酵母多糖作用HaCaT細胞后對Dectin-1、TLR2及IL-6、TNF-α表達的影響

羅 亭 景海霞 王 恒 段德鑒 李 敏

(十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)皮膚科，十堰 442000)

目前在臨床上皮膚真菌感染的發(fā)病率越來越高，天然免疫作為機體抵御病原體入侵的第一道防線，對于皮膚真菌感染具有重要作用。當真菌感染機體時，天然免疫細胞上的模式識別受體(PRRs)識別入侵的真菌，與真菌成分(如酵母多糖)病原相關分子模式(PAMPs)結合，釋放炎癥因子TNF-α、IL-6等，起到抗真菌感染的作用[1]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRRs主要有Toll樣受體(TLRs)、C型凝集素受體(CLRs)和Nod樣受體[2,3]。其中與真菌感染相關的PRRs主要有TLRs和CLRs，其中Dectin-1和TLR2關系最為密切[4-6]。

酵母多糖是釀酒酵母的細胞壁制劑，由β-葡聚糖、甘露聚糖和幾丁質(zhì)組成，富含真菌的細胞壁成分，能識別包括Dectin-1和TLR2在內(nèi)的多種配體，可用來模擬體外真菌感染，用于真菌的免疫學研究[7-9]。角質(zhì)形成細胞是表皮的主要結構，具有免疫功能，還存在多種PRRs，可以識別PAMPs，啟動固有免疫，分泌或表達細胞因子、抗菌肽等，在皮膚真菌感染的天然免疫機制中扮演著重要角色。因此本文擬選用HaCaT細胞(人永生化角質(zhì)形成細胞，具有與角質(zhì)形成細胞相同的特點)，用不同濃度的酵母多糖處理HaCaT細胞，檢測細胞中TLR2和Dectin-1的mRNA、蛋白的表達以及TNF-α、IL-6的濃度變化，對酵母多糖啟動機體的天然免疫識別機制進行研究,使構建皮膚真菌感染的細胞模型成為可能，也為皮膚淺表真菌感染的天然免疫機制研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞來源 HaCaT細胞購自上海美軒生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 酵母多糖購自Invivogen公司；熒光定量PCR相關試劑購自ToYoBo公司；TLR2、Dectin-1、β-actin引物由天一輝遠公司合成(見表1)；PE-Dectin-1抗體購自Biolegend公司；PE-TLR2抗體、PE標記的鼠IgG2a同型對照購自eBioscience公司；IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購自達科為公司；濃縮型正常山羊血清、熒光標記羊抗兔IgG、熒光標記羊抗小鼠IgG購自武漢博士德公司；DAPI購自碧云天公司；Dectin-1一抗購自NOVUS公司；TLR2一抗購自Santa公司。

1.1.3主要儀器 細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo electron公司)，超凈工作臺(蘇州集團安泰空氣技術有限公司，型號SW-CJ-1FD)，實時熒光定量PCR儀(ABI公司，型號Quant Studin 6),PCR儀(東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號EDC-810),流式細胞儀(BD Biosciences，型號FACS Calibur)，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Olympus，日本)，凝膠成像儀(BioRad公司，USA)，自動酶標儀(Thermo scientific，USA)。

1.2方法

1.2.1HaCaT細胞培養(yǎng)及處理 復蘇凍存的HaCaT細胞，常規(guī)方法培養(yǎng)。待細胞生長到70%-80%，消化收集HaCaT細胞，接種到6孔板上，1×105個/孔，細胞長滿至約60%～70%孔底，分別進行如下處理：①加入酵母多糖混懸液使培養(yǎng)孔內(nèi)酵母多糖終濃度分別為0、10、100 μg/ml(濃度設置參照文獻[8,9,10],37℃培養(yǎng)24 h，吸取上清，置于EP管中，在保存-20℃，然后收集3組處理過的細胞提取總RNA(按試劑盒說明書操作)；②加入酵母多糖混懸液濃度同①，培養(yǎng)24 h，進行流式細胞術檢測；③加入100 μg/ml酵母多糖混懸液，制作HaCaT細胞爬片，作用24 h。以上實驗均獨立重復3次。

