羊梨形蟲分子分類遺傳標(biāo)記的研究進(jìn)展

郝桂英

（西昌學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013）

羊梨形蟲（piroplasms）隸屬于頂復(fù)門（Apicomplexa）、孢子蟲綱（Sporozoea）、梨形蟲亞綱（Piroplasmia）、巴貝斯科（Babesiidae）巴貝斯屬（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒屬（Theileria）[1]。目前，國內(nèi)外已報道感染羊的巴貝斯蟲主要有莫氏巴貝斯蟲（Babesia motasi）、綿羊巴貝斯蟲（B. ovis）、粗糙巴貝斯蟲（B.crassa）、葉狀巴貝斯蟲（B.foliata）、泰氏巴貝斯蟲（B. taylori）和新疆巴貝斯蟲未定種（Babesia sp. Xinjiang）[2]；泰勒蟲有呂氏泰勒蟲（Theileria luwenshuin）、尤氏泰勒蟲（T. uilenbergi）、綿羊泰勒蟲（T. ovis）、萊氏泰勒蟲（T. lestoquardi）、分離泰勒蟲（T.separata）和隱藏泰勒蟲（T.recondita）[3-7]。我國已報道了莫氏巴貝斯蟲、新疆巴貝斯蟲未定種（介于莫氏巴貝斯蟲和粗糙巴貝斯蟲之間）、呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和綿羊泰勒蟲[8-9]。本文就羊梨形蟲分子分類遺傳標(biāo)記研究的最新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 核糖體DNA 序列

核糖體DNA 是一類中度重復(fù)序列，以串聯(lián)多拷貝的形式存在于細(xì)胞核內(nèi)染色體DNA 中。每個重復(fù)單位由3 種核糖體基因編碼區(qū)（18S rRNA、5.8S rRNA、28S rRNA）、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（non-transcribed spacer，NTS）組成。

1.1 核糖體小亞基RNA（18S rRNA）基因 近年來，18S rRNA 基因作為分子標(biāo)記在羊梨形蟲分子分類、遺傳進(jìn)化研究中得到了廣泛應(yīng)用[10]。Schnittger等基于18S rRNA 基因序列對72 個分離自世界各地綿羊和山羊的梨形蟲進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)泰勒蟲的進(jìn)化史較巴貝斯蟲短，且泰勒蟲各個蟲株間的變異性較低[5]。

Liu 等基于18S rRNA 基因片段繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示巴貝斯蟲馬當(dāng)株、天祝株、臨潭株、寧縣株、河北株和遼寧株均聚在莫氏巴貝斯蟲分支，同源性為88.2%～99.9%，而新疆巴貝斯蟲未定種單獨為一支，與已知羊巴貝斯蟲和粗糙巴貝斯蟲的同源性為79.7%～81.2%，與羊巴貝斯蟲中國株的同源性低于86.6%[11]。因此，Liu等提出我國至少存在莫氏巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種2 種感染羊的巴貝斯蟲[11]。

馬米玲等報道羊源巴貝斯蟲未定種敦煌株與羊巴貝斯蟲馬當(dāng)株、天祝株、臨潭株、寧縣株、河北株、遼寧株和新疆株18S rRNA 基因序列的同源性為84.9%～99.8%，其中與遼寧株的同源性最低，與新疆巴貝斯蟲未定種的同源性最高?；?8S rRNA 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示巴貝斯蟲未定種敦煌株與新疆巴貝斯蟲未定種和分離自南非長頸鹿的巴貝斯蟲未定種位于同一支[12]。

李有全等基于18S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，永靖、張家川、臨潭和龍德的尤氏泰勒蟲聚在同一支。新疆的綿羊泰勒蟲與法國、西班牙、土耳其的綿羊泰勒蟲先聚為一支，然后再與蘇丹的綿羊泰勒蟲聚類。5 個大悟的呂氏泰勒蟲聚在同一小支，與寧縣的呂氏泰勒蟲親緣關(guān)系最近；榆中的呂氏泰勒蟲與渭源2 號、青海、馬當(dāng)?shù)膮问咸├障x聚類；但渭源4號呂氏泰勒蟲單獨為一支，與其他呂氏泰勒蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。因此，不同地方的呂氏泰勒蟲間的差異比不同地方尤氏泰勒蟲間的差異大，渭源的呂氏泰勒蟲可能存在不同的基因型[13]。

