急性腎損傷模型塑造研究進展

楊婷，林志健，姜卓希，褚夢真，張冰，鄒麗娜

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，又稱急性腎功能衰竭，是由各種病因引起腎功能急速下降的一種臨床綜合征[1]。作為世界難治性疾病之一，其治療手段仍有限制，建立穩(wěn)定、可靠的AKI模型是促進腎功能不全藥物研制的前提。臨床上以腎臟缺血、腎毒性藥物、病菌感染為高發(fā)誘因，故研究者多從這幾方面入手，塑造出多種急性腎損傷模型。筆者通過對相關文獻的梳理發(fā)現(xiàn)，該模型常見實驗動物有大鼠、小鼠、家兔、犬等，造模類型以缺血再灌注型、藥物誘導型與感染型三者較為集中，現(xiàn)將從這三種造模類型展開論述與分析。

1 缺血再灌注型

實驗缺血再灌注型急性腎損傷模型包括雙側腎蒂夾閉法、一側腎缺血再灌注加對側腎切除法、部分結扎腹主動脈法、遠端臟器缺血誘導法、失血性休克法等，多以外源性手術方式造模，常見動物有大鼠、小鼠、家兔和犬。缺血為急性腎損傷最常見病因之一，是AKI模型的首選造模因素。腎臟遍布豐富的微血管網(wǎng)，其血容量不足是引起腎臟循環(huán)障礙、組織損傷的病理基礎。隨后血液恢復再灌注階段，通過引發(fā)炎癥級聯(lián)反應、活性氧(ROS)氧化損傷、細胞凋亡、細胞內Ca2+代謝失衡、能量代謝障礙等造成腎組織再次受損[2]。

1.1 雙側腎蒂夾閉法

雙側腎蒂夾閉法為目前國內外學者常用造模方法。 Shen等[3]對麻醉后大鼠作腹正中線切口，以無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側腎蒂45 min，再灌注6 h，以大鼠腎組織由紫黑色轉為紅潤時表明造模成功。以往實驗多以腹部正中切口，牽扯其胃腸道，易引起動物胃腸感染和功能紊亂，謝慧敏等[4]通過采用背入式切口對模型進行改進，成功塑造出一種損傷小、操作簡便且效果穩(wěn)定的大鼠腎缺血再灌注損傷模型。

該法造模周期短，成功率高達90%，通過突然暫時性的阻斷腎臟血液供應，使細胞線粒體功能障礙，能量生成下降；當血液恢復再灌流時，大量活性氧釋放致膜的脂質過氧化，引起腎臟組織的快速損傷[5]。雖然該法有操作簡便、快速的優(yōu)勢，但通過夾閉腎動靜脈引起的腎臟淤血缺血，易導致機體血壓大幅度波動，并發(fā)高血壓等病癥，與臨床急性缺血再灌注腎損傷的發(fā)病機制不大等同。

1.2 一側腎缺血再灌注加對側腎切除法

一側腎蒂/腎動脈夾閉加對側腎切除法在雙側腎蒂夾閉法的基礎上進行優(yōu)化，通過腎切除手段模擬臨床因創(chuàng)傷、腎移植引起免疫炎癥損害。王明秋等[6]對SD大鼠作腹正中切口，安全切除右腎后，對左側腎蒂夾閉45 min,動態(tài)觀察以再灌注24 h后腎組織、功能損傷最為顯著，且證實該模型可用于AKI早期診斷、及時干預治療等方面的研究。Rojas-Morales等[7]采用該法成功建立急性腎損傷大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)禁食處理可減輕腎損傷所伴隨的氧化應激、線粒體功能障礙等病理反應。

該法相比于雙側腎蒂夾閉法而言，病理損傷顯著、呈更明顯的漸進性變化，更趨于臨床腎移植狀態(tài)。但實驗過程涉及到一側腎臟切除過程，要求實驗者掌握熟練的操作技術，保證實驗環(huán)境的無菌無污染，須動態(tài)監(jiān)測動物術后的生理狀態(tài)等。

1.3 部分結扎腹主動脈法

腎血流量因遠端肢體損傷導致持續(xù)性低灌流狀態(tài)，易形成腎前性急性腎損傷。慈紅波[8]為探討遠端肢體恢復血流后的損傷作用，采用部分結扎腹主動脈法造模，結果發(fā)現(xiàn)內皮素以及氧自由基在腎損傷過程中起主導作用，可對其病理機制展開進一步研究。Eser等[9]通過對大鼠腎下腹主動脈夾閉120 min、再灌注120 min后成功建立急性腎損傷模型，且應用該模型可評價腎上腺髓質素的干預作用。

