芬太尼對2型糖尿病大鼠心臟的保護作用及對蛋白激酶D和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的調(diào)節(jié)作用①

王麗萍 季中華 任 莉 王 輝 芮海濤 曾路路 (暨南大學(xué)附屬珠海醫(yī)院麻醉科，珠海 519000)

2 型糖尿病 (type 2 diabetes mellitus,T2D) 是一種以胰島素抵抗并伴有胰島 β 細(xì)胞功能缺陷所致的胰島素分泌不足而引起的以血糖水平升高、血脂異常為特征的代謝性疾病[1]。糖尿病患者易發(fā)生多種心血管并發(fā)癥，包括冠心病、心肌肥厚和心力衰竭等[2]。糖尿病性心肌病是糖尿病患者死亡的主要原因，全世界流行病患者中新診斷的糖尿病性心肌病病例數(shù)逐漸上升[3]。芬太尼為阿片受體激動劑，屬強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，臨床上常用于各種疼痛及外科、婦科等手術(shù)后和手術(shù)過程中的鎮(zhèn)痛。研究表明芬太尼能夠影響心肌收縮功能，但其對T2D大鼠的作用尚不清楚[4]。蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)是鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin dependent protein kinase，CAMK)組的絲氨酸/蘇氨酸激酶的最新成員，參與多種細(xì)胞生物過程調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞存活、遷移、分化和增殖[5]。已有研究證明PKD在心血管疾病的發(fā)生中起重要作用[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是參與細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的細(xì)胞器，其應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一[7]。本文主要探討芬太尼對T2D大鼠心臟的作用及其及對蛋白激酶D和ER應(yīng)激激活的調(diào)節(jié)作用，以期為糖尿病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級SD大鼠120只，體質(zhì)量(190±20)g，購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。溫度、濕度分別控制在25℃、50%左右，大鼠在實驗前給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2試劑 普通飼料和高脂高糖飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；鏈脲佐菌素(上海艾研生物科技有限公司)；RIPA裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司)；BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司)；caspase-3抗體、Bcl-2抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；Bax抗體(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；PKD抗體(上海信裕生物技術(shù)有限公司)；GRP78抗體(上海優(yōu)寧維生物科技有限公司)；IL-6、IL-18、IL-1β、TNF-α、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cardiactroponin Ⅰ，cTnⅠ)和肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB)ELISA試劑盒(上海聯(lián)碩生物刻科技有限公司)；FINS ELISA 試劑盒(蘇州鴻信生物技術(shù)有限公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(大連美輪生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3儀器 HCC400全自動生化分析儀(山東國康生物科技有限公司)；MRBP鼠無創(chuàng)血壓計(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國碧迪醫(yī)療器械有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及給藥 隨機選擇20只大鼠作為對照組，喂養(yǎng)正常飼料，剩余100只大鼠喂養(yǎng)高脂飼料。4周后喂養(yǎng)高脂飼料的大鼠腹腔注射35 mg/kg的鏈脲佐菌素(STZ)，對照組大鼠注射等量生理鹽水。1周后測定尾靜脈空腹血糖(FBG)，大鼠血糖水平高于11.1 mmol/L即為糖尿病模型構(gòu)建成功。8周后，芬太尼低、中、高劑量組大鼠分別每天注射0.5、1.0、2.0 μg/kg的芬太尼，陽性藥物對照組大鼠每天灌胃給予75 mg/kg二甲雙胍，對照組和模型組分別注射等量生理鹽水，連續(xù)2周。大鼠禁食1晚后，頸靜脈取血，麻醉后處死，摘取心臟[8,9]。

1.2.2血清FBG、TG及TC含量測定 采集血液離心，將血清置于全自動化學(xué)分析儀檢測血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)BG)、總膽固醇(total cholesterol，TG)及三酰甘油(triglycerides，TC)含量。

1.2.3大鼠HR、SBP及DBP測定 給藥最后1 d晚上，用MRBP鼠無創(chuàng)血壓計測量心率(heart rate，HR)、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)及舒張壓(diastolicblood pressure，DBP)。