Li 等報道采集自大悟山羊、隨州山羊、睢縣山羊、嵩縣綿羊和洛陽綿羊的29 個羊泰勒蟲18S rRNA基因序列的同源性為99.7%～100%，與渭源2 號、麻城、浙江99 號、寧夏、青海和榆中2 號呂氏泰勒蟲的同源性均為99.7%。基于18S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示呂氏泰勒蟲與水牛泰勒蟲/瑟氏泰勒蟲（T. buffeli/T. sergenti）親緣關(guān)系最近，位于不引起淋巴組織增生的泰勒蟲分支上，而引起淋巴組織增生的泰勒蟲如環(huán)形泰勒蟲、小泰勒蟲和萊氏泰勒蟲等聚在另一支上[14]。

田萬年等基于18S rRNA 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示吉林的呂氏泰勒蟲與青海的呂氏泰勒蟲親緣關(guān)系最近，與榆中、渭源、馬當(dāng)、寧縣和大悟的呂氏泰勒蟲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與青海的尤氏泰勒蟲、臨潭的尤氏泰勒蟲、新疆的綿羊泰勒蟲、土耳其的綿羊泰勒蟲親緣關(guān)系更遠(yuǎn)[15]。

于正清等報道陜南的呂氏泰勒蟲18S rRNA 基因序列（1 275 bp）與浙江99 號的呂氏泰勒蟲同源性為99%?；?8S rRNA 基因片段構(gòu)建的NJ 樹發(fā)現(xiàn)，2個陜南的呂氏泰勒蟲與浙江99 號的呂氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲（AF081136）聚在同一支上[16]。

Zhou 等報道分離自土耳其綿羊的5 個綿羊巴貝斯蟲18S rRNA 基因序列間的同源性為98.54%～99.82%，與已報道的土耳其、突尼斯、西班牙和葡萄牙的綿羊巴貝斯蟲的同源性也為98.54%～99.82%?；?8S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示土耳其的綿羊巴貝斯蟲（AY260178）未與其他地方的綿羊巴貝斯蟲聚在同一支上，推測土耳其的綿羊巴貝斯蟲可能存在不同的基因型；分離自土耳其綿羊的5 個綿羊泰勒蟲18S rRNA 基因序列的同源性為99.23%～99.81%，與已報道的土耳其的綿羊泰勒蟲的同源性為99.23%～100%，與坦桑尼亞的綿羊泰勒蟲的同源性為99.23%～99.81%，與中國、突尼斯、伊朗、西班牙、蘇丹的綿羊泰勒蟲的同源性為99.23%～100%。基于18S rRNA基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，土耳其的綿羊泰勒蟲可能存在兩種基因型[17]。

Ozubek 等對122 份土耳其山羊血樣進(jìn)行巴貝斯蟲18S rRNA 基因高變異區(qū)的PCR擴(kuò)增，從其中7 份血樣中測序獲得兩個新序列（KU714605、KU714606），兩者的同源性為99.64%，與綿羊巴貝斯蟲、莫氏巴貝斯蟲和粗糙巴貝斯蟲的同源性分別為90.9%、93.5%和93.4%，與近幾年中國報道的巴貝斯蟲基因型和希臘綿羊的B.lengau同源性為91%～93%，與加拿大麋鹿的B. odocoilei（KC460321）、荷蘭森林馴鹿的Babesia sp.EU1（GQ888709）和土耳其母牛的分歧巴貝斯蟲（B.divergens，KP745627）同源性最高（96%～97%）。基于18S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示兩個土耳其的巴貝斯蟲與B.odocoilei、Babesia sp.EU1 和分歧巴貝斯蟲聚在同一支上。因此，Ozubek 等推測寄生于土耳其山羊的巴貝斯蟲可能是一個新種[18]。

鐘維等報道壤塘和紅原藏綿羊的呂氏泰勒蟲18S rRNA 基因序列的同源性為100%，與小金的呂氏泰勒蟲同源性為99.4%，與青海、寧夏的呂氏泰勒蟲同源性為97.8%～99.8%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示藏綿羊感染的呂氏泰勒蟲與國內(nèi)外報道的呂氏泰勒蟲均處于同一分支，且與青海的呂氏泰勒蟲親緣關(guān)系最近[19]。

