RSSs的組成和特征對(duì)體細(xì)胞V(D)J基因重排效率的影響①

姚新生 (遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遵義 563003)

TCR/BCR的V(D) J基因體細(xì)胞重排主要依賴于重組激活基因(recombination-activating genes，RAG)酶等對(duì)重組信號(hào)序列(recombination signal sequences，RSSs)的識(shí)別、剪切和連接，RSSs由12 bp 或23 bp的非保守間隔子(spacer)、分離保守的7聚體(heptamer)和9聚體(nonamer)組成，分別稱為12RSSs(7-12-9)和23RSSs(9-23-7)，體內(nèi)V(D) J重組一般只發(fā)生在12RSSs～23RSSs間，即重組“12/23規(guī)則”[1-3]。

RSSs中，heptamer的保守或共識(shí)序列為CACAGTG,noname的保守或共識(shí)序列為ACAAA-AACC,V(D)J重組分為兩個(gè)階段,第一階段為DNA的識(shí)別和剪切，第二階段為DNA的分裂和結(jié)合,鈍的信號(hào)末端形成閉環(huán)鏈接，編碼末端按共價(jià)密封連接形成重排產(chǎn)物[3-5]。

RSSs側(cè)翼的基因片段是等效參與重組的，但多項(xiàng)研究證實(shí)，抗原選擇前的V(D)J重組并非隨機(jī)重排，保守的heptamer、noname序列、規(guī)則的12 bp/23 bp 間隔子長度、RSSs的近端/遠(yuǎn)端重組基因間距等與V(D)J取用頻率密切相關(guān)，形成V(D)J表達(dá)頻率差異的TCR/BCR組庫[6-11]。T、B細(xì)胞發(fā)展抗原與配體自我耐受選擇和克隆增生應(yīng)答導(dǎo)致V(D)J取用頻率進(jìn)一步改變[12-14]。

因體內(nèi)RSSs對(duì)TCR/BCR初始重排中V(D)J 取用影響極為復(fù)雜，現(xiàn)有研究多數(shù)集中于外周細(xì)胞系，體內(nèi)的影響效果和機(jī)制尚未闡明。外周TCR/BCR組庫V(D)J取用頻率和抗原的關(guān)系、初始重組導(dǎo)致V(D)J取用差異，導(dǎo)致外周TCR/BCR組庫的機(jī)制與意義研究結(jié)論存在偏差。

1 RSSs簡介

TCR/BCR的多樣性源于體胚系V(D)J基因在體細(xì)胞水平上的重排，重排的發(fā)生由2個(gè)重組基因上非編碼“特殊DNA序列”引導(dǎo)，此“引導(dǎo)序列”在脊椎動(dòng)物的進(jìn)化過程中高度保守，被命名為RSSs，每個(gè)RSSs由12 bp或23 bp的非保守間隔子分離保守的7聚體和9聚體組成，12RSSs組成為：heptamer-12 bp spacer-nonamer(7-12-9),23RSSs組成為：nonamer-23 bp spacer-heptamer(9-23-7)。

TCR/BCR重組基因片段中，各V基因片段的3′端和各J基因的5′端各進(jìn)化出1個(gè)RSSs，各D基因的5′端和3′端分別進(jìn)化出1個(gè)RSSs，以人TCR/BCR的V(D)J為例，進(jìn)化所形成的RSSs特征如下：IGHV-7-23-9、9-12-7-IGHD-7-12-9、9-23-7-IGHJ、IGKV-7-12-9、9-23-7-IGKJ、IGLV-7-23-9、9-12-7-IGLJ、TRBV-7-23-9、9-12-7-TRBD-7-23-9、9-12-7-TRBJ、TRAV-7-23-9、9-12-7-TRAJ、TRDV-7-23-9、9-12-7-TRDD-7-23-9、9-12-7-TRDJ、TRGV-7-23-9、9-12-7-TRGJ；D基因進(jìn)化中，人IGHD的兩端RSSs均為9-12-7，而TRBD兩端RSSs分別為9-12-7和7-23-9；V基因進(jìn)化中，IGKV的RSSs為7-12-9，其他V基因的RSSs均為7-23-9；J基因進(jìn)化中，IGKJ和IGHJ的RSSs為9-23-7，而其他J基因的RSSs均為9-12-7。此差異是如何進(jìn)化而來及其對(duì)重組的意義為何尚未闡明。同一個(gè)重組基因片段及其RSSs間可能存在不同的進(jìn)化模式，具有不同的進(jìn)化起源[15，16]。人TCRα和TCRδ的重組基因分散于同一條染色上的，Haynes等[17]研究發(fā)現(xiàn)TCRδ IG輕鏈片段具有相似的CDR2序列，提示其可能存在相似的進(jìn)化歷史。

