沙林染毒小鼠乙酰膽堿酯酶活性和含量與作用時間的相互關(guān)系

李 堯，黃靜宜，邢歡純，章子男，3，王 琦，王永安，楊 軍

（1.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，高毒物質(zhì)對抗藥物研究國家重點實驗室，北京 100850；2.中國人民解放軍32292部隊，黑龍江 牡丹江 157000；3.中國人民解放軍95865部隊，北京 102200；4.中國人民解放軍32265部隊，廣東 廣州 510000）

沙林（sarin），全稱甲氟膦酸異丙酯，屬于神經(jīng)性毒劑，可以通過呼吸道或皮膚黏膜侵入人體，速殺性極強，極少量沾染后數(shù)分鐘之內(nèi)導(dǎo)致人員傷亡。1939年由德國合成并正式裝備部隊，二戰(zhàn)后在美國和前蘇聯(lián)等軍事大國的化學(xué)武器庫中大量貯存［1-2］，也是迄今使用最多、造成傷亡最大的神經(jīng)毒劑。兩伊戰(zhàn)爭、1995年日本東京地鐵毒氣事件以及2013年敘利亞毒氣彈事件中均使用了沙林，造成大量人員傷亡［3-5］。

大量研究結(jié)果已證實，中樞及外周乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）與神經(jīng)性毒劑相互作用形成膦?；憠A酯酶，使其失去水解乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的能力，造成神經(jīng)遞質(zhì)在體內(nèi)的堆積，進一步引發(fā)膽堿能系統(tǒng)功能亢進是神經(jīng)性毒劑中毒的主要原因［6-7］。對中樞和外周AChE與沙林之間的量效關(guān)系，動物染毒后毒劑在體內(nèi)隨時間的變化，以及毒劑分子的實際起效劑量與總?cè)径緞┝恐g的關(guān)系鮮有報道。本研究選擇KM小鼠作為研究對象，觀察不同劑量沙林染毒小鼠中樞和外周AChE含量和活性隨時間的變化，探討其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑和儀器

KM小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購自北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（京）2016-0011。

沙林由陸軍防化學(xué)院合成，純度≥95%；硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine，ATCH）、二硫基雙硝基苯甲酸（dithiobisnitrobenzoate，DTNB）、Tris堿及Triton X-100均購自美國Sigma公司；小鼠AChE含量測定ELISA試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；所有化學(xué)試劑均為分析純。

高速低溫離心機（3-18K，美國Sigma公司）；酶標儀（VERSA max，美國MD公司）；高速低溫組織研磨儀（KZ-III-F，武漢塞維爾生物科技有限公司）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080，上海一恒科技有限公司）；渦旋儀（Ql-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 EIIman法測定小鼠腦和外周血AChE活性［8］

230只小鼠，按體質(zhì)量隨機分為23組，每組10只。頸部sc給予沙林100，200，250和320 μg·kg-1，染毒前記錄各組體質(zhì)量，染毒后不同時間點（10 min，1 h，4 h，24 h，48 h和72 h）收集血液及全腦，并記錄腦重。外周血液樣品按照1：100加入去離子水，渦旋混勻；腦樣研磨去除所沾血液后記錄研磨后的重量，加入膽堿酯酶提取液勻漿1.3 mL，離心10 min（4℃，12 000×g），上清液按照1：25加入PBS，渦旋混勻。處理后的外周血液樣品和全腦樣品加入96孔板，每個樣品設(shè)定6復(fù)孔：前3孔加入80 μL PBS，后3孔加入50 μL PBS和30 μL ATCH（含0.086% ATCH的PBS溶液）。離心1 min（4℃，1000×g）去除孔內(nèi)氣泡，37℃恒溫箱中孵育30 min，各孔加入20 μL DTNB（含0.03% DTNB的PBS溶液），在酶標儀415 nm測定各孔吸光度（A415nm）值，計算腦和外周血AChE活性抑制率。抑制率（%）=1-染毒組A415nm/正常對照組A415nm。

1.3 ELISA法測定小鼠腦和外周血AChE含量

收集到的外周血離心15 min（4℃，2000×g）得血清；全腦樣品為1.4中經(jīng)PBS稀釋后的上清液。在ELISA酶標板中依次加入濃度為0，12.5，25，50，100和200 nmol·L-1的標準品50 μL，每個標準品設(shè)置3復(fù)孔，各孔加入酶標試劑100 μL，粘貼封板膜并放入37℃恒溫箱中孵育60 min。棄去孔內(nèi)液體，用洗滌液重復(fù)清洗5次，各孔依次加入50 μL顯色劑A和50 μL顯色劑B，37℃恒溫箱中孵育15 min，各孔加入50 μL終止液，在酶標儀下450 nm測定各孔A450nm值。以標準孔濃度為橫坐標，A450nm值為縱坐標，做標準曲線并得出回歸方程。外周血清樣品和全腦樣品加樣及檢測步驟同標準品，將樣品A450nm值帶入回歸方程，計算得AChE濃度。