1.2.4HE染色觀察心臟損傷 將心臟組織置于4%甲醛固定后，乙醇梯度濃度脫水，石蠟包埋切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇覆水、蘇木精染色、乙酸分化、返藍(lán)、伊紅染色后，脫水固定裝片，400倍顯微鏡下觀察。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡情況 培養(yǎng)48 h后，胰酶消化各組心肌細(xì)胞，離心，以1×106個/ml的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin-V-FITC和5 μl PI，置于黑暗房間孵化15 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot檢測心肌細(xì)胞中Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、PKD和GRP78蛋白表達(dá)情況 RIPA裂解液提取各組心肌細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗(Bax 1∶1 000、Bcl-2 1∶1 000、Cleaved caspase-3 1∶1 000、PKD 1∶500、GRP78 1∶1 000)4℃封閉過夜后，加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，ECL曝光。

1.2.7ELISA檢測血樣中FINS、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量和心肌細(xì)胞中cTnⅠ和CK-MB含量 按照各ELISA試劑盒說明書操作，檢測血樣中胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)、炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量及心肌細(xì)胞中心肌損傷標(biāo)記物cTnⅠ和CK-MB含量。

2 結(jié)果

2.1T2D大鼠模型構(gòu)建成功 如表1所示，對照組大鼠造模前后24 h血糖含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義，模型組大鼠造模24 h后血糖含量顯著高于造模前(P<0.01)，表明100只大鼠T2D模型構(gòu)建成功。

表1 各組大鼠造模前后 24 h血糖含量

2.2芬太尼改善T2D大鼠糖脂代謝 與對照組相比，模型組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量明顯升高(P<0.01)，表明T2D大鼠出現(xiàn)糖脂代謝異常；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量變化無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量明顯降低(P<0.05)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠血液中FBG、TG、TC和FINS含量顯著降低(P<0.01)，說明芬太尼同二甲雙胍都能夠改善T2D大鼠的糖脂代謝，見圖1。

圖1 各組大鼠糖脂代謝情況

2.3芬太尼改善T2D大鼠心臟功能 與對照組相比，模型組大鼠SBP和DBP變化無統(tǒng)計學(xué)意義，HR明顯升高(P<0.05)，表明T2D大鼠心臟功能減弱；與模型組相比，芬太尼低、中劑量組大鼠HR、SBP和DBP變化無統(tǒng)計學(xué)意義，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠SBP和DBP變化無統(tǒng)計學(xué)意義， HR明顯降低(P<0.05)，表明芬太尼同二甲雙胍都能夠改善T2D大鼠的心臟功能，見圖2。

圖2 MRBP鼠無創(chuàng)血壓計測量各組大鼠HR、SBP和DBP含量

2.4芬太尼減輕T2D大鼠心肌損傷 通過HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)致密整齊，心肌纖維完整，無心肌纖維斷裂；模型組與芬太尼低劑量組大鼠心肌組織出現(xiàn)細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，大量心肌纖維斷裂，細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重；芬太尼中、高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌組織細(xì)胞排列紊亂程度依次減輕，心肌纖維斷裂依次減少，細(xì)胞變性壞死程度依次減輕(圖3A)。 ELISA檢測心肌細(xì)胞中心損傷標(biāo)記物表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞中CK-MB和cTnⅠ含量明顯提高(P<0.01，圖3B)，表明T2D大鼠心肌受損；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細(xì)胞中CK-MB和cTnⅠ含量無明顯變化，中劑量組大鼠心肌細(xì)胞中CK-MB和cTnⅠ含量明顯降低(P<0.05，圖3B)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細(xì)胞中CK-MB和cTnⅠ含量顯著降低(P<0.01，圖3B)，表明芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌損傷。流式細(xì)胞術(shù)檢測心肌細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01，圖3C)，表明T2D誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05，圖3C)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01，圖3C)，表明芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌細(xì)胞凋亡。Western blot檢測心肌細(xì)胞中Bax、 Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平可知，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01，圖3D)，提示T2D大鼠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組大鼠心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05，圖3D)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01，圖3D)，提示芬太尼同二甲雙胍均能減輕T2D大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

圖3 各組大鼠心肌損傷情況

2.5芬太尼減輕T2D大鼠炎癥反應(yīng) ELISA檢測血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組大鼠血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量明顯升高(P<0.01)，表明T2D引起大鼠炎癥反應(yīng)；與模型組相比，芬太尼低劑量組大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義，中劑量組大鼠血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量明顯降低(P<0.05)，高劑量組和陽性藥物對照組大鼠血液中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量顯著降低(P<0.01)，表明芬太尼同二甲雙胍均可減輕T2D大鼠的炎癥反應(yīng)，見圖4。

