外泌體在藥物成癮中的作用研究進展

盧關伊，李 斐，吳 寧，李 錦

（軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，神經(jīng)精神藥理學北京市重點實驗室，北京 100850）

藥物成癮是慢性復發(fā)性的腦疾病。精神活性物質(zhì)如嗎啡、甲基苯丙胺、可卡因、酒和煙草等濫用均可導致成癮。由于藥物成癮的神經(jīng)生物學機制尚不十分清楚，目前臨床上缺乏理想的治療方法和干預手段，導致成癮者復吸率居高不下，嚴重損害身心健康，并成為沉重的社會負擔［1］。外泌體是近些年來研究的熱點，作為一種新的細胞間交流方式，可調(diào)節(jié)包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的細胞分化、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和組織器官重塑等重要生理過程［2-5］。研究表明，外泌體與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如卒中［2-3，5-6］、腦腫瘤［2-4，7］、腦血管疾?。?-5，8］、精神分裂癥［5，9］和神經(jīng)退行性疾?。?-5，10-11］等的發(fā)生發(fā)展均密切相關，且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷［10-14］和治療［11-13，15-16］中發(fā)揮重要作用。但外泌體在藥物成癮中的研究起步較晚，目前研究較少。本文以成癮性精神活性物質(zhì)分類，包括阿片類、苯丙胺類、可卡因、酒和煙草等，對外泌體在藥物成癮中的神經(jīng)生物學機制、潛在治療手段及診斷候選生物標志物等方面的研究進展進行綜述，以期為藥物成癮研究和診斷治療提供新思路。

1 外泌體概述

1983年，外泌體首次被報道。研究者發(fā)現(xiàn)，綿羊網(wǎng)織紅細胞在體外成熟過程中，會釋放囊泡狀結(jié)構(gòu)的小體［17］。1987年，JOHNSTONE等［18］將其命名為“外泌體”。外泌體是細胞外囊泡（extra-cellular vesicles，EV）的重要組成部分，但與其他EV如微囊泡（通過細胞出芽與細胞膜融合后直接脫落形成的囊泡）的形成機制不同。外泌體的形成源于細胞內(nèi)吞，是細胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體、經(jīng)多囊泡體外膜與細胞膜融合后釋放到胞外的囊泡［19-20］。此外，外泌體的大?。ㄖ睆?0～150 nm）與其他EV如微囊泡（直徑100～1000 nm）和凋亡小體（直徑100～5000 nm）存在差異，但由于結(jié)構(gòu)相似，現(xiàn)有方法提取分離得到的外泌體可能混有少量非外泌體性質(zhì)的小EV［19-20］。

多種細胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體，其可攜帶宿主細胞來源的核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等大量生物活性分子，在細胞間通訊中發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用［21-22］。外泌體主要通過以下3種形式進入靶細胞［21-23］：①細胞內(nèi)吞或直接與靶細胞融合；②外泌體表面配體直接與靶細胞膜表面受體結(jié)合；③外泌體表面蛋白經(jīng)蛋白酶水解后與靶細胞表面受體結(jié)合。外泌體這種特異識別靶細胞的功能可以避免被隨機傳送，通過膜融合特異性轉(zhuǎn)移內(nèi)含物到特定的靶細胞發(fā)揮生物學活性，參與到機體免疫應答、抗原提呈、細胞遷移、細胞分化和腫瘤侵襲等多種生理病理過程［21-24］。

2 外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)包括神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞等幾乎所有細胞均可分泌外泌體。外泌體可以作為細胞通訊的信使，參與復雜的細胞間信息交流，以促進神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、維持神經(jīng)細胞的穩(wěn)態(tài)以及調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能等［2-6］。在過去10年里，許多研究集中于外泌體內(nèi)含物生物學活性的探討，特別是外泌體內(nèi)含的微 RNA（microRNA，miRNA）［25-26］。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要通過沉默遺傳信息的翻譯而抑制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的功能［27］。外泌體miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用已被廣泛證實。研究表明，外泌體miRNA與腦腫瘤、卒中和神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關［4-12］。