1.2 ITS ITS 是 核 糖 體RNA（rRNA）上 介 于18S rRNA 和28S rRNA 基因之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包含位于18S rRNA 和5.8S rRNA 之間的核糖體RNA 第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS1）和位于5.8S rRNA 和28S rRNA 之間的核糖體RNA 第二內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）兩段序列，有時也將ITS1、5.8S rRNA 和ITS2 統(tǒng)稱為ITS 區(qū)。

由于ITS 具有進(jìn)化速度快、種內(nèi)變異小而種間變異大、長度適中、有足夠的遺傳信息等優(yōu)點，因此，ITS 序列已越來越多地用于梨形蟲分類學(xué)研究。Aktas等克隆并測序了16 個牛、羊泰勒蟲的ITS 區(qū)，發(fā)現(xiàn)ITS1 基因的序列長度和堿基變異均比ITS2變異更大[20]。

莫氏巴貝斯蟲寧縣株、馬當(dāng)株、天祝株、臨潭株和河北株的ITS1、5.8S rRNA、ITS2 序列同源性分別為71.2%～92.3%、98.7%～100.0%和65.7%～92.1%，而喀什的羊巴貝斯蟲與以上5 個莫氏巴貝斯蟲分離株的ITS1、5.8S rRNA、ITS2 序列的同源性分別為2.5%～2.8%、91.9%～93.7%和9.0%～12.2%；基于ITS全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示喀什的羊巴貝斯蟲單獨為一支，而中國其他5 個莫氏巴貝斯蟲分離株聚在同一支，且又被分為兩個小支：一支是低致病力的莫氏巴貝斯蟲臨潭株[21]、馬當(dāng)株和天祝株，另一支是高致病力的莫氏巴貝斯蟲寧縣株[22]和河北株，進(jìn)一步證實我國至少存在2 種感染羊的巴貝斯蟲[23]。

Tian 等報道分離自新疆綿羊的Theileria sp. OT3與西班牙的Theileria sp. OT3 18S rRNA 基因序列（DQ866839）的同源性為99%（有2 個堿基差異）；基于ITS 全序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示：新疆的Theileria sp.OT3 單獨為一支，先與尤氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲聚類形成一支，再與綿羊泰勒蟲聚類。因此，新疆的Theileria sp.OT3 與尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲的親緣關(guān)系更近[24]。

1.3 核糖體大亞基RNA（28S rRNA）基因 Gou 等報道莫氏巴貝斯蟲臨潭株、寧縣株、天祝株、河北株和新疆巴貝斯蟲未定種的28S rRNA 和18S rRNA 基因序列的同源性分別為85.8%～99.9%和93.5%～99.2%，因此28S rRNA 基因比18S rRNA 基因有更多的遺傳信息；基于28S rRNA 和28S rRNA+18S rRNA 基因聯(lián)合序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示莫氏巴貝斯蟲臨潭株與天祝株首先聚類，再與河北株聚類，最后與寧縣株聚類。而基于18S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹是莫氏巴貝斯蟲臨潭株與寧縣株首先聚類，再與天祝株聚類，最后與河北株聚類。前兩者構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹比18S rRNA 單基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹更合理，能較好地闡明莫氏巴貝斯蟲的系統(tǒng)發(fā)育。因此，28S rRNA 基因可作為巴貝斯蟲系統(tǒng)發(fā)育研究的遺傳標(biāo)記[25]。

呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲雖然有相似的形態(tài)、宿主、媒介蜱、致病力和分布，但基于28S rRNA 基因全序列和28S rRNA 基因D2-D3 片段繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹再次證實呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲是兩個不同的種。泰勒蟲28S rRNA 基因全序列和D2-D3 片段比18S rRNA 基因序列有更多的種內(nèi)變異位點，因此，28S rRNA 基因是進(jìn)行泰勒蟲系統(tǒng)發(fā)育分析的一個有用遺傳標(biāo)記，D2～D3 片段可代替28S rRNA 基因全序列用于泰勒蟲種類鑒定，可能是泰勒蟲分子鑒定的一個理想DNA 條形碼[26]。

