川芎嗪改善缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠急性腎損傷

王樹森，鄭 越

（1.河北北方學(xué)院藥學(xué)院，河北 張家口 075000；2.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)勤部，北京100089）

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是常見的臨床綜合征之一，已成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)公共衛(wèi)生問題。FENG等［1］在一項(xiàng)納入765項(xiàng)研究、樣本量超過7700萬（迄今為止最大）的AKI薈萃（Meta）分析顯示，住院患者AKI發(fā)病率和病死率均為21%。因此，AKI的發(fā)病機(jī)制及其治療方法的探索是近年來研究的熱點(diǎn)之一，并具有重要的臨床和社會(huì)意義。

目前認(rèn)為，AKI主要與血流動(dòng)力學(xué)紊亂、內(nèi)皮損傷、上皮細(xì)胞損傷以及這些因素之間復(fù)雜的相互作用而導(dǎo)致的強(qiáng)烈促炎狀態(tài)有關(guān)［2］。導(dǎo)致AKI的原因有多種，其中腎缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是一個(gè)重要原因［3］。川芎是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，具有活血化瘀、行氣止痛的作用，川芎的主要有效化學(xué)成分為川芎嗪（tertramethylpyrazine，TMP）。TMP可有效治療腦I/R損傷，并且已經(jīng)廣泛用于治療血管疾病［3］。TMP不僅可以抑制細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，清除氧自由基，提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase activity，SOD）活性，還可調(diào)節(jié)血液流變的穩(wěn)定性［3-5］。研究報(bào)道，TMP可通過增加線粒體超氧化物歧化酶活性減輕細(xì)胞損傷［6］。關(guān)于AKI的發(fā)病機(jī)制有多種，ISHIMOTO等［7-8］報(bào)道，線粒體自噬可以在AKI中發(fā)生。線粒體自噬主要通過巨自噬清除多余和受損的線粒體。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，磷酸酶及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologues，PTEN）誘導(dǎo)的激酶 1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/E3泛素連接酶（Parkin）信號(hào)通路是參與哺乳動(dòng)物線粒體自噬調(diào)控的主要機(jī)制之一。Parkin由PINK1激活后，轉(zhuǎn)移至損傷線粒體，激活線粒體自噬，對(duì)受損線粒體清除并對(duì)線粒體進(jìn)行質(zhì)量控制，維持腎細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)［9］。目前，對(duì)腎病線粒體的研究少見報(bào)道，且一些針對(duì)線粒體的藥物已經(jīng)在其他領(lǐng)域得到應(yīng)用。本課題組前期研究表明，TMP可以改善I/R導(dǎo)致的AKI，但其機(jī)制尚未明確［25］。因此，本研究探討TMP改善I/R及與線粒體自噬的相關(guān)性，為TMP更好地應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和主要儀器

SPF級(jí)Wistar大鼠48只（體質(zhì)量250～320 g），購(gòu)于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心〔SCXK（遼）2015-0001〕，大鼠在通風(fēng)良好、溫度20～25℃、濕度50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲食飲水。鹽酸TMP注射液購(gòu)于北京市永康藥業(yè)有限公司（H11020960）。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司；HE染色試劑盒和DAB顯色液購(gòu)自上海碧云天生物公司；兔抗大鼠PINK1多抗（一抗）、兔抗大鼠Parkin多抗（一抗）、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗）和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；血清肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測(cè)定試劑盒及SOD活性測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成海浩生物科技有限公司。酶標(biāo)儀（680，美國(guó)Bio-Rad公司）；包埋機(jī)（JB-L5）和切片機(jī)（RM 2126）（德國(guó)徠卡有限公司）；組織處理器（美天旎gentle MACS，上海賓智科技有限公司）；全自動(dòng)生化分析儀（7600型，日本日立公司）。

1.2 大鼠急性腎損傷模型制備

48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只，分別為正常對(duì)照組、模型組、模型+TMP（10，15和20 mg·kg-1）組及正常+TMP（15 mg·kg-1）組。正常對(duì)照組僅開腹刺激雙側(cè)腎，開腹夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min再灌注30 min誘導(dǎo)大鼠AKI模型；模型+TMP組開腹夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min再灌注30 min后一次性ip給予不同濃度TMP；正常+TMP（15 mg·kg-1）組開腹刺激雙側(cè)腎臟75 min后一次性ip給予TMP15 mg·kg-1。各組縫合關(guān)腹24 h后，腹主動(dòng)脈取血，將大鼠雙側(cè)腎完全剪下，部分腎組織固定于4%多聚甲醛中，其余凍存于-80℃超低溫冰箱用于檢測(cè)PINK1和Parkin蛋白。