RSSs中保守的heptamer序列組成為CACA-GTG,保守的noname序列為ACAAAAACC,規(guī)則的間隔子長度為12 bp或23 bp。但不同物種間和不同的V(D)J重組基因，其RSSs組成多數(shù)并非“保守”和“規(guī)則”，heptamer、nonamer、spacer的堿基序列在相同或不同的位點(diǎn)上多數(shù)存在1個(gè)以上堿基突變。同一物種V(D)J的多個(gè)等位基因上，其7-12-9或9-23-7組成存在差異，即1個(gè)個(gè)體的2條等位基因上V(D)J的RSSs可能是不同的，如人IGHJ5 基因片段目前發(fā)現(xiàn)2個(gè)等位基因：IGHJ5*01(登陸號(hào)：M25625)和IGHJ5*02(登陸號(hào)：X97051)，IGHJ5*01 RSSs組成為:GTTCTTTGT-21 bp spacer(CGGGGTCTGGCATTGTTGTCACAATGTG)，IGHJ5*02 RSSs組成為:GTTCTTGCC-22 bp spacer(TGGGGTCCTGGCATTGTTGTCACAATGTG)，V(D)J基因片段的多樣性和RSSs組成和特征的復(fù)雜性導(dǎo)致體內(nèi)系統(tǒng)研究RSSs對(duì)V(D)J重排效率影響較為困難。RSSs主要通過與RAG蛋白相互作用啟動(dòng)并調(diào)控V(D)J重排,在B和T細(xì)胞發(fā)育過程中，RAG1/2蛋白復(fù)合物在保守重組信號(hào)序列(RSS)處切割DNA，啟動(dòng)V(D)J重組，RAG1/2也能催化含有RSS的底物轉(zhuǎn)位鏈轉(zhuǎn)移至靶DNA，形成支鏈DNA中間產(chǎn)物(發(fā)夾形成或去除轉(zhuǎn)位的供體DNA)，重組遵循“12/23規(guī)則”和“B 12/23 規(guī)則”，以人IGH的V(D)J中RSSs為例，重組僅發(fā)生在D-J和V-D之間[1,2,18,19]。

RSSs進(jìn)化的組成特征中，heptamer總是直接相鄰V(D)J基因，2個(gè)重組基因片段的heptamer末端以頭對(duì)頭的方式連接形成精確的“信號(hào)接頭”，2個(gè)重組基因片段的編碼端形成不精確的“編碼接頭”。參與重組識(shí)別、剪輯、連接的蛋白主要有:RAG1、RAG2、異二聚體(heterodimer)Ku70-Ku80、DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase，DNA-PK)、DNA連接酶Ⅳ (DNA ligase Ⅳ，XRCC4)、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT) 等[15，16]。

RSSs調(diào)控重組過程的效率和機(jī)制研究多數(shù)在體外細(xì)胞系中進(jìn)行，通過分析RAG和RSSs的結(jié)合率、監(jiān)測RSSs斷裂末端及發(fā)夾形成等過程進(jìn)行分析[20，21]。

2 hepatamer與nonamer對(duì)重組V(D)J基因利用的影響

根據(jù)脊椎動(dòng)物進(jìn)化過程中hepatamer與nonamer的保守堿基序列組成以及目前所獲取的不同物種、不同重組基因、不同個(gè)體的等位基因組成和特征(均存在1個(gè)或以上的堿基突變)，可通過體外人工突變技術(shù)對(duì)部分堿基進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hepatamer與nonamer對(duì)重組中V、J的利用具有重要影響。

