犬流感的流行病學(xué)研究進(jìn)展

石松平，何劍橋，丁仰保，周華波,2，崔柏楊，劉林林，余良政，陳 櫻

（1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.南寧市華波寵物醫(yī)院，南寧 530004）

犬流感（canine influenza，CI）是一種由犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV）引起的急性接觸性呼吸道傳染病。病犬臨床癥狀表現(xiàn)主要為打噴嚏、流鼻涕、咳嗽、結(jié)膜炎、發(fā)燒（＞39.5℃）和食欲下降等，病程持續(xù)大約10～12 d，不同品種、年齡和性別對(duì)該病毒均可表現(xiàn)易感。2004年，美國(guó)佛羅里達(dá)州灰犬發(fā)生未知病原感染的呼吸道疾病，“犬流感”的命名由此而產(chǎn)生。通過(guò)基因序列分析表明，該病毒與上世紀(jì)90年代在美國(guó)流行的H3N8亞型馬流感病毒（Equine influenza virus，EIV）親緣關(guān)系較近，完成了馬-犬的跨宿主傳播。緊接著，2007年韓國(guó)首次報(bào)道了禽源H3N2亞型感染犬，該病毒引發(fā)犬只出現(xiàn)以高熱、咳嗽和流鼻涕為主要特征的呼吸道癥狀，并且出現(xiàn)犬只死亡，之后該病毒迅速在亞洲和美洲出現(xiàn)，并建立了穩(wěn)定體系。除了上述提及的亞型，研究發(fā)現(xiàn)犬可以作為流感病毒中間宿主，可自然感染來(lái)自不同宿主不同亞型的流感病毒，例如人流感病毒（季節(jié)性H1N1亞型、H3N2亞型和H1N1/2009甲型流感病毒）[1-3]、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）（H5N1亞型、H5N2亞型、H9N2亞型、H10N8亞型和H6N1亞型）[4-8]和豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）（H3N2和H1N1亞型）[9-10]，甚至犬可作為流感病毒的“混合容器”產(chǎn)生新型重配病毒，如韓國(guó)報(bào)道的H3N1亞型重配病毒[11]，H3N2亞型CIV與H5N1亞型禽流感病毒重配毒株[12]，廣西發(fā)現(xiàn)的H1N1亞型SIV與禽源H3N2亞型病毒重配的H1N2亞型和H3N2亞型病毒[13]。隨著中國(guó)成為世界第三大寵物占有國(guó)，寵物犬逐漸成為流感病毒進(jìn)化和繁衍的“溫床”。盡管目前尚未有CIV跨種感染人的報(bào)道，但寵物犬的中間宿主作用和“混合容器”的角色，勢(shì)必使其在流感病毒生態(tài)循環(huán)中起到重要作用，對(duì)人類(lèi)公共衛(wèi)生造成潛在的威脅。為此，本文從CIV的流行病學(xué)及其在跨宿主傳播中的作用進(jìn)行闡述。

1 CIV的流行病學(xué)特征

1.1 H3N8亞型EIV感染犬 2004年，在美國(guó)佛羅里達(dá)州的灰獵犬中首次發(fā)現(xiàn)并分離出H3N8亞型流感病毒，部分病犬出現(xiàn)嚴(yán)重出血性氣管炎、支氣管肺炎、胸膜炎及血管炎等癥狀并伴隨稽留熱，最后全部死亡，其余病犬僅出現(xiàn)低燒、咳嗽等溫和呼吸道癥狀。至2015年，美國(guó)11個(gè)州均有報(bào)道賽犬被感染并出現(xiàn)明顯呼吸道癥狀。經(jīng)血清學(xué)調(diào)查，許多寵物犬也出現(xiàn)感染情況，證實(shí)該病毒可在不同犬種間進(jìn)行傳播。截至2009年，共有30個(gè)州發(fā)現(xiàn)寵物犬感染病例，表明該病毒已在美國(guó)寵物犬中呈流行態(tài)勢(shì)[14]。

對(duì)賽犬和寵物犬中分離所得H3N8亞型病毒毒株的基因序列分析顯示其與美國(guó)流行的H3N8亞型馬流感病毒親緣關(guān)系十分相近，因此推測(cè)該病毒可能是賽犬在比賽場(chǎng)地內(nèi)與馬直接接觸并被感染。一項(xiàng)回顧性血清學(xué)研究顯示，1998至2003年間就可能發(fā)生了跨種傳播。進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)，H3N8亞型流感病毒HA片段上裂解位點(diǎn)區(qū)域和受體位點(diǎn)結(jié)合區(qū)域的氨基酸序列突變導(dǎo)致該病毒可在犬體內(nèi)適應(yīng)性變異，并持續(xù)傳播產(chǎn)生致病性。除美國(guó)外，英國(guó)、澳大利亞和巴西有報(bào)道犬感染H3N8亞型流感病毒，血清學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性，但均未成功分離出該病毒。以上研究證據(jù)顯示，H3N8亞型流感病毒由馬傳染給犬，并在犬群中穩(wěn)定傳播，證明該病毒已突破種間屏障。