圖4 ELISA檢測血液中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β的含量

2.6芬太尼抑制T2D大鼠PKD和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活 Western blot檢測各組大鼠心肌細(xì)胞中PKD和GRP78蛋白表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，提示T2D大鼠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞PKD和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活；與模型組相比，芬太尼低劑量組和陽性藥物對照組大鼠心肌細(xì)胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達(dá)無明顯變化，芬太尼中劑量組大鼠心肌細(xì)胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，高劑量組大鼠心肌細(xì)胞中磷酸化PKD和GRP78蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)，提示芬太尼抑制T2D大鼠蛋白激酶D和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，見圖5。

圖5 Western blot檢測各組大鼠心肌細(xì)胞中PKD和GRP78蛋白表達(dá)

3 討論

T2D是糖尿病流行的主要類型，其主要特征是高血糖，高脂血癥和胰島素抵抗[10]。本研究通過高脂飲食和低劑量鏈脲佐菌素注射建立T2D大鼠模型。糖尿病組中大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的代謝異常，包括FBG、TG、TC及胰島素水平升高，并發(fā)現(xiàn)芬太尼可明顯降低T2D大鼠血液中FBG、TG、TC及胰島素水平，改善T2D引起的大鼠糖脂代謝異常。

芬太尼又名1-苯乙基-4-(N-丙酰苯胺)哌啶，為一種高選擇性與μ-阿片受體結(jié)合的阿片類強效鎮(zhèn)痛藥。已有研究表明芬太尼能夠影響心肌收縮功能，而糖尿病性心肌病是T2D重要的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因[4，11]。另有研究指出心率是T2D患者全因死亡率的獨立預(yù)測因子[12]。本研究發(fā)現(xiàn)T2D大鼠心率明顯升高，而芬太尼能夠降低T2D大鼠的心率。本研究還發(fā)現(xiàn)T2D大鼠出現(xiàn)明顯的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而芬太尼能夠抑制T2D大鼠的心肌損傷和心肌細(xì)胞凋亡，從而保護心臟。

T2D引起心肌損傷的過程與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β等炎性介質(zhì)在其中發(fā)揮重要作用[13]。心肌損傷促使機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)釋放炎癥因子，同時炎癥因子又可以加劇心肌損傷[14]。已有研究表明在糖尿病狀態(tài)下，炎癥反應(yīng)發(fā)生率明顯增高，同時心肌損傷明顯加重[15]。本研究發(fā)現(xiàn)T2D大鼠炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量升高，表明T2D引起炎癥反應(yīng)，芬太尼能夠降低T2D大鼠的IL-6、TNF-α、IL-10、IL-1β含量，表明芬太尼抑制T2D大鼠的炎癥反應(yīng)。

糖尿病性心肌病的發(fā)病是一個慢性和復(fù)雜的過程，其主要歸因于細(xì)胞代謝異常和許多細(xì)胞器的缺陷，如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌纖維膜。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是與細(xì)胞凋亡內(nèi)在途徑的細(xì)胞器[7]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激最終會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和功能喪失。已有大量研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與糖尿病性心肌病的發(fā)病有關(guān)。糖尿病性心肌病可隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)和代謝紊亂誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[16]。 反之長期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會影響多種心臟功能，包括能量代謝，胰島素抵抗和心力衰竭等[17]。GRP78是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)中顯著上調(diào)。 因此，GRP78通常作為反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的生物標(biāo)志物[18]。與先前研究一致，本團隊發(fā)現(xiàn)T2D大鼠心肌細(xì)胞中GRP78顯著上調(diào)，表明其在T2D激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而芬太尼可抑制T2D大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活。

已有證據(jù)表明，PKD是心力衰竭的中介，因此，為進(jìn)一步了解芬太尼對T2D大鼠的心臟保護作用所涉及的潛在機制，研究組重點關(guān)注PKD[19]。PKC是PKD的主要上游激酶，最初認(rèn)為是PKC引起的多種生物反應(yīng)實際上是由PKD執(zhí)行的[20]。已有研究證實糖尿病心臟的PKD活性顯著增加[8]。研究組發(fā)現(xiàn)T2D大鼠心肌細(xì)胞中PKD活性顯著增加，芬太尼能夠抑制T2D大鼠心肌細(xì)胞中PKD活化。

綜上所述，高劑量芬太尼能夠改善T2D大鼠的糖脂代謝，并減輕心肌損傷及心肌細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，同時抑制T2D大鼠蛋白激酶D和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活，芬太尼有望用于臨床糖尿病治療，其具體分子機制還有待進(jìn)一步研究。