骨髓間充質干細胞外泌體miR-10a-5p下調紫外線抵抗相關基因(UVRAG)的表達調控系統(tǒng)性紅斑狼瘡

劉典鋒 王安鳳 何惠忠

(攀枝花市中西醫(yī)結合醫(yī)院，攀枝花 617000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)多見于女性，是一種多因素介導的自身免疫疾病[1]。免疫調節(jié)、基因、環(huán)境、荷爾蒙激素和表觀遺傳等異常都有可能導致SLE的發(fā)生，引起先天和后天免疫反應[2]，并對單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞以及一些細胞和體液組分產生功能上的影響[3]。研究證實，外周血單個核細胞是機體重要的免疫細胞，其增殖和凋亡與SLE的發(fā)生與發(fā)展密切相關[4]。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchy-mal stem cells，BMMSCs)在骨髓中具有成骨前體細胞的潛能，并擁有免疫調節(jié)，免疫抑制以及再生功能[5]。目前BMMSCs移植同樣也被應用于治療SLE[6]。在細胞間交流過程中，可由包含56個蛋白和核酸的外泌體介導形成[7]，根據(jù)產生外泌體的來源細胞類型，外泌體可產生不同的功能，例如介導免疫抑制或者免疫刺激等，干細胞可應用于腫瘤和自身免疫疾病的治療中[8]。大量研究表明，外泌體miRNA在細胞生理過程中發(fā)揮重要調控作用。miRNA同樣參與到SLE的調控中[9-12]。本研究將探討在骨髓干細胞移植中，BMMSCs外泌體調控SLE細胞增殖及凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 人骨髓間充質干細胞(貨號：PT-2501；Lonza)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞取自攀枝花市中西醫(yī)結合醫(yī)院。

1.1.2試劑 DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和FBS購自Gibco；POROSTMHeparin 50 μm購自Thermofisher；Ficoll?400購自Sigma-Aldrich；反轉錄試劑盒PrimeScripTMRT reagent kit以及qRT-PCR試劑盒TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa；外泌體RNA提取試劑盒SeraMir Exosome RNA Column Purification Kit購自System Biosciences；Trizol核酸提取試劑盒和Lipofectamine 3000購自Invitrogen；RIPA蛋白裂解液和Annexin V-FITC試劑盒購自碧云天公司；CCK-8試劑盒購自Abcam；qRT-PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；一抗(antibody-CD9、antibody-CD63、antibody-TSG101、antibody-UVRAG)和HRP標記二抗(山羊抗兔igG)購自Promega。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) BMMSCs細胞培養(yǎng)于含有1%青霉素和10% FBS(使用前100 000 g離心8 h去除血清的外泌體)DMEM培養(yǎng)基中，控制細胞濃度于1×106個/瓶，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d 更換一次培養(yǎng)基，達到80%融合度后使用胰酶消化懸浮用于后續(xù)實驗。外周血單核細胞培養(yǎng)于含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2。培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實驗。

1.2.2BMMSCs來源外泌體以及SLE外周血單個核細胞的分離 BMMSCs來源外泌體分離：取使用無外泌體FBS培養(yǎng)48 h后的BMMSCs條件培養(yǎng)基用于分離提取外泌體。10 000 g離心30 min除掉細胞碎片，PBS重懸后100 000 g離心70 min，重復兩次。最后用30 μl PBS洗滌，保存于-80℃用于后續(xù)實驗。采用透射電子顯微鏡和Western blot分別對所提取外泌體形態(tài)以及表面標記物CD9、CD63和TSG101進行檢測。SLE外周血單個核細胞分離：肝素鈉抗凝管收集SLE外周血，采用Ficoll-Paque試劑配合密度梯度離心分離SLE外周血單個核細胞。

1.2.3qRT-PCR檢測SLE外周血單個核細胞和外泌體中miRNA水平 使用外泌體RNA提取試劑盒提取外泌體中總RNA，具體方法參照試劑盒說明。Trizol試劑盒提取細胞總RNA。使用反轉錄試劑盒得到cDNA，miRNA測定采用qRT-PCR試劑盒。RT-PCR反應體系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX Reference Dye(50×)0.4 μl、cDNA模板2 μl、ddH2O 6 μl。反應參數(shù)：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s一共40個循環(huán)。各miRNA以及內參U6引物見表1。

表1 引物序列

1.2.4CCK-8檢測SLE外周血單個核細胞增殖活性 將細胞接種于96孔板中，每孔100 μl無FBS的RPMI培養(yǎng)基，控制細胞濃度為2×103個/孔。與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)則加入10 μg/ml外泌體于培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)至第1、2、3、4天時，分別加入10 μl CCK-8試劑染色，并繼續(xù)培養(yǎng)1 h。染色完成后在450 nm波長下檢測。

1.2.5流式細胞術檢測SLE外周血單個核細胞凋亡率 將實驗細胞制成細胞懸液后，參照試劑盒說明對細胞進行Annexin Ⅴ-FITC/PI染色標記，流式細胞儀檢測。