1.2 H3N2亞型AIV感染犬 2006年，我國(guó)廣東發(fā)現(xiàn)禽源H3N2亞型流感病毒感染犬。2007年，韓國(guó)學(xué)者首次報(bào)道了該病毒感染犬的事件，他們從3例患嚴(yán)重呼吸道疾病的病犬中分離出3株病毒，這些病毒的八個(gè)片段均來(lái)源于禽流感病毒，并且相互間存在極高同源性。隨后，Lee等[15]對(duì)韓國(guó)國(guó)內(nèi)5個(gè)犬養(yǎng)殖場(chǎng)、1個(gè)本地動(dòng)物市場(chǎng)和60家寵物醫(yī)院進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，829份血清樣品中，農(nóng)場(chǎng)犬的流感血清陽(yáng)性率為18.84%（68/361），犬流感（H3抗體）陽(yáng)性率為4.99%（18/361），其中曾經(jīng)暴發(fā)嚴(yán)重呼吸道疾病的犬場(chǎng)的血清陽(yáng)性率達(dá)到100%。此外寵物犬的陽(yáng)性檢出率相較農(nóng)場(chǎng)犬檢出率低，血清陽(yáng)性率和H3抗體陽(yáng)性率均為0.48%（2/419），未暴發(fā)禽源CIV感染的部分犬場(chǎng)血清陽(yáng)性率在0%～6%。這些數(shù)據(jù)表明農(nóng)場(chǎng)犬較寵物犬更易受到H3N2亞型CIV的感染。禽源H3N2犬流感病毒雖然總體檢出率較低，但在農(nóng)場(chǎng)犬和寵物犬中頻頻出現(xiàn)，且在韓國(guó)地區(qū)犬群中存在散發(fā)流行趨勢(shì)。

此外，H3N2 CIV在中國(guó)多個(gè)省份呈地方性流行。2006年～2007年，廣東省報(bào)道了該病毒，序列分析發(fā)現(xiàn)所獲得的毒株與韓國(guó)流行的禽源H3N2亞型犬流感譜系分支接近，并且證實(shí)該病毒能在犬與犬之間進(jìn)行有效傳播。此外，通過(guò)對(duì)不同犬群進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大約15%的流浪犬和5%的寵物狗的血清中含有針對(duì)H3N2 CIV的抗體[16]。隨后2009年～2012年，北京、遼寧、浙江、江蘇等地也陸續(xù)分離出與韓國(guó)和廣東高度同源的H3N2 CIV[17-20]。2012年的南京分離株與之前CIVs分離株存在一定程度的變異，和2013年黑龍江分離株同源性更高[21]。2012年2月～11月，Zhang等[22]從黑龍江和吉林24家不同寵物醫(yī)院和動(dòng)物收容所收集了723份犬血樣，其中流浪犬的H3N2亞型犬流感血清陽(yáng)性率為20.2%（45/223），寵物犬的陽(yáng)性率為33.2%（166/500），相較2010年深圳報(bào)道的H3N2犬流感血清陽(yáng)性率（6.71%，31/642）更高。2012年1月至2013年在我國(guó)北方的另一項(xiàng)寵物犬血清學(xué)調(diào)查中，H3N2亞型犬流感陽(yáng)性率為3.5%（31/882），較2007年韓國(guó)寵物犬血清陽(yáng)性率（0.48%）高，并且每個(gè)月均能檢出陽(yáng)性。另外，不同年齡犬群感染率差異顯著，2到5歲犬群H3N2亞型犬流感陽(yáng)性檢出率最高，研究推測(cè)其原因可能為該年齡段的犬有更多精力和戶(hù)外接觸時(shí)間，而性別對(duì)犬感染流感概率影響不大[1,23]。

2015年后，美國(guó)芝加哥洲及其相鄰地區(qū)的病犬中相繼檢出H3N2亞型CIV，感染病例呈暴發(fā)趨勢(shì)增長(zhǎng)，基因分析表明病毒株與2007年韓國(guó)的流行株存在高度同源性[24]。禽源H3N2亞型流感病毒經(jīng)歷將近10年的演化，在不同地區(qū)形成穩(wěn)定的譜系，并且成功完成了禽-犬的跨種傳播。