2 線粒體遺傳標(biāo)記

2.1 線粒體基因組的特征 目前，在羊梨形蟲中僅見羊巴貝斯蟲臨潭株（Bl）和羊巴貝斯蟲新疆株（Bx）線粒體基因組全序列的報道[27]，其長度分別為5 790 bp 和6 020 bp，與已報道的牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、東方巴貝斯蟲、馬巴貝斯蟲、吉氏巴貝斯蟲（線粒體基因組長度為5 847 bp～6 005 bp）及環(huán)形泰勒蟲、東方泰勒蟲和小泰勒蟲（線粒體基因組長度為5 905 bp～5 957 bp）線粒體基因組大小相似，但小于田鼠巴貝斯蟲、B. rodhaini 和馬泰勒蟲的線粒體基因組（線粒體基因組長度為6 929 bp～11 109 bp）。Bl 和Bx 的線粒體基因組由細(xì)胞色素C 氧化酶亞基I 基因（cox1）、細(xì)胞色素C 氧化酶亞基III 基因（cox3）和細(xì)胞色素b 基因（cob）3 個蛋白質(zhì)編碼基因及5 個或6 個大亞基rRNA 基因（命名為L1～L6）組成，無tRNA基因。蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄方向和順序與牛巴貝斯蟲（EU075182、AB499088）、雙芽巴貝斯蟲（AB499085）、東方巴貝斯蟲（KF218819）、馬巴貝斯蟲（AB499086）、吉氏巴貝斯蟲（AB499087）和小泰勒蟲（AB499089）一致，但與田鼠巴貝斯蟲（AB624353）、B.rodhaini（AB624357）、東方巴貝斯蟲（AB499090）和馬泰勒蟲（AB499091）明顯不同。

Bl 和Bx 線粒體基因組的核苷酸差異為86.8%，與牛巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲、東方巴貝斯蟲、馬巴貝斯蟲、吉氏巴貝斯蟲、田鼠巴貝斯蟲和B. rodhaini 相比，核苷酸差異為6.9%～78.5%。這9 個蟲種cox1、cox3 和cob 基因的核苷酸差異分別為10.3%～36.9%、8.9%～57.6%和8.9%～50.9%。相反，氨基酸序列的差異和分歧分別為5.9%～37.3%和17.9%～75.5%。

在蛋白質(zhì)編碼基因中，cox1 基因序列相對保守，cob 基因序列具有中等程度的變異，而cox3 基因序列有較大的序列。因此，線粒體基因組某些區(qū)域可作為系統(tǒng)發(fā)育學(xué)或種群遺傳學(xué)研究的標(biāo)記基因。

2.2 cox1 基因 cox1 作為線粒體基因組的重要組成部分，具有適度的序列變異，使其在任何分類階元中都可使用。與18S rRNA 基因序列相比，cox1 基因序列含有更多的變異位點，可作為物種分子分類的首選基因。因此，基于cox1 基因序列的巴貝斯蟲/泰勒蟲分子分類能夠更清楚地反映出巴貝斯蟲/泰勒蟲種類、種間的進(jìn)化關(guān)系，不同宿主來源的巴貝斯蟲/泰勒蟲之間、同一種巴貝斯蟲/泰勒蟲不同地方株間的關(guān)系[28-29]。

茍惠天等報道莫氏巴貝斯蟲臨潭株、寧縣株、天祝株、河北株與新疆巴貝斯蟲未定種cox1 基因片段（976 bp）的同源性為88.2%～100%，18S rRNA 基因片段（1 680 bp～1 715 bp）的同源性為93.5%～99.2%?；趦蓚€基因的系統(tǒng)發(fā)育樹說明我國莫氏巴貝斯蟲不同地方株間可能存在亞種關(guān)系，但新疆巴貝斯蟲未定種的分類地位在基于cox1 基因的分類中更合理[30]。

2.3 cox3 基因 基于cox3 基因部分序列（552 bp）繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示莫氏巴貝斯蟲寧縣株未與臨潭株/天祝株聚在同一支上，與基于cob 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相似，而與18S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果不一致。18S rRNA基因和cox3基因聯(lián)合繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹提高了莫氏巴貝斯蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠性。莫氏巴貝斯蟲分離株的致病力差異和血清交叉反應(yīng)有助于解釋莫氏巴貝斯蟲分離株的分子差異。與18S rRNA 和cob 基因相比，cox3 基因種內(nèi)差異顯著[31]。