通過結扎腎下腹主動脈引起遠端肢體缺血缺氧，再灌注時伴隨大量的氧自由基流經(jīng)腎臟，造成腎臟急性損傷。該法可用于評價活性氧族在再灌注損傷中的致病作用，旨在模擬人血液低灌注狀態(tài)下的腎損傷，與臨床患者病情較為貼近。值得注意的是，腹主動脈結扎時應把控好結扎程度及時間，避免血流量大幅度波動。

1.4 遠端臟器缺血誘導法

肝、腸等遠端臟器的缺血再灌注損傷常累及腎臟，急性腎損傷則是其中的一個重要并發(fā)癥[10]。崔龍海等[11]采用Pringle法制備大鼠肝臟I /R損傷模型，主要通過暴露大鼠肝門部，夾閉肝十二指腸韌帶使其缺血30 min，松開后再灌注2 h成模，病理組織觀察可見腎小球及腎間質水腫，腎小管上皮細胞腫大、變形等。此外，研究表明腸道功能障礙亦與腎臟損傷緊密聯(lián)系，孫倩等[12]通過夾閉小鼠腸系膜上動脈1 h、恢復供血2 h完成，結果可見腸缺血再灌注后引發(fā)腎小管上皮細胞水腫、壞死，與影響Nrf2/ARE信號通路相關。

遠端臟器缺血損傷誘發(fā)急性腎功能障礙，以肝、腸缺血再灌注模型為主。該法模擬了臨床手術臟器損傷的病理生理狀態(tài)，呈遞進性變化；目前臟器之間的作用機制還不明確，肝、腸等臟器缺血損傷同時易引發(fā)多器官功能障礙綜合征、腎損傷程度難以把控，采用該法展開急性腎損傷研究仍存在一定難度。

1.5 失血性休克法

失血性休克是臨床手術創(chuàng)傷常見的急重病癥，因大量失血導致機體周身循環(huán)障礙，腎臟是最易受累的器官之一。實驗失血性休克模型致急性腎損傷多采用放血定壓法，放血時，?？刂苿游镅獕涸? ～ 6 kPa范圍，Cardoso等[13]通過該法實現(xiàn)失血性急性腎損傷豬模型的塑造，手術插管放血控制血壓5.33 kPa內，維持30 min后回輸血液完成,且研究發(fā)現(xiàn)加壓素類似物可能有助于預防失血性休克所致的急性腎損傷。

該法與臨床失血性休克致AKI的病理機制相似，可用于評價該類藥物的療效及作用機理。急性大量失血可產(chǎn)生大量氧自由基，再回血復蘇時流經(jīng)腎臟，通過氧化損傷其細胞組織結構、不斷加重腎臟損傷程度。但該模型手術操作較為復雜、失血量多，宜采用大鼠、家兔、犬等較大型實驗動物，存在較多不穩(wěn)定因素(體溫、麻醉程度、插管位置、血液流動性、血壓變化等)，有待于研究者加強其實驗方案。

1.6 其他誘導法

缺血再灌注型急性腎損傷模型還可見去甲腎上腺素滴注法、肌注甘油法、注射油酸法等。去甲腎上腺素滴注法通過使Beagle犬等動物的腎血管收縮引發(fā)[14]；肌注甘油法通過使肌肉溶血、釋放肌紅蛋白所致；注射油酸法通過自身藥物毒性使腎組織結構病變，此三者共性為誘導腎臟微循環(huán)障礙構建AKI模型。此類方法操作簡單，病程穩(wěn)定，可實行動態(tài)觀察，模擬人類腎微循環(huán)障礙所致的漸進性腎損害；但注射甘油、油酸等物質對機體毒性較大，往往并發(fā)其他臟器損害，不利于臨床藥物篩選研究，后期還需對其注射劑量、注射方式進行調整。

2 藥物誘導型

由藥物誘導的急性腎損傷模型主要以自身毒性物質與腎臟反應所致，常見造模方法：氨基糖苷類抗生素誘導法、造影劑誘導法、順鉑誘導法、氯化汞誘導法、其他藥物誘導法等，給藥以注射方式為主，實驗動物可見大小鼠、家兔和犬。

2.1 氨基糖苷類抗生素誘導法

氨基糖苷類抗生素存在較強的毒性反應，其中以腎毒性占首位。該類藥物主要以原形通過腎臟排泄，積聚于溶酶體內、與磷脂成分結合，使藥物大量蓄積在腎皮質，引起腎小管腫脹甚至急性壞死[15]。實驗常采用慶大霉素、鏈霉素、卡那霉素誘導急性腎損傷，或腹腔注射、或靜脈注射，成模率高。Salama等[16]用腹腔注射慶大霉素(50 mg/kg)連續(xù)15 d，可引起大鼠急性腎損傷，并見腎小管擴張及炎性細胞浸潤。Rodriguez等[17]驗證得生長激素釋放肽-6(growth hormone releasing peptide-6，GHRP6)與表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)可對過量卡那霉素引發(fā)的腎炎起修復保護作用。安玉香等[18]研究發(fā)現(xiàn)對豚鼠腹腔注射鏈霉素150 mg/kg，連續(xù)造模10 d后出現(xiàn)腎小球和腎小管壞死。