外泌體廣泛存在于多種體液中，如血液、腦脊液和尿液等［12，28-29］。外泌體的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)可增強其內(nèi)含物的穩(wěn)定性，且在循環(huán)外泌體中可檢測到腦組織特異或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病特異的蛋白質(zhì)及miRNA［14，28-29］。鑒于循環(huán)外泌體具有無創(chuàng)、穩(wěn)定、特異性高等優(yōu)點，其作為診斷的候選生物標志物在神經(jīng)退行性疾?。?0-12，28，30］和腦腫瘤［14，31］等領域都有較好的進展［13，29］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中，由于血腦屏障的存在，很多藥物無法到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮藥效，使得相關疾病缺乏有效的治療手段［16，29］。外泌體作為一種納米級別的EV，可穿越血腦屏障，逃避機體免疫反應，不良反應較少，因而具有成為治療載體的潛力［16，29］。目前，已有研究利用外泌體作為載體攜帶特定的蛋白［11，16］、miRNA［11-12，15-16］及小干擾RNA［11，16，32］，在治療神經(jīng)退行性疾?。?1-12，14，30］和卒中［15-16，29］等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有較好的進展［1，16］。此外，利用干細胞來源的外泌體可保護和再生神經(jīng)元并增加突觸可塑性等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的損傷修復中也發(fā)揮重要的作用［33-35］。

3 外泌體在成癮性精神活性物質(zhì)成癮中的作用

3.1 阿片類

阿片類精神活性物質(zhì)既包括非法的毒品如海洛因，又包括合法的處方麻醉性鎮(zhèn)痛藥物如嗎啡和芬太尼等。阿片類藥物除具有鎮(zhèn)痛、麻醉、止瀉和鎮(zhèn)咳的藥理作用外，同時具有成癮性和耐受性，濫用后易產(chǎn)生依賴。阿片受體是阿片類物質(zhì)發(fā)揮獎賞作用的起始作用靶點，參與阿片類藥物成癮。因此，通過小干擾RNA干擾阿片受體相關蛋白的翻譯，可以干預阿片類藥物濫用相關的有害影響。目前，雖尚無關于外泌體直接參與阿片類藥物成癮的相關報道，但有研究者從神經(jīng)母細胞瘤分泌的外泌體中分離出來let-7家族的miRNA和其他一些被認為可以調(diào)節(jié)阿片類藥物成癮效應的miRNA分子［36］。已有研究表明，慢性嗎啡處理可時間依賴性地上調(diào)let-7表達，且下調(diào)let-7表達可降低μ亞型阿片受體水平，并減輕小鼠嗎啡慢性處理所致的鎮(zhèn)痛耐受［37］。以上研究提示，外泌體作為miRNA的載體，可能通過傳遞miRNA參與阿片類藥物的作用。據(jù)報道，利用表達神經(jīng)元特異性膜表面狂犬病毒糖蛋白肽改造后的外泌體，將μ阿片受體小干擾RNA經(jīng)靜脈給藥傳送至嗎啡條件性位置偏愛模型小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過下調(diào)大腦中μ阿片受體表達水平，降低小劑量嗎啡引起的小鼠復吸行為［38］，這為治療嗎啡成癮復發(fā)提供一種全新的治療思路，并提示對外泌體進行改造可能成為一種有效的組織特異性強和低免疫原性的靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞載體，為藥物成癮提供新的治療策略。