1.2.2TLR2和Dectin-1的qPCR檢測 采用TRIzol法提取各分組細胞的總RNA后，參照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄合成單鏈cDNA，再以cDNA為模板，參照實時熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR擴增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算各組細胞中TLR2和Dectin-1 mRNA的表達水平，引物如表1。逆轉錄反應體系：RNA 2.2506 ng，Oligo(dT)18(10 μmol/L) 2 μl，dNTP(2.5 mmol/L)4 μl，5×Hiscript Buffer 4 μl, Hiscript Reverse Transcriptase 1 μl,Ribonuclease Inhibitor 0.5 μl,ddH2O (Rnase free)加至20 μl，反應條件：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min，4℃ 10 min；實時熒光定量PCR檢測反應體系：cDNA (5倍稀釋)4 μl，上游引物(10 μmol/L)0.4 μl，下游引物(10 μmol/L)0.4 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl,50×ROX Reference Dye 20.4 μl，H2O 4.8 μl,反應條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。繪制溶解曲線。

表1 PCR引物的序列以及擴增片段長度

1.2.3流式細胞術檢測TLR2和Dectin-1 ①用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞，終止消化后收集HaCaT細胞，1 500 r/min離心5 min，去上清，加PBS重懸；②4℃條件下2 000 r/min離心2 min，含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS清滌2遍；③流式小管分別添加相應抗體，4℃避光孵育30 min；④4℃條件下2 000 r/min離心2 min，以含0.5% BSA的PBS清滌2遍；⑤以含0.5% BSA的PBS 0.5ml重懸后流式細胞儀檢測分析，檢測各組細胞的平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)。

1.2.4免疫熒光實驗檢測TLR2和Dectin-1的表達部位 ①用預溫的PBS將已爬好的細胞玻片浸洗3次，3 min/次；②固定爬片15 min(4%的多聚甲醛)，PBS洗清玻片3次，3 min/次；③0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min;④用PBS浸洗玻片3次，3 min/次，吸干后，滴正常山羊血清，室溫封閉30 min；⑤吸掉玻片上的封閉液，滴加足量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；⑥加熒光二抗：PBST浸洗爬片3次，3 min/次，吸干爬片上的液體后，滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min；⑦復染核：加DAPI在黑暗中孵育5 min，對標本進行染核，PBST洗滌玻片4次，每次5 min，洗去DAPI；⑧將爬片上的液體吸干，用封片液密封，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5ELISA檢測炎癥因子TNF-α、IL-6的表達 將收集的上清液稀釋10倍，按ELISA試劑盒說明書的步驟操作，檢測TNF-α、IL-6的濃度變化。

2 結果

2.1酵母多糖對HaCaT細胞TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達的影響 各濃度酵母多糖在不同程度上影響HaCaT細胞TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA的表達，隨著酵母多糖濃度升高，TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達量升高，其中10 μg/ml組TLR2 mRNA表達明顯高于對照組(t=12.62，P<0.01)，Dectin-1 mRNA表達亦顯著升高(t=8.223，P<0.01),比TLR2 mRNA的表達更明顯。100 μg/ml組TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA均較10 μg/ml組表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.609,P<0.05和t=3.069,P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度酵母多糖對HaCaT細胞的TLR2 mRNA和Dectin-1 mRNA表達的影響

2.2酵母多糖作用HaCaT細胞后對TLR2和Dectin-1蛋白表達的影響 經(jīng)過處理的HaCaT細胞，流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)其表面的Dectin-1和TLR2 MFI表達隨著酵母多糖濃度升高逐漸升高，100 μg/ml組最為顯著，明顯高于對照組，有統(tǒng)計學意義(t=36.02,P<0.01和t=45.6，P<0.01)，見圖2，表2。

表2 酵母多糖對HaCaT細胞表達TLR2和Dectin-1蛋白MFI的影響

圖2 酵母多糖誘導HaCaT細胞后TLR2和Dectin-1蛋白的影響

2.3免疫熒光檢測酵母多糖作用HaCaT細胞后TLR2和Dectin-1蛋白的核內(nèi)轉移情況 根據(jù)采集的圖像發(fā)現(xiàn)TLR2和Dectin-1蛋白在對照組中均在胞質(zhì)表達，幾乎看不到胞核內(nèi)有熒光表達，但是在加入酵母多糖誘導后發(fā)現(xiàn)TLR2和Dectin-1蛋白在胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有表達，見圖3。

圖3 各組細胞中TLR2和Dectin-1的免疫熒光染色(×400)