1.2.6雙熒光素酶報告基因驗證miR-10a-5p與UVRAG靶向關系 UVRAG 3′UTR中可能與miR-10a-5p具有靶向位點的序列及其突變序列分別插入到Pglo載體中，分別構建質粒Pglo-UVRAG-WT和Pglo-UVRAG-MUT。在SLE外周血單個核細胞中同時轉入miR-10a-5p和UVRAG野生型質?；蛲蛔冃唾|粒。采用Lipofectamine 3000進行轉染，具體操作參照試劑盒使用說明。轉染后培養(yǎng)48 h后加入裂解緩沖液，最后使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光強度。

1.2.7Western blot檢測外泌體表面標記物以及UVRAG表達水平 細胞經PBS重懸洗滌后，RIPA提取總蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉至PVDF膜，膜經TBST洗滌，5%脫脂牛奶封閉1 h。然后加入一抗(CD9，1∶2 000；CD63，1∶2 000；TSG101，1∶2 000；UVRAG，1∶2 000)4℃過夜孵育，孵育完后除去一抗并洗滌。加入HRP標記山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)，于37℃孵育1 h。最后加入化學顯色液，成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結果

2.1成功分離BMMSCs來源外泌體 透射電子顯微鏡拍攝圖片顯示，BMMSCs外泌體呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則圓形，直徑約30～100 nm，如圖1A所示。Western blot結果顯示，外泌體表面標記物CD9，CD63以及TSG101均表達，如圖1B所示。結果表明BMMSCs外泌體分離成功。

圖1 成功分離BMMSCs來源外泌體

2.2BMMSCs來源外泌體抑制SLE外周血單個核細胞增殖并促進其凋亡 CCK-8結果顯示，SLE外周血單個核細胞與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)后第3、4天，細胞增殖活力對比對照組顯著下降(P<0.01)，如圖2A所示。流式細胞儀檢測凋亡結果顯示，相對于對照組，共培養(yǎng)后，PBMC凋亡率顯著升高(P<0.01)，如圖2B、C所示。結果表明，BMMSCs來源外泌體會抑制SLE外周血單個核細胞增殖并促進其凋亡。

圖2 BMMSCs來源外泌體抑制SLE外周血單個核細胞增殖并促進其凋亡

2.3BMMSCs來源外泌體上調SLE外周血單個核細胞內miRNA表達 qRT-PCR檢測結果顯示，在SLE患者外周血單個核細胞中異常低表達的miRNA：miR-155，miR-17，miR-181b和miR-10a-5p，與BMMSCs來源外泌體共培養(yǎng)后，這些miRNA水平均顯著升高(P<0.05)，并且其中miR-10a-5p表達水平上調最高(P<0.01)，如圖3所示。結果表明，SLE外周血單個核細胞中低表達miRNA水平可被BMMSCs外泌體上調，其中miR-10a-5p上調最為顯著。

圖3 BMMSCs來源外泌體顯著上調SLE外周血單個核細胞中miR-10a-5p表達水平

2.4BMMSCs來源外泌體中miR-10a-5p抑制SLE外周血單個核細胞增殖并促進其凋亡 qRT-PCR結果顯示，相比于對照組SLE外周血單個核細胞中轉染antagomiR-10a-5p后，細胞中miR-10a-5p水平顯著降低(P<0.01)，如圖4A所示。CCK-8檢測結果顯示，Exo組在第3、4天時SLE外周血單個核細胞增殖活力相比于對照組顯著降低，而將Exo中miR-10a-5p敲降后第3、4天，SLE外周血單個核細胞增殖活力相比于Exo組顯著升高(P<0.01)，如圖4B所示。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果顯示，相比于對照組，Exo組凋亡率顯著升高(P<0.01)，但敲降外泌體中miR-10a-5p后，SLE外周血單個核細胞凋亡率相比于Exo組顯著降低(P<0.01)，如圖4C、D所示。由此可知，抑制外泌體miR-10-5p水平可促進SLE外周血單個核細胞增殖從而抑制其凋亡。

圖4 敲降BMMSCs來源外泌體miR-10a-5p促進SLE外周血單個核細胞增殖并抑制其凋亡

2.5miR-10a-5p靶向下調UVRAG表達 starBase數(shù)據(jù)庫預測結果顯示，UVRAG 3’UTR與miR-10a-5p存在靶向結合位點，如圖5A所示。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，相比于miR-NC+UVRAG WT組，miR-10a-5p+UVRAG WT組熒光強度顯著降低(P<0.01)，如圖5B所示，并且miR-NC+UVRAG MUT組熒光強度與miR-10a-5p+UVRAG MUT組無統(tǒng)計學差異。Western blot檢測結果顯示，轉染miR-10a-5p mimics后，SLE外周血單個核細胞中UVRAG表達水平相比于對照組顯著降低(P<0.05)，如圖5C所示。由此可知，在SLE外周血單個核細胞中miR-10a-5p靶向下調UVRAG表達。