Hesse等[9]與Steen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在V(D)J重排過程中，heptamer對(duì)發(fā)夾的形成起關(guān)鍵作用，heptamer或?qū)eptamer整體突變將無法形成發(fā)夾。通過DNA回文序列上的heptamer組成分析發(fā)現(xiàn)，heptamer的7個(gè)堿基中，連接位點(diǎn)附近的3個(gè)核苷酸(GTG/CAC)在BCR和TCR基因中幾乎100%保守，其他位點(diǎn)的核苷酸僅63%～86%保守，可轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌塑账?，但并不?huì)失去底物活性，當(dāng)heptamer最后4個(gè)位點(diǎn)的堿基順序改變時(shí)，重組基因形成刻痕和發(fā)夾的效率降低至少2倍。當(dāng)保留heptamer，但用隨機(jī)序列替換nonamer，發(fā)現(xiàn)仍能檢測到刻痕和發(fā)夾形成，但DNA分裂顯著減少，提示準(zhǔn)確的切割(刻痕和發(fā)夾形成)主要依賴于heptamer，尤其是前3個(gè)位點(diǎn)的堿基組成。盡管研究發(fā)現(xiàn)heptamer前3個(gè)堿基突變后依然能與RAG1和RAG2結(jié)合，但刻痕和發(fā)夾形成明顯減少，推測heptamer的作用機(jī)制可能直接參與DSB形成的化學(xué)步驟，第1位和第3位堿基的突變反式形成減少[9，22]。Ramsden等[23]認(rèn)為heptamer作用效率依賴于nonamer，nonamer在重排的初始綁定后，heptamer才能發(fā)揮作用。

為詳細(xì)探討人heptamer的7個(gè)位點(diǎn)堿基組成及各位點(diǎn)堿基的作用和效果，Akamatsu等[24]研究提示，heptamer前3個(gè)堿基突變將降低重組的連接率,與重組位點(diǎn)相鄰的第1個(gè)堿基最為重要，但重組位點(diǎn)的特異性和前3個(gè)堿基較小，與野生型相比，當(dāng)heptamer 7-1G處突變后，體外實(shí)驗(yàn)無法檢測到重排;當(dāng)heptamer第2位點(diǎn)(7-2T)和第3位點(diǎn)(7-3G)突變，可檢測到重組水平分別為0.5%和0.6%;當(dāng)heptamer第5位點(diǎn)G殘基突變?yōu)镃(7-5C)時(shí)，重組水平下降至5.9%；當(dāng)heptame其余殘基突變時(shí)，重組水平下降至28.5%～52.0%[10]。Nagawa等[20]通過檢測5種heptamer突變體，發(fā)現(xiàn)heptamer中第1和第2位點(diǎn)的突變減少發(fā)夾的形成。heptamer的作用依賴于規(guī)則的12和23間隔子，Akira等[11]通過構(gòu)建包含合成RSSs的重組底物，并導(dǎo)入Pre-B細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)如果滿足12堿基和23堿基間隔子規(guī)則，兩組heptamer(CACTGTG)和(GGTTTGT)序列都能引起V(D)J連接，但當(dāng)heptamer序列中1個(gè)位點(diǎn)突變，將顯著減少重組的發(fā)生。