氨基糖苷類抗生素誘導的急性腎損傷模型均由于藥物在腎皮質的不斷蓄積而引發(fā)免疫清除損傷。此類方法可以用于臨床上氨基糖苷類抗生素致AKI的病理機制研究，但存在造模周期較長、藥物誘導多發(fā)其他病癥、毒性程度不一、劑量較難把控、實驗動物死亡率高等問題，需要實驗者仔細考量和監(jiān)測。

2.2 順鉑誘導法

順鉑(Cisplatin，CP)為抗癌類代表藥，超劑量或反復應用該藥可使20% ～ 30%患者產(chǎn)生腎毒性[19]。唐偉等[20]利用順鉑染毒方式建立AKI兔模型，腎損傷程度與染毒劑量相關，以耳緣靜脈注射1.0 mg/kg體質量連續(xù)5 d為推薦造模方式，經(jīng)機體代謝產(chǎn)生的鉑離子如何與腎組織作用還有待于進一步研究。

該模型利用順鉑的腎毒性作用可復制出與臨床類似的AKI模型，有助于研究順鉑及其衍生物對腎損傷的作用機理。順鉑致AKI模型多見嚙齒類動物，造模方式有腹腔注射與靜脈注射，以腹腔注射吸收快為首選方式。雖然順鉑誘導法被廣泛應用于AKI模型塑造，但同時面臨著一系列問題與挑戰(zhàn)，Per?e等[21]指出該模型存在腎損傷程度評價的不確定性；動物致死量的不可控性；腎損傷病理相似度的差異性等問題。此外，順鉑的毒性作用較強，還可致慢性腎衰竭乃至全身毒性。

2.3 造影劑誘導法

造影劑的自身毒性、滲透壓易使腎功能不全或糖尿病患者發(fā)生急性腎功能衰竭[22]。目前以含碘制劑致腎病為主，其高滲與低滲造影劑均可對組織造成不同程度損害。該模型通過先造成基礎腎功能不全后給予造影劑使其建模成功。Liu等[23]對SD大鼠先以股靜脈注入吲哚美辛(10 mg/kg)和L-NG-硝基精氨酸甲酯(10 mg/kg)預處理，30 min后靜脈推注低滲非離子造影劑碘己醇，結果顯示模型大鼠出現(xiàn)顯著腎小管壞死且伴隨高水平血肌酐、尿素氮。

造影劑誘導的急性腎病主要與腎缺血、腎小管毒性損傷、氧自由基損傷、炎性反應、腎內血流動力學受損等發(fā)病因素有關[24]。實驗造影劑腎病模型適用于研究造影劑腎病的病理機制及藥物的療效評價，但該模型注射造影劑前均先以藥物或手術誘導腎功能不全狀態(tài)得以成功，無法完全模擬臨床造影劑腎病患者的病變狀態(tài)，且造影劑注射后觀察時間無準確限定，對實驗評價結果存在一定誤差。

2.4 氯化汞誘導法

氯化汞是典型的腎毒性試劑，通過氯化汞誘導的腎損傷被廣泛應用于AKI模型研究。氯化汞毒性較強，造模常選用較大型動物，可見大鼠、家兔、犬。肖玉華等[25]研究發(fā)現(xiàn)給比格犬兩側肩部及股部位皮下注射1% 氯化汞溶液(以每只2.0 mg/kg連續(xù)注射7 d)可成功塑造急性腎損傷模型。

氯化汞進入機體后，降解的Hg2+可蓄積于近端腎小管上皮細胞導致急性腎小管壞死。該法操作簡單，用時較短，可呈現(xiàn)明顯的腎組織病理損傷；但該物質的毒性不僅僅限于腎臟，同時影響其他組織器官，使其模型復雜化，不利于AKI病理機制的研究。

2.5 其他藥物誘導法

由腎毒性引起腎臟急性衰竭的藥物較多，實驗造模還可見蛇毒誘導法、魚膽誘導法、氟化鈉誘導法、雙氧鈾誘導法等，由于此類造模劑價格昂貴、不易獲取，目前已較少采用。腎毒性藥物常有多器官損害表現(xiàn)，給藥劑量須嚴格篩選，實驗動物也應考慮其承受能力，推薦選用較大型動物如家兔、犬等。

3 感染型

嚴重感染和感染性休克是誘發(fā)急性腎損傷的最常見病因之一，流行病學研究顯示以膿毒癥所致的全身性炎癥感染是臨床感染性AKI的最主要誘因[26]，目前感染性腎損傷模型主要以膿毒癥展開研究，通過外源性手術或毒素致使動物感染，進而損及腎臟，實驗動物可見大鼠、小鼠、家兔、犬等。