圖5 miR-10a-5p靶向下調UVRAG表達水平

2.6BMMSCs外泌體miR-10a-5p下調UVRAG抑制SLE外周血單個核細胞增殖促進其凋亡 Western blot結果顯示，相比于NC組，Exo組和敲降UVRAG組中UVRAG蛋白的表達水平顯著下調(P<0.01)，同時敲降miR-10a-5p和UVRAG組中UVRAG的表達水平與NC組相比無差異無統(tǒng)計學意義，如圖6A所示。將Exo與SLE外周血單個核細胞共培養(yǎng)，用CCK-8和流式細胞術檢測共培養(yǎng)后的SLE外周血單個核細胞，結果顯示，相比較于Exo組，敲降UVRAG且與Exo共培養(yǎng)可明顯抑制SLE外周血單個核細胞的增殖(P<0.01，如圖6所示)并誘導細胞凋亡(P<0.05，如圖6C所示)，與Exo共培養(yǎng)且同時敲降miR-10a-5p和UVRAG組中細胞的增殖和凋亡水平與NC組相比無明顯變化。綜上可知，BMMSCs外泌體miR-10a-5p靶向下調UVRAG，抑制SLE外周血單核細胞的增殖并誘導細胞凋亡。

圖6 BMMSCs來源外泌體miR-10a-5p下調UVRAG表達水平從而抑制SLE外周血單個核細胞增殖并促進其凋亡

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種多因素介導的自身免疫疾病，發(fā)病率在26/100 000至52/100 000間，女性約為1/1 000[13]，并影響腎臟、腦、肺和造血系統(tǒng)功能?？刹捎妙惞檀迹h(huán)磷酰胺以及其他免疫抑制藥物如霉酚酸酯對SLE進行治療，但是治療效果并不理想，而且這類治療方法容易產生感染，卵巢功能衰竭，繼發(fā)性腫瘤等副作用[14-16]。在對BMMSCs的研究中，發(fā)現(xiàn)SLE患者BMMSCs在細胞因子(如生長因子β)分泌以及白介素6/7基因的轉錄都異于正常BMMSCs，并且也有研究發(fā)現(xiàn)SLE患者BMMSCs在增殖和免疫調控中都異于正常BMMSCs，表明BMMSCs在SLE的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用[17]。并且有研究表明，BMMSCs能夠抑制T細胞，B細胞，自然殺傷細胞和樹突細胞增殖活力[18-20]。BMMSCs也已被應用SLE的治療，并產生良好的治療效果[21，22]。

BMMSCs可通過將細胞中包括細胞器(如線粒體)、蛋白、基因以及miRNA等物質包裹于外泌體微泡中，從而進行細胞間交流[23，24]。而這類外泌體miRNA在許多生理過程中都發(fā)揮著重要作用，對細胞生物學功能產生影響。BMMSCs外泌體miR-29b-3p可調控2型糖尿病胰島素耐藥性[25]。在心臟疾病的治療中，BMMSCs外泌體miR-21-5p通過調控PI3K信號通路影響肌肉收縮和鈣調控[26]。同時也有研究表明，BMMSCs通過外泌體調控接收細胞中miRNA水平，并進而調控下游通路對細胞功能產生影響[27]。在本研究中，探討了BMMSCs外泌體miR-10a-5p對SLE細胞的調控。

大量研究表明，miR-10a-5p在多種細胞中影響細胞增殖與凋亡。在宮頸癌中，miR-10a-5p通過靶向調控BDNF抑制腫瘤細胞增殖[28]。在類風濕關節(jié)中，miR-10a-5p可調控TBX5，從而對滑膜炎細胞增殖和凋亡產生影響[29]。miRNA通常通過靶向調控下游mRNA，影響其在細胞中的水平，進而調控細胞生物學功能。在本研究中，探討了在BMMSCs移植中，外泌體miR-10a-5p通過UVRAG調控SLE細胞增殖與凋亡。

對于皮膚癌癥，暴露于紫外光(UV)照射下可引起皮膚癌癥的惡化，而UVRAG參與調控UV敏感性[30，31]。UVRAG同時也參與調控自噬，內吞和細胞分泌轉運等過程[32，33]。UVRAG在一些細胞如結直腸癌細胞，黑素瘤細胞等中，由miRNA調控參與細胞增殖凋亡等過程[34，35]。同時也有研究表明，miR-125b通過靶向調控UVRGA并抑制SLE患者的自噬過程[36]。而在本研究中，對BMMSCs分泌miR-10a-5p進而調控UVRAG參與SLE細胞增殖和凋亡進行了闡述。

綜上所述，在BMMSCs移植后，BMMSCs通過分泌外泌體miR-10a-5p下調SLE細胞中UVRGA表達，從而抑制SLE細胞增殖并促進其凋亡。為BMMSCs治療SLE的分子機制提供了新的思路；并進一步闡述了UVRAG對SLE細胞生物學功能產生的影響，為UVRAG的功能研究提供了理論支持。結合UVRAG在SLE細胞中產生的影響，可進一步研究UVRAG在SLE細胞中的作用網絡。