nonamer調(diào)控V(D)J重組的效果和方式同heptamer區(qū)別較大，Akamatsu等[10]發(fā)現(xiàn)，nonamer調(diào)控V(D)J重組，主要依賴于nonamer中的“A-rich core”，3個(gè)連續(xù)的A堿基是形成有效重組的必要條件，且兩側(cè)的核苷酸需要多個(gè)堿基才能滿足重組酶測量heptamer和nonamer距離的要求，以滿足12/23 bp間隔子規(guī)則啟動(dòng)重排，當(dāng)nonamer中心位點(diǎn)堿基發(fā)生突變，如9-4G(A變?yōu)镚)，重組頻率僅下降至對(duì)照組的27.3%，9-5C(A變?yōu)镃)時(shí)下降為10.4%，雙突變(9-3G/4G)時(shí)下降至19.3%，雙突變(9-6G/7G)時(shí)下降至26.0%。但當(dāng)9-4G/5C和9-5C/6G雙位點(diǎn)突變，未檢測到重組發(fā)生[10]。對(duì)于nonamer的“A-rich core”不同位點(diǎn)堿基的突變研究結(jié)果，Akamatsu等[10]認(rèn)為第5位點(diǎn)處A堿“A-rich core”最為重要。而Hesse等[9]認(rèn)為第6位點(diǎn)處A堿基最為重要。Steen等[22]發(fā)現(xiàn)保守的nonamer(ACAAAACC)序列中單個(gè)堿基位置的改變可能影響V(D)J重組中DSB水平，其中第5個(gè)位點(diǎn)突變只對(duì)DSB有中等影響,第6個(gè)位置突變會(huì)顯著降低突變反式DSB水平，結(jié)果和Hesse等[22]一致。nonamer側(cè)翼堿基位點(diǎn)突變對(duì)V(D)J重組影響的研究中發(fā)現(xiàn)，C突變?yōu)锳(9-2A)時(shí)，重組頻率降低至對(duì)照水平的2.7%；C突變?yōu)門(9-2T)時(shí)，頻率下降至12.9%；C突變?yōu)镚(9-2G)時(shí)，頻率保持為61.3%；當(dāng)2個(gè)C殘基均改變?yōu)镚(9-8G/9G)時(shí)，重組頻率為65%；當(dāng)兩個(gè)C殘基都變?yōu)锳(9-8A9A)時(shí)，頻率下降至0.1%以下。提示以上側(cè)翼C堿基可能在重組酶測量heptamer和nonamer間距離時(shí)起重要作用[10，24，25]。同時(shí)，nonamer除保守位置外的其他位點(diǎn)突變可導(dǎo)致重組DNA分裂水平降低[9，26]。

在heptamer和noname調(diào)控V(D)J重組的研究中機(jī)制，重組主要來源于其與RAG間的相互作用。Jessica等[27]發(fā)現(xiàn)只有RAG1/2最初組裝在單個(gè)RSS上的復(fù)合體才能導(dǎo)致12RSS-23RSS組合，激活分裂；Nagawa等[20]發(fā)現(xiàn)nonamer突變體可能通過DNase I 影響其和RAG1相互作用，部分nonamer突變能清除RSS-RAG1的相互作用；Agrawal等[28]發(fā)現(xiàn)RAG1與noname中的特定堿基相互作用，且相互作用延伸至相鄰的間隔子，但未闡明RAG2和RSS存在交互作用，RAG1對(duì)heptamer的保護(hù)是局部的，只有在12RSS和23RSS間形成突觸復(fù)合體后，才能穩(wěn)定地與RAG蛋白相互作用。Ramsden等[23]認(rèn)為RSS中單個(gè)成分具有不同功能，nonamer在RAG蛋白的結(jié)合中起重要作用，而有效的刻痕和發(fā)夾形成則需要heptamer序列，heptamer對(duì)分裂的化學(xué)步驟至關(guān)重要，在信號(hào)編碼邊界周圍裂解DNA是啟動(dòng)V(D)J組合的必要條件。Difilippantonio等[29]發(fā)現(xiàn)RAG1蛋白中的Hin結(jié)構(gòu)域與RSS的nonamer相互作用，參與V(D)J重組。

Hesse等[9]利用質(zhì)粒將DNA導(dǎo)入Pre-B細(xì)胞，證明重組獨(dú)立于任何特異染色體背景，包含heptamer-nonamer的84 bp和42 bp側(cè)翼鼠基因片段均能發(fā)生重組，提示V(D)J重組對(duì)位點(diǎn)的拓?fù)渑帕邢鄬?duì)不敏感。Hiroshi等[30]發(fā)現(xiàn)CpG甲基化對(duì)RAG1/RAG2和RSS的反應(yīng)產(chǎn)生影響，直接和間接控制V(D)J分裂。

3 12/23 spacer長度和序列對(duì)重組V(D)J基因利用的影響

“12/23 規(guī)則”是V(D)J重組的必要條件，不同物種、不同重組基因、不同個(gè)體等位基因研究發(fā)現(xiàn)，RSSs的12 bp或23 bp長度存在至少1個(gè)堿基突變，而spacer的堿基序列存在不同的組成，12/23 spacer長度和序列調(diào)控V(D)J重組的效率和機(jī)制已被廣泛研究。