2.4 cob 基因 Tian 等報道6 種寄生于牛、羊的巴貝斯蟲cob 部分序列（550 bp）的核苷酸變異率為1.6%～30.8%。相對于cob 部分序列和ITS，18S rRNA能夠可靠地區(qū)分某些巴貝斯蟲蟲種間較深的分支，而cob 基因部分序列在識別某些巴貝斯蟲不同地方株方面優(yōu)于18S rRNA 和ITS[32]。

3 其它基因

3.1 梨形蟲主要表面膜蛋白（Major piroplasm surface proteins, MPSP）基因 MPSP 為泰勒蟲特有，是泰勒蟲感染紅細(xì)胞階段蟲體分泌的一種保守性較強的糖蛋白，在裂殖體和子孢子階段都有表達(dá)[33]，可用作研究泰勒蟲分子分類和系統(tǒng)發(fā)育的分子標(biāo)記[34-35]。根據(jù)MPSP 基因?qū)⑸咸├障x劃分為I（Ikeda）、C（Chitose）、B（Buffeli）和Thai 四種亞型[32]，東方泰勒蟲劃分為11 種基因型（1-8 型和N1-N3 型）[35]。羊梨形蟲僅見呂氏泰勒蟲MPSP的報道，2個陜西的羊呂氏泰勒蟲與寧縣的呂氏泰勒蟲MPSP 基因序列的同源性分別為100%和99%[36]。

3.2 40S 核糖體蛋白S8（RPS8）基因 基于RPS8基因序列（561 bp）繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹將莫氏巴貝斯蟲分成寧縣株和臨潭株/天祝株兩個小分枝[37]。Tian等認(rèn)為RPS8 基因是一種有用的、新穎的遺傳標(biāo)記，它在種內(nèi)變異較小，而種間變異較大，可用于巴貝斯蟲種類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究[37]。

3.3 熱休克蛋白90（HSP90）基因 Guan 等報道莫氏巴貝斯蟲臨潭株、天祝株、寧縣株和河北株HSP90 基因的核苷酸和氨基酸序列同源性均大于93.2%，其中臨潭株和天祝株的同源性為99.4%，寧縣株和河北株的同源性為98.8%，四者與巴貝斯蟲未定種新疆株的同源性均低于80%?；贖SP90 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹將莫氏巴貝斯蟲分成臨潭株/天祝株和寧縣株/河北株兩個小分枝[38]。

3.4 血小板反應(yīng)相關(guān)黏附蛋白（Thrombospondinrelated adhesive protein，TRAP）基因 TRAP 是由多基因編碼的一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于微線體蛋白，由胞外的血小板結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域和/或整合素A樣結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域組成。在多種頂復(fù)門原蟲入侵宿主過程中起重要作用，具有種/屬和發(fā)育階段特異性[39]。何欣等報道莫氏巴貝斯蟲寧縣株/河北株、天祝株、臨潭株和巴貝斯蟲未定種新疆株/敦煌株的TRAP 基因開放閱讀框大小分別為2 286 bp、2 142 bp、2 100 bp 和1 944 bp，分別含有3 個、4 個、4 個和5 個內(nèi)含子。莫氏巴貝斯蟲寧縣株和河北株的核苷酸和氨基酸序列同源性均為99.9%，莫氏巴貝斯蟲天祝株和臨潭株的同源性分別為99.8%和99.9%，巴貝斯蟲未定種新疆株和敦煌株的同源性均為100%；莫氏巴貝斯蟲和巴貝斯蟲未定種的核苷酸和氨基酸序列同源性分別為55.4%～56.1%和43.6%～46.9%，而莫氏巴貝斯蟲寧縣株/河北株與莫氏巴貝斯蟲天祝株/臨潭株的同源性分別為74.0%～74.6%和59.1%。即組內(nèi)核苷酸同源性為99.8%～100%，而組間同源性為43.6%～74.6%?；赥RAP基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，我國6 株羊巴貝斯蟲被分為莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種新疆株/敦煌株兩大枝，而莫氏巴貝斯蟲又被分成寧縣株/河北株和天祝株/臨潭株兩個小枝。研究結(jié)果表明6 株羊巴貝斯蟲TRAP 基因結(jié)構(gòu)存在差異，但其蛋白特征性的結(jié)構(gòu)域較為保守。研究結(jié)果再次證實我國分離到兩種羊巴貝斯蟲，且莫氏巴貝斯蟲可能存在兩個亞種[40-42]。

