2 個(gè)連續(xù)的酯交換產(chǎn)生自由套索內(nèi)含子，并將連接2 個(gè)外顯子形成成熟的mRNA[10]。snRNAs 高度保守，50 個(gè)剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)分別與U1 和U2 snRNA 的堿基配對(duì)相互作用，但只是部分識(shí)別。隨后，U6 snRNA 在50 個(gè)剪接位點(diǎn)取代U1，形成一個(gè)與U2 snRNA 相互作用的并列堿基對(duì)，其將50 個(gè)剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)并置。最后，通過與U5 snRNA 中保守環(huán)的相互作用[11-12]，2 個(gè)外顯子被束縛并保持部分對(duì)齊（圖2）。除了結(jié)合和協(xié)調(diào)剪接位點(diǎn)和分支位點(diǎn)之外，snRNA 還涉及剪接反應(yīng)的分析[13-14]。誘變數(shù)據(jù)在U6 中定義了2 個(gè)催化關(guān)鍵域，進(jìn)化不變的ACAGAGA 盒和AGC 三聯(lián)體（圖2），其中突變導(dǎo)致剪接第一步或第二步的阻斷[11]。此外，對(duì)U6 分子內(nèi)干環(huán)（ISL）的核磁共振研究表明，在U6 ISL 這個(gè)位置能結(jié)合二價(jià)金屬離子[15]。總之，snRNA 加強(qiáng)了哺乳動(dòng)物剪接體中RNA 的催化作用。

3 主要snRNA 的基因表達(dá)

3.1 U1 snRNA U1 小 核RNA（U1 snRNA）作 為 人類細(xì)胞中最豐富的非編碼RNA 之一[16]，在mRNA 前體的剪接中起重要作用。U1 snRNA 在人體中的長(zhǎng)度為164 個(gè)核苷酸，其蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)在昆蟲和哺乳動(dòng)物中高度保守[17]。已知snRNA 的功能是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核中合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，檢索其他核心剪接體組件然后返回細(xì)胞核[18]，首要的U1 snRNA 的功能是其參與剪接細(xì)胞核中mRNA 前體的表達(dá)。在主要剪接體中，U1 snRNP 與U2、U4、U5 和U6 snRNP 以相同的化學(xué)計(jì)量存在。然而，U1 snRNP 在人類細(xì)胞中的豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他snRNP[19]。例如在HeLa 細(xì)胞中敲低U1 snRNA 基因的研究顯示，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后的核酶顯著減少，因此U1 snRNA 對(duì)細(xì)胞功能具有重要意義[20]。U1 snRNA 可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子和RNA 聚合酶II，得以維持端粒。U1 snRNA 的異?？蓪?dǎo)致mRNA 前體剪接中的缺陷，這被認(rèn)為是導(dǎo)致人類基因疾病主要的原因[21]。2013 年發(fā)現(xiàn)U1 snRNA 與U1 snRNPs 的細(xì)胞質(zhì)聚集在阿爾茨海默病中，但檢查其他的神經(jīng)退行性疾病中卻沒有，包括帕金森病和額顳葉變性，還證明了U1 snRNA 和U1 snRNPs 的細(xì)胞質(zhì)聚集能導(dǎo)致剪接體活性的喪失[22]，其改變了淀粉樣前體蛋白和β-淀粉樣蛋白的表達(dá)。淀粉樣前體蛋白含有產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白的區(qū)域，其聚集被認(rèn)為是引起阿爾茨海默病的主要因素。在過去的20 年中，U1 snRNA 的研究主要集中在其功能上，尤其是U1 snRNA 異常引起的神經(jīng)退行性疾病研究。除此之外，U1 snRNP 可以保護(hù)mRNA 前體免于通過早期切割和多聚腺苷酸化從內(nèi)含子中隱蔽的多腺苷酸化信號(hào)中過早終止[23]。使用更近端的替代多聚腺苷酸化位點(diǎn)，聚腺苷酸化產(chǎn)生更短的mRNA，已經(jīng)在激活的免疫、神經(jīng)元和癌細(xì)胞中得到證實(shí)[24]。以往的研究得出結(jié)論，替代性剪接和多聚腺苷酸化被癌細(xì)胞調(diào)節(jié)和利用，以促進(jìn)其生長(zhǎng)和存活[25]。Cheng Z 等[26]報(bào)道了U1 snRNA 可以調(diào)節(jié)癌癥基因表達(dá)。U1 snRNA 可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和癌細(xì)胞發(fā)生變化，這為snRNA 在基因治療中的研究提供了理論基礎(chǔ)。