12和23 間隔子的長度改變對(duì)V(D)J重組的影響研究中，Akamatsu等[10]發(fā)現(xiàn)在11 bp的RSSs中，重組頻率下降至野生型的7.7%，在12 bp RSSs中加入1個(gè)C堿基(13RSSs)，重組頻率為11.0%，當(dāng)添加2個(gè)C堿基(14RSSs)時(shí)，未能檢測到重組的發(fā)生，提示RSSs長度在重組效率中關(guān)鍵作用。Akira等[11]發(fā)現(xiàn)23 bp和12 bp2種間隔子長度(21 bp/22 bp/23 bp /24 bp與11 bp/12 bp/13 bp)的組合變化將減少重組的發(fā)生；Steen等[22]發(fā)現(xiàn) 23 間隔子長度中，1個(gè)核苷酸(23 bp+1 bp)改變，in cis和in trans均適度地減少了DSB的形成；如果改變間隔子長度超過1個(gè)核苷酸(23 bp-2 bp和23 bp-3 bp)，將嚴(yán)重減少和突變反式分裂；如果12 bp和23 bp同時(shí)改變(12 bp-3bp/23 bp-3 bp)，將無法檢測到DSB的發(fā)生；如果將heptamer(H-6G、H-7T)、間隔子加1 bp和nonamer(N-5G)進(jìn)行組合改變，突變反式的高效重組中DSB的形成將嚴(yán)重減少。Ramsden等[23]發(fā)現(xiàn)nonamer距離heptamer 18 bp或29 bp時(shí)，將干擾heptamer分裂，無nonamer情況下可觀察到刻痕，但發(fā)夾形成減少，nonamer和heptame間隔34 bp時(shí)，重排中兩者依舊存在協(xié)作關(guān)系。

12/23 spacer序列的改變對(duì)V(D)J的影響較為復(fù)雜，F(xiàn)anning等[31]通過改變IGKV的12RSSs(CTACAGACTGGA)的第5位堿基，將其由A變?yōu)镃(CTACCGACTGGA)時(shí)，與其重組的IGKJ 23RSSs(GTAGTACTCCACTGTCTGGCTGT)不變，突變的近端RSSs使用頻率從54%降低至37%,提示RSSs間隔序列影響V(D)J的重組較率。Montalbano等[32]認(rèn)為間隔子序列在RSS的重組效率中起重要作用，主要發(fā)生在RAG結(jié)合RSSs之后，間隔序列中的單堿基突變能顯著影響其重組效率，通過研究非常規(guī)的RSSs(12RSSs第6、11、12位分別為ATCG時(shí)，23RSSs第3、5、8、11、21位分別為GTTGT時(shí))發(fā)現(xiàn)，與保守RSSs相比,其結(jié)合RAG蛋白的效率降低2倍。

Larijani等[33]發(fā)現(xiàn)間隔子中的某些位置存在適度守恒，間隔子序列變化可能影響重組頻率改變?yōu)?倍以上；Steen等[22]發(fā)現(xiàn)12RSSs 3種突變(12-1T、12-1A和12-1G)將會(huì)取消順突變重組中DSB形成。Akira等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)12RSSs的間隔子被轉(zhuǎn)換為人工序列時(shí)(GATCGATCGATCS)，重組效率不變，間隔子序列影響重組基因頻率的作用有限。

Feeney等[34]認(rèn)為，體內(nèi)間隔序列中發(fā)生自然變異可能有助于體內(nèi)觀察人V基因的非隨機(jī)使用，人V基因間隔子序列中隨機(jī)產(chǎn)生的變異導(dǎo)致其重組效率降低；Nadel等[8]認(rèn)為間隔子序列是引發(fā)重排頻率的決定因素，體外不同人V、K基因片段重組率可能與其在體內(nèi)的Pre-B細(xì)胞中的重排頻率相關(guān)。Posnett等[35]直接根據(jù)外周V基因家族相對(duì)應(yīng)T細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn)，人TRBV3的2個(gè)等位基因在RSSs的23 bp spacer間隔區(qū)內(nèi)的1個(gè)單核苷酸位點(diǎn)存在“C/T”差異,導(dǎo)致外周血中TRBV3細(xì)胞變化，TRBV3等位基因?yàn)榧兒献印癟”個(gè)體，TRBV3細(xì)胞數(shù)為8.1%，雜合子個(gè)體(C/T)TRBV3細(xì)胞占比為4.7%，等位基因?yàn)榧兒献?“C”個(gè)體平均TRBV3細(xì)胞數(shù)為1.2%,提示間隔區(qū)序列改變影響重組效率。在12和23間隔子調(diào)控的機(jī)制上。Joydeep等[36]認(rèn)為RAG蛋白檢測V(D)J分裂的步驟，初始RAG結(jié)合可能發(fā)生在含有12 bp或23 bp間隔子的RSSs上。