精神活性物質(zhì)濫用易導致人類獲得性免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染形成艾滋病。研究表明，阿片類物質(zhì)濫用會加速艾滋病患者的神經(jīng)損傷［39］。嗎啡依賴可引起HIV感染的猴基底神經(jīng)節(jié)miR-29b表達上調(diào)，神經(jīng)保護因子血小板衍生生長因子β（platelet-derived growth factor-β，PDGF-β）表達下調(diào)，并加重神經(jīng)元的損傷［40］。體外實驗結(jié)果表明，嗎啡的這一作用是由外泌體介導的，嗎啡可加重HIV反式激活蛋白Tat介導的神經(jīng)細胞毒性反應［40］。具體來講，嗎啡處理可上調(diào)HIV-tat蛋白（HIV密切相關的反式轉(zhuǎn)錄激活因子）感染的星形膠質(zhì)細胞外泌體中miR-29b的表達，且上述外泌體可被神經(jīng)元細胞內(nèi)化，引起miR-29b靶蛋白PDGF-β的表達降低，從而導致神經(jīng)元活性的降低［40］。因此，嗎啡可通過調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞外泌體miRNA，引起神經(jīng)元的損傷，但外泌體miRNA是否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷參與嗎啡成癮還需進一步研究。

3.2 苯丙胺類

以苯丙胺和甲基苯丙胺等為代表的苯丙胺類精神興奮劑，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥理作用，可引起嚴重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，包括精神異常、急性中毒、依賴和戒斷綜合征等。目前僅有1篇文獻報道采用大鼠甲基苯丙胺條件性位置偏愛模型，發(fā)現(xiàn)甲基苯丙胺組大鼠血清外泌體miRNA和海馬組織的miRNA均發(fā)生差異表達［41］。雖然差異表達的miRNA不盡相同，但KEGG分析顯示，血清外泌體miRNA和海馬組織miRNA的潛在靶點均涉及谷氨酸能突觸可塑性功能的調(diào)節(jié)。此外，該研究還在血清外泌體及海馬中發(fā)現(xiàn)與成癮密切相關的miR-181a等表達上調(diào)。SABA等［42］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔被動注射苯丙胺5 d后，小鼠海馬、伏隔核和中腦腹側(cè)區(qū)miR-181a表達顯著上調(diào)，其中以海馬變化最為明顯，且海馬神經(jīng)元多巴胺信號的激活可誘導miR-181a表達，miR-181a過度表達可通過負性調(diào)節(jié)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體亞單位2（AMPA receptor subunit 2，GluA2）的表達來調(diào)節(jié)突觸功能。因此推測，外泌體可能通過其內(nèi)含的miRNA分子（如miR-181a）調(diào)節(jié)谷氨酸能突觸可塑性參與甲基苯丙胺成癮。此外，血清外泌體可反映甲基苯丙胺成癮病變腦區(qū)的miRNA的表達變化，提示其有作為成癮診斷的候選生物標志物的潛力。另一方面，外泌體作為miRNA在外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間的特定生物載體，可能通過在外周和中樞之間相互傳遞信息介導著一種持續(xù)的相互作用，共同調(diào)節(jié)苯丙胺類藥物成癮。這些外泌體miRNA及其下游靶基因的變化，為研究苯丙胺類藥物成癮的病理機制提供了新的途徑，但還需要進一步研究。

3.3 可卡因

可卡因是從古柯葉中提取的天然的中樞興奮劑，是西方社會濫用最廣泛的毒品之一。在體內(nèi)，可卡因通過阻斷多巴胺轉(zhuǎn)運體的功能，抑制多巴胺的重攝取，導致大腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)傳遞持續(xù)興奮，使服用者產(chǎn)生欣快感并成癮［43］。目前有2項研究發(fā)現(xiàn)，可卡因可增加外泌體的釋放。研究者收集清醒小鼠腦脊液進行蛋白質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)急性可卡因給藥可使小鼠腦脊液中外泌體相關的蛋白表達增加［44］。CARONE等［45］研究發(fā)現(xiàn)，可卡因處理使膠質(zhì)母細胞瘤細胞小EV的釋放量增加，且外泌體的釋放具有時間和濃度依賴性。