3.2 U2 snRNA U2 小核RNA（U2 snRNA）在通過天然凝膠電泳檢測(cè)，在釀酒酵母和哺乳動(dòng)物提取物中均存在。U2 snRNA 具有與分支位點(diǎn)互補(bǔ)的順序?？筓2 snRNP 的抗體可以和U2 snRNA 及包括分支位點(diǎn)在內(nèi)的內(nèi)含子所形成的復(fù)合體發(fā)生免疫沉淀[27]。由于U1 和U2 snRNA 的滅活將阻止連接點(diǎn)的切斷和套索的形成，因此U1 和U2 snRNA 參與剪接反應(yīng)的起始階段。如在人類Ul snRNA 基因的第194 位點(diǎn)，僅在體外轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游處。進(jìn)一步分析U2 snRNA 基因在體外構(gòu)建的缺失突變體，才確定了這些序列在轉(zhuǎn)錄中的重要性。Utsunomia等[28]、Zeller 等[29]研究表明，非洲爪蟾卵母細(xì)胞與體細(xì)胞不同，可累積snRNP 的RNA 和蛋白質(zhì)成分（小核核糖核蛋白）顆粒不一致。這顯示出snRNP 蛋白相對(duì)缺乏snRNA 的積累。由此產(chǎn)生的過量snRNP 蛋白位于卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，微量注射snRNA 導(dǎo)致遷移，可使部分snRNP 蛋白進(jìn)入卵母細(xì)胞核[30]，該過程在體內(nèi)早期胚胎發(fā)育期間發(fā)生。哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞相對(duì)于snRNP 蛋白可能會(huì)耗盡snRNA 有2 個(gè)原因，一是snRNA 在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中不是主動(dòng)合成的，二是在卵母細(xì)胞中合成但是不穩(wěn)定[29]。當(dāng)微注射U2 snRNA 到卵母細(xì)胞中時(shí)它被積極地轉(zhuǎn)錄[31]，而再次微量注射U2 snRNA 到卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，它遷移到細(xì)胞核。因此，U2 snRNA 在snRNP 蛋白從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中的作用至關(guān)重要。

3.3 U6snRNA 在眾多snRNA 中，U6 是最小的小核RNA，大約長(zhǎng)100 個(gè)核苷酸。U6 snRNA 由RNA 聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄，而其他snRNA 都是由RNA 聚合酶Ⅱ催化轉(zhuǎn)錄的[32]。酵母Lsm 環(huán)的晶體結(jié)構(gòu)顯示RNA 不穿過Lsm 環(huán)的中心孔，而是通過連續(xù)的5'到3'末端序列結(jié)合在孔的圓周的一側(cè)[33-34]。在芽殖酵母中，54 個(gè)丙氨酸突變中只有2 個(gè)是致命的[35]，其中單丙氨酸突變被限制在SmD1（Arg88）和SmD2（Arg97）的RNA 結(jié)合位點(diǎn)，從而突出顯示它們的π-陽(yáng)離子與Sm 的第六和第七核堿基相互作用的獨(dú)特RNA 位點(diǎn)。在這里，誘變方法擴(kuò)展到酵母的Lsm 亞基U6 snRNP，剪接的過程中結(jié)合特異蛋白Prp24p 和一套7 個(gè)Lsm2-8p 蛋白來(lái)構(gòu)成U6 snRNP，在真核細(xì)胞中U6 snRNP 參與mRNA 前體的剪接[36]。任何一種酵母U6 的缺失或短暫消耗，Lsm 2-8 環(huán)就會(huì)導(dǎo)致U6 snRNA 的穩(wěn)態(tài)水平降低，表明Lsm 2-8 環(huán)可以影響U6 snRNA 的穩(wěn)定性[37]。廣泛的丙氨酸掃描聚焦于RNA 結(jié)合位點(diǎn)或Lsm 2-3-4-5-8 的亞基間界面，僅鑒定了一個(gè)致命性氨基酸（Lsm3-Arg69）和一個(gè)嚴(yán)重生長(zhǎng)缺陷的氨基酸（Lsm2-Arg63），而這2個(gè)精氨酸能結(jié)合U6 snRNA 的3'末端序列，并幫助U6 RNA 與剪切體其他成員相互作用，催化RNA 的剪接過程[38]。可見Lsm2-8 環(huán)的每個(gè)組分以及U6 snRNP 蛋白，都可以通過U6 snRNA 來(lái)表達(dá)。