4 RSSs間距離對(duì)重組V(D)J基因利用的影響

重組V(D)J基因片段分散于染色體，重組的2個(gè)基因片段來源于同一條染色體上不同位置，重組的首要條件為RAG對(duì)單RSSs的識(shí)別后，按“12/23”規(guī)則尋找配對(duì)的目標(biāo)RSSs基因片段。研究證實(shí)參與重組基因片段近端和遠(yuǎn)端配對(duì)的基因表現(xiàn)出不同的重組效率[37-39]。

Yancopoulos等[7]在前B細(xì)胞系的研究體系中發(fā)現(xiàn)大多數(shù)IGHJ近端的IGHV基因片段優(yōu)先用于V(D)J重排,表明IGHV基因片段的重組頻率受其在染色體上位置影響，在前B細(xì)胞(初始庫)中表達(dá)與成熟B細(xì)胞群具有顯著差異；Perlmutter等[40]發(fā)現(xiàn)胎兒雜交瘤系來源的Pre-B細(xì)胞選擇到DJH重排的IGHV基因片段具有偏向性，多數(shù)IGHJ近端的IGHV基因片段被優(yōu)先使用。Reth等[41]發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞系初始HD和HJ重排使用了更多的3′D段，但一旦形成1個(gè)HD-HJ復(fù)合物(DJ替代重排)后,則優(yōu)先使用最多的5′D段。

Feeney等[42]發(fā)現(xiàn)V(D)J重排中，遠(yuǎn)端區(qū)域V基因重排頻率較低，86個(gè)cDNA序列中只有2個(gè)來自遠(yuǎn)端，51個(gè)非有效性DNA序列中3個(gè)來自遠(yuǎn)端區(qū)域，但I(xiàn)GKJ近端和遠(yuǎn)端基因片段重排無顯著區(qū)別；Malynn等[43]發(fā)現(xiàn)在胎兒發(fā)育早期，IGHV序列具有明顯偏差，且可持續(xù)至出生后5～7 d。成人骨髓B細(xì)胞初始庫中，IGHJ近端的IGHV基因片段存在表達(dá)優(yōu)勢，提示成人脾臟B細(xì)胞IGHV差異主要來源于初始重排時(shí)的選擇，而不是重排后表達(dá)頻率改變?cè)斐傻牟町?；Raaphorst等[44]發(fā)現(xiàn)胎兒胸腺和肝臟、骨髓、脾臟和臍血中TCRβ CDR3區(qū)域中，TRBJ2.1具有較高的利用頻率，可能與其靠近D或V有關(guān)。

5 展望

TCR/BCR的多樣性是適應(yīng)性免疫應(yīng)答研究的核心，V(D)J基因片段的表達(dá)頻率與自身耐受的選擇及克隆增生的應(yīng)答關(guān)系備受關(guān)注，但初始TCR/BCR組庫中，V(D)J參與重組的取用差異較為復(fù)雜，進(jìn)展較少甚至被忽略，導(dǎo)致外周TCR/BCR研究V(D)J取用的意義和機(jī)制研究出現(xiàn)偏差。

隨著高通量測序?qū)w內(nèi)T/B細(xì)胞組庫(CDR3受體庫)解析的進(jìn)展，近年來，本課題組對(duì)比分析人和鼠中樞及外周T/B細(xì)胞CDR3組庫，對(duì)功能性基因、假基因、RSSs等參與重排的效率和取用原則進(jìn)行了初步探討，可為體內(nèi)研究V(D)J重組提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和新的技術(shù)[45-47]。目前，關(guān)于RSSs和V(D)J的進(jìn)化、個(gè)體等位基因的多樣性、重排調(diào)控的機(jī)制及初始庫與生理/病理應(yīng)答的關(guān)系等的研究較少，有待進(jìn)一步研究。