1.3 H5、H9、H10和H6亞型AIV感染犬 自從1997年香港暴發(fā)H5N1亞型高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI ）病毒感染人致死事件，時(shí)隔6年之后，2003年，該病毒在東南亞肆虐，致死人事件不斷上升[4]。在人類(lèi)暴發(fā)HPAI H5N1感染期間，泰國(guó)報(bào)道了貓和犬通過(guò)攝食HPAI H5N1感染的禽類(lèi)尸體而致死。2006年，臺(tái)灣也報(bào)道了一例犬進(jìn)食感染HAPI H5N1鴨尸體出現(xiàn)呼吸道癥狀后死亡的病例。為了證實(shí)HPAI H5N1是否能真正感染犬，Chen等[25]人采用人工感染的方式，進(jìn)一步證實(shí)犬對(duì)HPAI H5N1高度易感，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示感染犬出現(xiàn)厭食、發(fā)燒、結(jié)膜炎、呼吸困難、咳嗽等流感臨床癥狀，其中一只犬出現(xiàn)死亡。有動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明貓、犬對(duì)該病毒表現(xiàn)易感，但攻毒犬臨床癥狀僅為結(jié)膜炎和短暫體溫上升，攻毒貓除呼吸道癥狀外可檢測(cè)到鼻腔排毒，未分離出病毒[26]。到目前為止尚無(wú)犬貓間直接傳播或犬種間傳播的報(bào)道，無(wú)法驗(yàn)證犬在該亞型流感病毒傳播中起到重要作用[27]。

2009年，有研究者從中國(guó)山東的一條有明顯呼吸道癥狀的病犬中分離出一株新型H5N2亞型流感病毒，經(jīng)基因分析證實(shí)該毒株為SIV-AIV的重組毒株。研究還表明，新型重組H5N2亞型流感病毒可通過(guò)直接或間接方式感染犬，大多數(shù)犬可出現(xiàn)溫和呼吸道癥狀，如體溫短暫升高、結(jié)膜炎、流涕、鼻塞、微咳、鼻腔排毒和血清轉(zhuǎn)陽(yáng)等情況，但無(wú)病犬致死[5]。

Sun等[28]在廣西首次從犬中分離到一株H9N2亞型流感病毒，該分離株八個(gè)基因片段均來(lái)自歐亞類(lèi)禽譜系A(chǔ)IV，為五重基因重組株，與AIV H9N2存在高度同源性。研究中另一項(xiàng)對(duì)AIV H9N2的血清學(xué)試驗(yàn)顯示，2010年初～2011年末，從寵物診所和鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集的犬血清樣品中陽(yáng)性檢出率分別為20.21%（92/455）和28.98%（273/942），而2012年犬血清陽(yáng)性檢出率則高達(dá)44.85%（410/914），證實(shí)AIV H9N2感染犬并非偶發(fā)事件。此外，至2011年3月，H9N2亞型流感病毒在犬中分離率大幅上升，進(jìn)一步推測(cè)該亞型病毒宿主范圍已擴(kuò)大到犬中，這為后續(xù)防控監(jiān)測(cè)增加了難度。

2013年末，江西確診了人感染AIV H10N8并致死的病例[29]，此外，H10N8亞型流感病毒被認(rèn)為與第二波人甲型H7N9流感病毒同步暴發(fā)[30]。Su等[31]以AIV H10N8為抗原對(duì)生活在上海、廣東、浙江和江蘇等地的活禽市場(chǎng)（live poultry markets，LPMs）附近的犬進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，2357份樣品中有6份樣品的HI和MN抗體滴度均≥1∶20，3份樣品的MN抗體滴度≥1∶1280并強(qiáng)烈暗示犬曾被H10N8感染。研究證實(shí)AIV H10N8可感染犬，也進(jìn)一步證實(shí)LPMs可能是近年人感染AIV H7N9和H10N8的重要來(lái)源之一。另外，由于犬長(zhǎng)期生活在LPMs環(huán)境，使其感染新型AIV的概率上升，基于犬的中間宿主作用，不排除其在今后成為不同亞型禽流感病毒重配“溫床”的可能性。