目前認為，可卡因可通過降低谷氨酸轉(zhuǎn)運體1（glutamate transporter-1，GLT-1）介導的細胞外谷氨酸重攝取而影響谷氨酸突觸可塑性，這與可卡因渴求行為密切相關［46-47］。研究表明，神經(jīng)元可通過分泌外泌體將miR-124-3p轉(zhuǎn)移至星形膠質(zhì)細胞，這對維持星形膠質(zhì)細胞GLT-1蛋白表達至關重要［48］。因此推測，神經(jīng)元外泌體信號的改變對星形膠質(zhì)細胞的影響可能在可卡因成癮中發(fā)揮重要作用。采用選擇性標記神經(jīng)元外泌體報告基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠經(jīng)可卡因自身給藥訓練后，伏隔核（nucleus accumbens，NAc）內(nèi)膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元外泌體的內(nèi)化作用顯著降低，且這一現(xiàn)象可在消退訓練后逆轉(zhuǎn)［49］。上述可卡因自身給藥模型不同階段NAc內(nèi)神經(jīng)元外泌體-膠質(zhì)細胞信號的動態(tài)變化，為藥物成癮導致的膠質(zhì)細胞功能障礙提供新的見解?；诂F(xiàn)有文獻對外泌體作為miRNA有效載體的支持，可卡因暴露不僅可以增加外泌體的分泌，且可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元外泌體miRNA的釋放，影響膠質(zhì)細胞功能，參與可卡因成癮的病理過程。

3.4 乙醇

酒現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)被普遍濫用的物質(zhì)，酒的主要精神活性成分為乙醇，乙醇對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)如谷氨酸、多巴胺和內(nèi)源性阿片肽等神經(jīng)傳遞均有廣泛作用，長期過度飲酒可出現(xiàn)酒依賴綜合征，即耐受性、戒斷癥狀和沖動性覓酒行為等，且會引起周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。研究者采用鼻內(nèi)給予人干細胞來源的外泌體處理長期乙醇攝入的大鼠，發(fā)現(xiàn)其可進入大鼠腦內(nèi)并減輕乙醇誘導的神經(jīng)炎癥和氧化應激，增加NAc內(nèi)GLT-1的表達，并可顯著抑制大鼠乙醇的攝入及戒斷后的復吸［50］。有研究表明，酒精濫用會損傷膠質(zhì)細胞的功能［51］。CRENSHAW等［52］發(fā)現(xiàn)，乙醇不但顯著影響小膠質(zhì)細胞系BV2細胞形態(tài)、存活和蛋白表達，還可影響小膠質(zhì)細胞外泌體的生成及內(nèi)含蛋白的變化。最近研究發(fā)現(xiàn)，乙醇以Toll樣受體4依賴的方式增加小鼠原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞小EV的釋放及其炎癥相關蛋白（NF-κB-p65、NLRP3、胱天蛋白酶1和白細胞介素1β）及miRNA（如miR-146a，miR-182和miR-200b）的含量；通過miRNA的功能分析發(fā)現(xiàn)，變化的miRNA參與炎癥通路相關的多種基因的調(diào)控［53］。此外，上述星形膠質(zhì)細胞衍生的小EV可被新生小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元所內(nèi)化，通過增加神經(jīng)元炎癥蛋白環(huán)氧合酶2和miRNA（如miR-146a）的水平觸發(fā)神經(jīng)元凋亡［53］。以上研究表明，膠質(zhì)細胞外泌體可能通過導致神經(jīng)元功能障礙和損傷，啟動及放大神經(jīng)元炎癥反應與酒精濫用有關，但尚待進一步驗證。

目前，關于酒精調(diào)節(jié)的小EV內(nèi)含物的變化在非神經(jīng)元細胞中的作用已被廣泛證實［54-55］。酒精濫用除產(chǎn)生依賴外，酒精性肝損傷同樣是不可忽視的臨床疾病之一［56］。在酒精中毒患者和乙醇暴露的大、小鼠血漿中，均發(fā)現(xiàn)小EV釋放增加及其藥物代謝酶CYP2E1等含量顯著升高，且血漿外泌體或小EV中CYP2E1的升高可通過激活凋亡信號通路等促進肝細胞以及肝外細胞如單核細胞等死亡［55，57］。另外，循環(huán)外泌體中的miRNA（如miR-27a等）被認為是酒精性肝炎的潛在標志物［58-59］。