3.1 內毒素誘導法

內毒素是革蘭陰性細菌細胞壁中的結構組分，可激活體內多種炎癥因子的釋放，進而引起機體的免疫炎癥反應。邵俊等[27]以內毒素休克誘導急性腎損傷家兔模型，通過耳緣靜脈持續(xù)緩慢勻速泵入內毒素(2.5 mL/kg)30 min左右，觀察到平均動脈壓(MAP)下降至基礎的40%時認為造模成功。

3.2 盲腸結扎穿孔術誘導法

盲腸結扎穿孔術，是建立感染性腎病模型廣泛應用的造模方法。Cai等[28]對大鼠盲腸末端和回盲瓣之間結扎，以針穿過結扎的中央段，擠出少量盲腸內容物，再將盲腸重新置入腹腔內縫合完成。通過使糞便流入腹腔致多種細菌感染腹腔引起嚴重的膿毒癥，以建立經(jīng)典膿毒癥所致的AKI模型。

感染性腎病模型以膿毒癥致全身性感染為首要代表，內毒素與盲腸結扎穿孔術是塑造膿毒癥致AKI模型的經(jīng)典方法，可為研究感染性腎病的病理機制及探索新的治療靶點提供思路和線索。但該類模型的膿毒癥僅能模擬革蘭氏陰性菌膿毒癥，其感染程度無法控制，可呈漸進性多器官病變，缺乏評價成模的標準化指標，實驗期間存在較高的手術死亡率，亟需研究者對此再行改進與規(guī)整。目前感染性急性腎損傷模型還有廣闊的發(fā)展空間，除膿毒癥感染外，免疫缺陷病、細菌性心內膜炎、瘧疾等感染性疾病也常易引發(fā)急性腎損傷，有待于深入研究。

4 小結

4.1 急性腎損傷模型特點總結

急性腎損傷的各類模型在臨床相似性、難易度、穩(wěn)定性、可行性上均各占優(yōu)勢，同時又存在模型塑造過程中的不足。缺血再灌注型以造模周期短為主要優(yōu)勢，動物選擇多樣，成模率高，以外源性手術誘導AKI模型為主，與臨床該病的發(fā)病特點尚存差異，常應用于AKI發(fā)病機制及藥物療效評價研究[29-30]；藥物誘導型以貼近臨床腎毒性藥物病理機制為主要優(yōu)勢，可靈活選用造模劑，以靜脈注射或腹腔注射完成，難度在于藥物劑量及毒性程度的把控，常選用較大型動物，多應用于腎毒性藥物的防治研究[31]；感染型以高發(fā)率膿毒癥感染為主，可促進感染性腎病的病理機制、藥物治療研究[32-33]，但目前這類模型研究較少，且操作難度、死亡率均較高，有待于進一步拓展。此三類造模方法的共同點均是加劇細胞免疫應激反應以實現(xiàn)腎組織、功能的快速紊亂。

4.2 思考

急性腎損傷，是臨床住院及重癥患者高發(fā)的一類腎病綜合征，全球發(fā)病率為2100/100萬[34]。其病死率高、并發(fā)癥多、病因復雜，開展其藥物研究十分迫切。建立合適的急性腎損傷模型有助于挖掘該病的病理機制與開拓新的治療靶點，目前的急性腎損傷模型還有待于改進：1.常用模型動物的腎組織與人體腎組織結構存在差異(以鼠、兔等為常用模型)；2.模型多從某一角度出發(fā)(急性腎損傷為復雜的臨床綜合征)；3.感染型AKI模型研究較少(僅以膿毒癥感染為主)；4.模型是否成功無統(tǒng)一標準(腎損傷程度、持續(xù)時間)等。就模型動物而言，可加大其他種源動物的研究，如實驗用小型豬，該動物的腎組織構造與人體相似；如斑馬魚，該動物體型小，結構簡單、易于操作，可實現(xiàn)整體、細胞、分子的一體化觀察，是一種興起的新型模式動物；就造模而言，急性腎損傷發(fā)病機制復雜，往往夾雜多種病因，造模時應嘗試幾種模型的結合應用；就感染性模型而言，感染病菌類型、感染部位、感染時間、感染程度等均是應投入實驗研究的重要內容；就造模成功標準而言，目前對于腎損傷標志物的建立多有不足，應與臨床監(jiān)測指標相結合，還應注意模型后期持久性、穩(wěn)定性的觀察。本文所歸納的AKI模型主要為實驗常用模型，可能存在遺漏與不足，旨在為研究者提供參考與思路，盡快實現(xiàn)急性腎損傷模型塑造的突破，為促進臨床急性腎損傷的藥物研究奠定基礎。