自1972年后，AIV H6N1在臺(tái)灣本地雞群中開(kāi)始擴(kuò)散并形成穩(wěn)定循環(huán)[32]。有研究以AIV H6N1和AIV H5N2為抗原對(duì)臺(tái)灣本地犬群進(jìn)行了血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示家養(yǎng)犬和流浪犬的抗體陽(yáng)性率分別為1.1%（3/281）和3.1%（6/193），其中有1個(gè)樣品抗AIV H6N1[7]。之后，該研究還成功從一只出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸道癥狀的病犬中分離出一株H6N1亞型流感病毒，經(jīng)基因分析表明，該毒株八個(gè)基因片段均為禽源，推測(cè)禽流感病毒可能已在犬體內(nèi)存在適應(yīng)性感染。

1.4 人流感病毒感染犬 自2009年H1N1甲型流感病毒（pdm/09）在人類(lèi)大暴發(fā)后，該病毒就潛入到不同宿主體內(nèi)。有研究表明該病毒可在自然條件下感染犬，但不能在犬只間進(jìn)行有效傳播。2009年，意大利一項(xiàng)研究表明，有3%（29/964）的犬呈pdm/09抗體陽(yáng)性。到目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)pdm/09病毒在犬群中流行。此外，通過(guò)血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，犬感染H3N2亞型季節(jié)性人流感病毒和pdm/09病毒的抗體陽(yáng)性率分別達(dá)到1.5%和1.2%，其中pdm/09感染犬群無(wú)明顯年齡、性別和季節(jié)發(fā)生差異[1]。此外，通過(guò)病毒分離及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了甲型流感病毒pdm/09可感染犬，為人流感病毒感染犬提供了直接的證據(jù)。

B型流感病毒常與A型流感病毒共同呈季節(jié)性流行或局部暴發(fā)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)公共社會(huì)衛(wèi)生安全。有研究曾在海豹體內(nèi)檢出B型流感病毒。另一研究顯示，犬在攻毒或直接接觸方式下無(wú)法感染B型流感病毒，推測(cè)犬并非該亞型流感病毒的自然宿主[2]。研究還表明，人季節(jié)性H3N2亞型流感病毒相對(duì)其他流感病毒對(duì)狗更易感，不排除犬可能作為人流感病毒的中間宿主，進(jìn)而發(fā)生跨物種傳播，對(duì)公共衛(wèi)生安全造成影響。

1.5 SIV感染犬 目前，SIV流行的主要亞型有H1N1、H1N2和H3N2。關(guān)于SIV感染犬的事件鮮有報(bào)道。2013年，陳櫻等[10]從疑似呼吸道癥狀的寵物犬中分離獲得兩株CIVs，經(jīng)序列對(duì)比分析證實(shí)這兩株病毒與類(lèi)人H3N2亞型SIV有極高同源性，屬于Moscow/10/99-like譜系，首次報(bào)道了SIV感染犬的事件。此后，研究人員對(duì)廣西800份犬鼻拭子監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)多種新型重配H1N1亞型SIV感染犬的現(xiàn)象，經(jīng)序列分析證實(shí)所獲得的毒株片段均來(lái)源于SIV的不同譜系，其中HA和NA片段來(lái)源于歐亞類(lèi)禽譜系，內(nèi)部基因PB2、PB1、PA和NP均來(lái)源于pdm/09譜系，而NS基因來(lái)源古典SIV譜系，M基因分別來(lái)自歐亞類(lèi)禽和pdm/09譜系[13]。該報(bào)道再次提出了犬感染SIV的可能性，但是至于豬-犬跨宿主傳播的分子機(jī)制，目前尚不清楚。到目前為止，關(guān)于SIV在犬中流行情況知之甚少，也沒(méi)有證據(jù)證實(shí)SIV在犬群中傳播，但由于存在SIV感染人事件的報(bào)道，因此不排除這些病毒通過(guò)豬-人-犬的途徑進(jìn)行傳播。

1.6 新型重配流感病毒在犬中的發(fā)現(xiàn) 從上述的報(bào)道中，我們了解到犬可作為中間宿主感染不同宿主來(lái)源，多種亞型的流感病毒。近年來(lái)，通過(guò)血清學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)多種亞型流感病毒可以共感染犬，并在犬群中循環(huán)，這無(wú)疑為產(chǎn)生新型重配流感病毒提供了良好的條件。2010年，Song等[11]從252份犬鼻拭子中分離到一株H3N1亞型流感病毒，毒株HA基因片段與H3N2亞型CIV同源性達(dá)99.6%，其余基因片段則與pdm/09病毒高度同源（99.1%～99.9%），這株病毒感染犬后無(wú)明顯臨床癥狀，僅有輕微組織病理學(xué)變化，但病犬鼻腔中可檢測(cè)到病毒排出。2012年，Moon等[3]分離到另一株基因重組的H3N2亞型毒株（CIV/H3N2mv），其M基因來(lái)源pdm/09譜系，其他基因片段來(lái)源H3N2 CIV。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，H3N2mv可在犬體內(nèi)有效復(fù)制并造成典型臨床癥狀，引起呼吸道病理變化。除此之外，Chen等[13]發(fā)現(xiàn)H3N2 CIV部分片段與SIV重配形成了H1N1、H3N2和H1N2新型病毒，并且能在小鼠體內(nèi)較好復(fù)制，甚至造成小鼠死亡。不同宿主流感病毒感染犬的事件，增加其產(chǎn)生重配病毒的幾率。介于人與犬之間的親密關(guān)系，加強(qiáng)對(duì)CIV 的監(jiān)控對(duì)于控制犬-人跨宿主傳播具有重大意義。