1.4 小鼠腦和外周血沙林的消耗量

有研究表明，在分子層面上抑制1個酶分子僅需消耗1個毒劑分子［9］，因此，可以結(jié)合Ellman法和ELISA所得數(shù)據(jù)，計算得到不同劑量沙林在腦和外周血的理論消耗量及其占給予動物的毒劑總劑量之間的比例。具體計算公式如下：

式中，N為腦或血內(nèi)與AChE結(jié)合的沙林占染毒劑量的百分比，c為ELISA所測腦或血中AChE含量（nmol·L-1），I為 Ellman 法計算的腦或血中AChE抑制率，S為小鼠腦系數(shù)，D為對應(yīng)中毒程度下的沙林劑量（μg·kg-1），Mr為沙林的分子質(zhì)量。式（1）中1.3為制備腦樣品時加入的液體體積（mL）；式（2）中5.83和100為每100 g小鼠含5.83 mL血液的理論值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 沙林對小鼠體質(zhì)量、腦重和腦系數(shù)的影響

如圖1所示，不同劑量沙林染毒后，在72 h內(nèi)各組體質(zhì)量（圖1A）、腦重（圖1B）和腦系數(shù)（圖1C）與正常對照組之間均未見明顯變化，提示染毒后小鼠未形成明顯的腦萎縮。各組體質(zhì)量均呈增長趨勢，但在4 h出現(xiàn)一定的降低。320 μg·kg-1組小鼠在染毒10 min內(nèi)全部死亡。

2.2 沙林對小鼠腦和外周血AChE活性時效和量效的作用

沙林對小鼠外周血AChE的抑制作用見圖2A。從沙林抑制AChE活性的劑量-效應(yīng)關(guān)系方面，在染毒72 h內(nèi)，沙林200和250 μg·kg-1組抑制率在相同時間點無明顯差異，250 μg·kg-1在48 h后抑制率與其他各組間無明顯差異。從沙林抑制AChE活性的時間-效應(yīng)關(guān)系方面，與同組10 min時的結(jié)果比較，隨著染毒后時間的延長，不同劑量沙林對外周血AChE抑制率均呈現(xiàn)明顯下降趨勢，其中100 μg·kg-1組在1 h即出現(xiàn)明顯差異（29.17%，P＜0.01），200和250 μg·kg-1組在4 h出現(xiàn)明顯差異（P＜0.01）。

沙林對腦中AChE的抑制作用見圖2B。與同組10 min比較，沙林100和200 μg·kg-1組4 h內(nèi)抑制率隨染毒時間延長逐漸升高，其中100 μg·kg-1組在1 h即出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），200 μg·kg-1組在4 h出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而250 μg·kg-1組4 h內(nèi)抑制率未出現(xiàn)明顯變化。與4 h相比，各染毒組均在24 h出現(xiàn)明顯的下降（P＜0.01），形成波谷；在48 h又出現(xiàn)比較明顯的升高（P＜0.01），形成除4 h外的第2個波峰；隨后在72 h各組均出現(xiàn)明顯下降（P＜0.01）。此外，在致死劑量下（320 μg·kg-1），沙林對外周血AChE抑制率為98%，對腦中AChE抑制率為96%，與250 μg·kg-1組無差異。

Fig.1 Effect of sarin exposure on body mass（A），brain mass（B）and brain coefficient（C）in mice.Mice were subcutaneously injected with saline（normal control group）or sarin 100，200 and 250 μg·kg-1for 10 min，1 h，4 h，24 h，48 h or 72 h.Brain coefficient=brain mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=10.

2.3 沙林對小鼠腦和外周血AChE含量時效和量效的作用

通過ELISA得AChE的標準曲線為c=105.99A450nm-4.3904，c為濃度（nmol·L-1），r2=0.9994。利用該標準曲線計算小鼠腦和外周血AChE含量。從表1可見，與正常對照組相比，染毒72 h內(nèi)沙林100和200 μg·kg-1組外周血中AChE含量在10 min，1 h和4 h明顯降低（P＜0.01）；250 μg·kg-1組在10 min和1 h明顯降低（P＜0.01）。

Fig.2 Inhibition of sarin on acetyIchoIinesterase（AChE）activity in bIood（A）and brain（B）of mice.See Fig.1 for the mouse treatment.Inhibitory rate of AChE（%）=（1-A415 nmof experiment group/A415 nmof normal group）.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 10 min exposure in each sarin dose group.