4 snRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾

在真核生物中，snRNA 是轉(zhuǎn)錄后加工過程中RNA剪接體的主要成分，參與mRNA 前體的加工過程。已經(jīng)觀察到snRNA 含有大量的甲基化修飾和假尿苷化[39]，這些修飾與核仁小分子非編碼RNA（snoRNA）活性相關(guān)。snoRNA 對(duì)核糖體RNA 的甲基化和假尿嘧啶化修飾是通過堿基配對(duì)的方式來(lái)完成的，除了參與修飾rRNA 的加工處理外，還能指導(dǎo)snRNA、tRNA 和mRNA 的轉(zhuǎn)錄后修飾。據(jù)報(bào)道，snRNA 還可以誘導(dǎo)RNA 降解成寡聚腺苷酸[40]。這種調(diào)節(jié)snRNA 豐度的機(jī)制反過來(lái)又與RNA 剪接的變化有關(guān)。

5 snRNA 與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)

真核生物DNA 有嚴(yán)密的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，決定了真核基因表達(dá)與DNA 高級(jí)結(jié)構(gòu)變化之間的必然聯(lián)系。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA 單鏈斷裂和重接是由染色質(zhì)結(jié)構(gòu)決定的。在變形蟲有絲分裂間期，snRNA 通過細(xì)胞核相當(dāng)均勻地分布，并在核仁和核膜上發(fā)現(xiàn)有少量snRNA，而染色質(zhì)中的snRNA 略高于非染色質(zhì)區(qū)域[41]。直到有絲分裂末期，snRNA 才回到細(xì)胞核中?？梢?，snRNA 在真核細(xì)胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)中十分重要[42]，在維持或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的同時(shí)，參與調(diào)節(jié)其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。

6 小 結(jié)

在飛速發(fā)展的基因組學(xué)研究中，哺乳動(dòng)物基因組中大量的非編碼RNA 也是研究的重點(diǎn)問題。snRNA 作為非編碼RNA 之一，在哺乳動(dòng)物中參與mRNA 剪接過程并發(fā)揮關(guān)鍵作用。其中snRNA 在RNA 剪接過程有識(shí)別位點(diǎn)和催化的能力，它的基因表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，過表達(dá)可以破壞哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)平衡興奮性和抑制性神經(jīng)元受體蛋白質(zhì)，這為癌癥和神經(jīng)性相關(guān)疾病治療提供了強(qiáng)大的理論依據(jù)。哺乳動(dòng)物染色質(zhì)中的snRNA 在維持其復(fù)雜結(jié)構(gòu)起到重要作用，它與組蛋白和非組蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，這個(gè)過程有可能改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)。隨著對(duì)snRNA 更加深入的研究，snRNA 功能的新認(rèn)識(shí)將會(huì)使生物工程技術(shù)產(chǎn)生新突破。