2 診斷和防治

臨床中H3亞型癥狀表現(xiàn)與“犬窩咳”極為相似，H5亞型臨床癥狀輕微，而H9亞型表現(xiàn)出一定毒株特異性，因此診斷主要依循實(shí)驗(yàn)室手段，如病毒分離鑒定、RT-PCR技術(shù)、血清學(xué)診斷技術(shù)、ELISA等。目前，病毒分離培養(yǎng)是犬流感鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。一般取病犬鼻拭子或咽拭子，經(jīng)無(wú)菌處理后接種于SPF雞胚羊膜腔或尿囊腔中，3至5日可檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果，但H3亞型在雞胚中產(chǎn)量較低，同時(shí)使用MDCK（犬腎細(xì)胞）培養(yǎng)可提高分毒率。RT-PCR技術(shù)則利用流感病毒M基因的高保守性，能直接檢測(cè)出病毒基因片段，相較病毒分離培養(yǎng)高效快速，適用于任何病毒亞型的陽(yáng)性檢測(cè)，但病毒排毒期外采集的臨床樣本在使用分子技術(shù)鑒定時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性。血清學(xué)診斷中常使用HI試驗(yàn)，敏感性高，可在感染動(dòng)物出現(xiàn)臨床癥狀7天后檢測(cè)到抗體水平，是確定犬流感病毒感染的重要診斷方法。目前ELISA檢測(cè)技術(shù)主要利用NP基因診斷流感病毒感染與否，另外，有研究提出ELISA檢測(cè)的最佳敏感性?xún)H為50%，且受檢測(cè)條件（采樣時(shí)間和排毒量）限制，推測(cè)在犬群中出現(xiàn)流感暴發(fā)的情況下才具實(shí)用意義[33]。

本病目前尚無(wú)有效疫苗預(yù)防及臨床治療方法，除部分嚴(yán)重臨床癥狀病犬需針對(duì)性治療外，多數(shù)犬感染流感后預(yù)后良好。臨床常用的窄譜抗病毒藥物為金剛烷胺類(lèi)，但由于濫用或使用劑量不合理，流感病毒普遍對(duì)其產(chǎn)生一定耐藥性。部分中草藥制劑如穿心蓮、魚(yú)腥草、板藍(lán)根等也對(duì)流感具一定防治作用。另外，美國(guó)疾控中心也提出使用廣譜抗菌藥物進(jìn)行治療，以期達(dá)到更好地控制犬流感暴發(fā)。病犬診療護(hù)理期間需維持其能量攝取，增強(qiáng)免疫力，避免繼發(fā)感染，如部分呼吸道及肺部炎癥；犬舍出現(xiàn)病例時(shí)應(yīng)及時(shí)隔離防護(hù)，同時(shí)維持犬舍環(huán)境的清潔；由于流感病毒的低溫適應(yīng)性及流感暴發(fā)的季節(jié)性特點(diǎn)，還應(yīng)該對(duì)病犬和犬舍環(huán)境進(jìn)行恒溫保護(hù)。

3 展望

目前，犬群中能穩(wěn)定流行的僅有H3N8亞型和H3N2亞型流感病毒，尚未有CIV感染人事件的報(bào)道。盡管如此，近年來(lái)，不同來(lái)源不同亞型的流感病毒不斷侵入犬群，并在犬體內(nèi)產(chǎn)生了多種重配病毒，對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成了潛在威脅。2013年，H7N9亞型AIV跨種感染人事件頻頻發(fā)生，并且在家禽中廣泛流行，而且研究發(fā)現(xiàn)這些病毒已經(jīng)具有感染哺乳動(dòng)物的能力[34]。因此犬在流感病毒生態(tài)循環(huán)中所扮演的角色日益重要，掌握其流行規(guī)律和及時(shí)切斷犬-人傳播途徑，對(duì)防控流感大暴發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義和參考價(jià)值。