乙醇也是一種已知的致畸原，在懷孕期間飲酒會導致胎兒酒精綜合征。miRNA在酒精誘導的胎兒發(fā)育變化中的潛在作用已被早期的文獻所綜述［60］。目前研究者采用一種從母體血漿中分離胎兒神經(jīng)元外泌體的新方法，通過檢測外泌體內(nèi)神經(jīng)相關蛋白的改變，可在妊娠早期檢測到由于孕婦大量飲酒而造成的胎兒神經(jīng)防御功能的下降［61］，這為妊娠早期無創(chuàng)檢測胎兒大腦發(fā)育及神經(jīng)損傷提供了重要參考。綜上所述，循環(huán)外泌體及其內(nèi)含物可反映酒精引起的炎癥反應以及妊娠早期胎兒大腦的神經(jīng)發(fā)育及損傷，提示循環(huán)外泌體具有預測酒精成癮導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的生物學標志的潛力。

3.5 煙草

吸煙與多種疾病的發(fā)生相關，如呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和癌癥等。已有大量研究表明，香煙提取物處理可影響外泌體或小EV的分泌及其內(nèi)含物組成的改變［62-63］。鑒于香煙成分可直接入肺，其在慢性阻塞性肺病和肺癌的病理生理中的重要作用已被證實［64］。煙草作用于大腦的主要成分是尼古丁，可以認為吸煙成癮的實質(zhì)就是尼古丁成癮，目前僅在尼古丁處理的巨噬細胞中發(fā)現(xiàn)外泌體miR-21-3p上調(diào)，其可能通過靶向磷酸酯酶及張力蛋白同源物，增加血管平滑肌細胞的遷移和增殖，而加速動脈粥樣硬化的發(fā)展［65］。但目前尚未見尼古丁成癮與外泌體的相關研究。尼古丁的成癮性歸因于大腦中表達的神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體的激活，特別是在韁核區(qū)域［66］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠尼古丁自身給藥模型中引起韁核區(qū)四十多種miRNA的表達發(fā)生變化［67］；在另一項研究中，嚙齒類動物尼古丁的攝入與miR-542-3p水平下調(diào)及煙堿型乙酰膽堿受體β2亞基的表達增強有關［68］。越來越多的研究表明，miRNA介導的煙堿型乙酰膽堿受體表達的升高與尼古丁成癮有關，尼古丁成癮引起韁核區(qū)miRNA的表達變化是否部分通過外泌體所介導需進一步研究。

4 總結(jié)與展望

目前大量研究表明，外泌體參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展及損傷修復過程，但外泌體在藥物成癮中的神經(jīng)生物學機制及診斷治療方面的研究還相對不足，屬于嶄新的領域。初步研究提示，阿片類、苯丙胺類、可卡因、酒和煙草等成癮性精神活性物質(zhì)不但可調(diào)節(jié)外泌體的分泌，還可通過影響細胞間通訊，如通過改變外泌體內(nèi)miRNA表達及傳遞而影響神經(jīng)元炎癥、損傷和突觸可塑性等，可能在藥物成癮中扮演重要角色。此外，外泌體攜帶有益于治療的小干擾RNA可穿過血腦屏障，作為一種強有力的靶向性藥物載體，有助于減輕嗎啡成癮復吸。采用外泌體干細胞應用于酒精成癮的治療也有一定的進展。另一方面，外泌體因可透過血腦屏障并攜帶反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)生理病理狀態(tài)相關的miRNA等活性分子、且能穩(wěn)定存在于體液中的特點，使神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷方面的研究進展迅速，但目前尚無關于外泌體作為藥物成癮狀態(tài)診斷的候選生物標志物的相關文獻報道。因此，進一步深入研究外泌體的合成釋放及其介導的細胞間信息交流，將有助于闡明藥物成癮的神經(jīng)生物學機制，為其診斷治療提供新策略，具有廣闊的發(fā)展前景。