2.4酵母多糖作用HaCaT細胞后炎癥因子TNF-α、IL-6的表達 酵母多糖處理HaCaT細胞后，發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6的表達量均增高，其中10 μg/ml組與對照組相比TNF-α、IL-6的濃度顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.05,P<0.01和t=58.95,P<0.01)，但與10 μg/ml組與100 μg/ml組相比TNF-α的濃度差異無統(tǒng)計學意義，10 μg/ml組和100 μg/ml組相比IL-6的濃度有差別，有統(tǒng)計學意義(t=6.676,P<0.05)，與酵母多糖濃度呈正相關，見表3。

表3 不同濃度酵母多糖作用HaCaT細胞炎癥因子TNF-α、IL-6的濃度

3 討論

本文通過體外研究探討酵母多糖對HaCaT細胞Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白水平表達的影響以及TNF-α、IL-6濃度的變化。發(fā)現(xiàn)酵母多糖作用于HaCaT細胞后具有上調(diào)Dectin-1、TLR2 mRNA和蛋白表達的作用，與對照組相比炎癥細胞因子TNF-α、IL-6的濃度也增高，并且都與濃度呈正相關。說明酵母多糖可識別HaCaT細胞的PRRs,激發(fā)天然免疫識別過程。

通過查閱以往的文獻發(fā)現(xiàn)，Dillon等[8]將酵母多糖作用于巨噬細胞和樹突狀細胞后發(fā)現(xiàn)TLR2、Dectin-1 mRNA和蛋白的表達水平增高，還可激活下游的MyD88和Syk信號通路，最終導致核轉錄因子活性的增強并釋放大量的炎癥細胞因子TNF-α，放大炎癥反應，共同參與酵母多糖的免疫識別過程。毛亞男等[10]用酵母多糖刺激小鼠巨噬細胞，在早期發(fā)現(xiàn)，酵母多糖可顯著上調(diào)受體Deetin-1、TLR2 mRNA和蛋白的表達水平，促進炎癥細胞因子TNF-α的釋放，最終誘導炎癥反應的發(fā)生。Wu等[9]用酵母多糖處理永生化人角膜上皮細胞，發(fā)現(xiàn)酵母多糖可激活TLR2下游的一系列炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-8)和核轉錄因子κB的表達，使用TLR2阻斷劑后，上述炎癥因子的表達均降低。這些研究均表明酵母多糖可激活機體的天然免疫過程，可體外模擬皮膚真菌感染模型，與本研究具有一致性。但是Dillon的研究也表明，在用酵母多糖刺激樹突狀細胞后，炎癥因子IL-6的表達降低，甚至沒有表達，這一結果與本文不一致，我們推測可能與使用的細胞模型和實驗條件不同有關。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，酵母多糖可致Dectin-1、TLR2蛋白的表達部位發(fā)生變化，對照組中其表達部位主要在胞質(zhì)，但是在經(jīng)過酵母多糖處理后發(fā)現(xiàn)Dectin-1、TLR2蛋白在胞質(zhì)和胞核中均有表達，其中蛋白TLR2胞核表達的現(xiàn)象較Dectin-1明顯。Reuven等[11]發(fā)現(xiàn)TLRs在胞外區(qū)識別PAMPs后，胞漿區(qū)的TIR結構域激活并介導信號轉導，通過激活MyD88，降解NF-κB抑制蛋白α，使得釋放NF-κB轉位入核，從而啟動相應的基因轉錄[12,13]。我們推測可能是酵母多糖誘導了Dectin-1、TLR2蛋白在細胞核內(nèi)的合成，也可能是在酵母多糖的作用下，Dectin-1和TLR2通過激活下游的Syk和MyD88信號通路，促進了核轉錄因子NF-κB的活化，介導靶基因的核內(nèi)轉移。

綜上所述，酵母多糖對HaCaT細胞表達Dectin-1、TLR2及炎癥因子TNF-α、IL-6有促進的作用，可以啟動機體的天然免疫，使皮膚真菌感染體外模型的構建成為可能，也為我們以后皮膚淺表真菌感染的天然免疫機制研究提供一定的方便，并且對于抗真菌藥物的研究也打下基礎。但是本文在信號通路的研究上有一定的不足，酵母多糖具體通過何種機制調(diào)控TLR2和Dectin-1及TNF-α、IL-6，還有待進一步論證，我們將在接下來的研究中進行更加深入的探討。