從表2中可以看到，與正常對照組相比，染毒72 h內(nèi)100和200 μg·kg-1組腦內(nèi)AChE含量在4 h后顯著降低（P＜0.01）；250 μg·kg-1組在1 h后顯著降低（P＜0.01）；各組在72 h后均與正常對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4 小鼠腦和外周血沙林的消耗量

對染毒后不同時間沙林的實際消耗量及其占染毒總量的比例作圖，從圖3可見，各組與本組10 min相比，染毒72 h內(nèi)100和200 μg·kg-1組外周血及腦內(nèi)沙林消耗量均在1 h后下降（P＜0.05）；250 μg·kg-1組血和腦內(nèi)沙林消耗量均在24 h后下降（P＜0.01）。

從表3中可以看到，各組與本組10 min相比，染毒72 h內(nèi)100和200 μg·kg-1組血內(nèi)與沙林結(jié)合的AChE在1 h后明顯下降（P＜0.01）；250 μg·kg-1組在24 h后明顯下降（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of sarin on AChE content in peripheraI bIood of mice

Tab.2 Effect of sarin on AChE content in brain tissue of mice

Fig.3 Percentage of sarin binding to AChE in peripheraI bIood and brain tissue of mice at different time points after exposure.See Fig.1 for the mouse treatment.Nbrain=（cbrain×1.3×Ibrain×S）/（D/Mr）×100%；Nblood=（cblood×Iblood×5.85）/（D/Mr×100）×100%.N：effective dose of sarin in brain or peripheral blood；c：the content of AChE in brain or peripheral blood determined by ELISA；I：the inhibitory rate of AChE in brain or peripheral blood detected by Ellman method；S：brain coefficient；D：the total dose of sarin；Mr：molecular mass of sarin.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 10 min exposure in respective dose group.

Tab.3 Consumption of AChE in peripheraI bIood of mice

由表4中可見，各組與本組10 min相比，染毒72 h內(nèi)100 μg·kg-1組腦內(nèi)與沙林結(jié)合的AChE在1 h后明顯上升（P＜0.01），200和250 μg·kg-1組在24 h后明顯下降（P＜0.01）。

Tab.4 Consumption of AChE in brain tissue of mice

3 討論

AChE分子的活性中心由絲氨酸、組氨酸和谷氨酸所構(gòu)成［10］。當毒劑分子進入AChE活性中心后，絲氨酸的羥基會進攻毒劑分子的磷原子形成三角雙錐過度態(tài)，神經(jīng)性毒劑的離去基團離去后形成磷?；憠A酯酶［9］。隨著沙林對小鼠染毒時間的延長，磷酰化膽堿酯酶會逐漸出現(xiàn)脫烷基化反應(yīng)，使得AChE永久地失去活性，成為“老化酶”［11-12］。不同神經(jīng)性毒劑的半老化時間相差極大，如梭曼為6.3 min［13］，沙林為8.7 h［14］，VX為1.5 d［15］。與梭曼和VX相比，本研究選用的沙林老化時間較為居中。結(jié)合經(jīng)典的Ellman法和ELISA檢測AChE的活性和含量，探究中樞和外周AChE隨時間變化受到沙林的抑制作用。

酶抑制率是反映毒劑對染毒動物影響的核心生化指標。本研究結(jié)果顯示，在相同劑量染毒條件下，染毒初期（1 h）內(nèi)中樞的抑制率明顯低于外周血的抑制率；隨著染毒時間的延長，抑制率趨于一致?？赡茉驗樵谌径境跗?，毒劑分子穿透血腦屏障進入中樞較慢，因此腦內(nèi)外形成了較為明顯的抑制率差異；而經(jīng)過長時間的循環(huán)、代謝后，血腦屏障內(nèi)外達到了一個動態(tài)的平衡，抑制率趨于一致。此外，當抑制率大幅降低時，酶的含量同步恢復(fù)正常水平；而當酶抑制反復(fù)波動時，酶含量同時處于低含量狀態(tài)。同時，即便在250 μg·kg-1組中，作用于外周血和腦部的毒劑消耗量也僅占毒劑總劑量的4%，表明還有大量的毒劑并未參與反應(yīng)。結(jié)合上文所述，3組毒劑對中樞AChE活性的影響在48 h均出現(xiàn)抑制率增加，這可能與在體內(nèi)某些組織形成的NA“儲存庫”有關(guān)，毒劑分子并非與酶結(jié)合后其余的分子在體內(nèi)被降低，依然有部分在保存活性的狀態(tài)下儲存在體內(nèi)，隨著染毒時間的延長在體內(nèi)經(jīng)二次釋放進入中樞［16］。

綜上所述，通過對不同染毒劑量不同時間點內(nèi)小鼠的中樞和外周AChE活性和含量的檢測，初步總結(jié)為以下規(guī)律：①體質(zhì)量、抑制率和AChE含量之間有一定的相關(guān)性，3個指標可以在一定程度上相互佐證，當腦AChE抑制達到高峰時，體質(zhì)量均出現(xiàn)一定程度的下降，而此時AChE的含量也相應(yīng)降低；②從AChE抑制率的數(shù)據(jù)可直觀看出，雖然外周的抑制率在持續(xù)的下降，但中樞依然會在4和48 h之間形成2次抑制高峰；③從AChE的含量推算得知，沙林的理論消耗量極低，約為0.1～1 nmol·L-1之間，僅占總?cè)径緞┝康?%，而近96%的沙林依然殘留在體內(nèi)，部分沙林可能依然保留活性并未降解。結(jié)合上述規(guī)律，建議在控制沙林引發(fā)的急性中毒癥狀后，至少48 h內(nèi)多次給予相應(yīng)劑量的抗神經(jīng)性毒劑藥物，以清除體內(nèi)未與AChE結(jié)合的沙林。