3.5 棒狀體相關(guān)蛋白-1（Rhoptry-associated protein-1，RAP-1）基因 RAP-1 位于巴貝斯蟲裂殖子頂端，在子孢子、裂殖子階段均有表達(dá)。Niu 等報道羊巴貝斯蟲天祝株、臨潭株和寧縣株RAP-1 基因、18S rRNA 基因序列的核苷酸同源性分別為99.9%和98.7%，與巴貝斯蟲河北株的核苷酸同源性分別為78%和98.7%。基于RAP-1 基因序列繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，巴貝斯蟲天祝株、臨潭株和寧縣株聚為一支，而巴貝斯蟲河北株單獨為一支[43]。

Niu 等報道18 個采集自海南、廣東、廣西、云南、重慶、四川、湖北、陜西、甘肅、河北、遼寧、內(nèi)蒙古綿羊和山羊的巴貝斯蟲未定種的RAP-1a基因拷貝的N 端保守區(qū)域（162 nt～670 nt）的部分序列（507 bp）同源性為100%[44]。Niu 等報道采集自河南、湖北、新疆、內(nèi)蒙古、海南、甘肅綿羊血液的巴貝斯蟲RAP-1b基因3'端的536 bp 序列與巴貝斯蟲BQ1（臨潭和寧縣）同源性為100%，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分別聚在巴貝斯蟲BQ1（臨潭和寧縣）/巴貝斯蟲天祝株分支和巴貝斯蟲河北株分支兩支上[45]。因此，近緣種的RAP-1 基因序列比18S rRNA 基因序列更保守[44]。

徐建林等報道莫氏巴貝斯蟲寧縣株/河北株、莫氏巴貝斯蟲天祝株/臨潭株、羊巴貝斯蟲未定種新疆株/敦煌株棒狀體頸部蛋白RON2 基因ORF 的分別為4 044 bp、4 047 bp 和4 029 bp，核苷酸和氨基酸序列相似性分別為67.0%～67.4%和69.2%～69.3%，莫氏巴貝斯蟲寧縣株/河北株和莫氏巴貝斯蟲天祝株/臨潭株間間的相似性分別為92.8%～92.9%和91.1%～91.2%。系統(tǒng)發(fā)生樹上羊巴貝斯蟲未定種和莫氏巴貝斯蟲分別位于2 大支，莫氏巴貝斯蟲又被分為2小支[46]。

4 小結(jié)與展望

越來越多的研究顯示18S rRNA 基因作為分類基因在科或更高階元的研究時顯示出一定優(yōu)勢，但在區(qū)分親緣關(guān)系很近的物種（屬以下）時，其結(jié)果不甚理想。線粒體cox1 基因可能適合種類分子鑒定和/或分化，而cox3 和cob 可能適合識別巴貝斯蟲/泰勒蟲種內(nèi)不同株。以莫氏巴貝斯蟲為例，不同莫氏巴貝斯蟲地方分離株在使用不同基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析時得到的結(jié)果不一致。如基于18S rRNA和28S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹莫氏巴貝斯蟲聚在同一枝，且未形成明顯的聚類小分枝；基于ITS、cox1、cox3、cob、RPS8、HSP90 和TRAP 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將其分成河北株/寧縣株和臨潭株/天祝株兩個小枝；基于RAP-1 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹將其分成寧縣株/臨潭株/天祝株和河北株兩個小枝。因此，選取多個分子標(biāo)記共同進(jìn)行分析，對更深入地了解羊梨形蟲的分子分類、種群遺傳進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)生歷史有一定的促進(jìn)作用，并有利于發(fā)現(xiàn)潛在的亞種。

綜上所述，羊梨形蟲的分子分類學(xué)研究已取得了一定的進(jìn)展。相信隨著分子遺傳學(xué)研究的不斷深入，羊梨形蟲種類分類學(xué)研究和遺傳變異研究會取得更大突破。