1.3 血清Cr和BUN含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取大鼠腎動(dòng)脈血，4℃，2000×g離心，取上清。肌氨酸氧化酶法測(cè)定血清Cr含量，尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定BUN含量。使用日立7600型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。

1.4 血清TNF- α含量、腎組織SOD活性和MDA含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取大鼠腎動(dòng)脈血，4℃，2000×g離心，取上清。從-80℃冰箱內(nèi)取出腎組織標(biāo)本，稱取0.5 g，在冰上用小剪刀剪開腎組織，按腎組織∶水=1∶9（V/V）的比例置于0℃生理鹽水4.5 mL中，制備10%腎組織勻漿。ELISA法測(cè)定血清中TNF-α含量，WST-1法測(cè)定腎組織勻漿中SOD活性，TBA法測(cè)定腎組織勻漿中MDA含量。

1.5 HE染色檢測(cè)腎組織病理變化

取相同部位腎組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片機(jī)切至4 μm的切片，常規(guī)HE染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平

取腎組織石蠟切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟修復(fù)后，切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫15 min，加入兔抗大鼠PINK1多抗或兔抗大鼠Parkin多抗（一抗，稀釋倍數(shù)均為1∶65），4℃孵育過夜；洗滌后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（二抗），37℃靜置20 min；洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵蛋白素工作液，37℃作用15 min；洗滌后滴加DAB顯色液避光顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。顯微鏡拍照，觀察記錄。陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)參照XU等［26］方法，采用圖像分析軟件Image-pro Plus對(duì)PINK1和Parkin蛋白水平進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TMP對(duì)I/R致AKI模型大鼠腎功能和氧化應(yīng)激的影響

模型組大鼠血清Cr和BUN較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.01）；腎組織SOD活性降低（P＜0.01），MDA含量升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1組大鼠血清Cr和BUN顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）；腎組織SOD活性增強(qiáng)（P＜0.01），MDA含量降低（P＜0.01），提示TMP可顯著改善AKI模型大鼠的腎功能和氧化應(yīng)激反應(yīng)。正常+TMP 15 mg·kg-1組上述指標(biāo)與正常對(duì)照組相比，無明顯變化（表1）。

2.2 TMP對(duì)I/R致AKI模型大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的影響

如圖1所示，正常對(duì)照組大鼠腎組織中腎細(xì)胞排列整齊，腎小管結(jié)構(gòu)完整；模型組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性，刷狀緣脫落，腎小管管腔中存在大量蛋白管型等；模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1組蛋白管型和細(xì)胞壞死范圍均明顯減少，部分可見雙層新生細(xì)胞，表明TMP能顯著改善大鼠AKI。正常+TMP 15組腎組織中腎細(xì)胞排列整齊，腎小管結(jié)構(gòu)完整，表明TMP對(duì)正常大鼠腎組織無副作用。

2.3 TMP對(duì)I/R致AKI模型大鼠血清TNF- α水平的影響

模型組大鼠血清TNF-α含量較正常對(duì)照組顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1組血清TNF-α含量顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。正常+TMP 15 mg·kg-1組與正常對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

Fig.1 Effect of TMP on kidney histopathoIogicaI changes in I/R-induced AKI modeI rats by HE staining.See Tab.1 for the rat treatment.The black arrow shows protein tube type；the red arrow shows double-layered newborn cells.

Fig.2 Effect of TMP on serum tumor necrosis factor- α（TNF- α） content of I/R-induced AKI modeI rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Tab.1 Effect of tertramethyIpyrazine（TMP） on IeveIs of serum creatinine（Cr）,bIood urea nitrogen（BUN）,superoxide dismutase activity（SOD）and maIondiaIdehyde（MDA）content in kidney tissue of ischemia/reperfusion（I/R）-induced acute kidney injury（AKI）modeI rats

2.4 TMP對(duì)I/R致AKI模型大鼠腎組織PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平的影響

如圖3所示，正常對(duì)照組大鼠腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)完整，僅見少量PINK1蛋白表達(dá)，且主要表達(dá)于胞漿；模型組大鼠腎組織中PINK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.01），腎小管結(jié)構(gòu)不完整細(xì)胞排列紊亂；與模型組比較，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1組PINK1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），其中15mg·kg-1組升高最明顯，同時(shí)腎細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)明顯改善。正常+TMP 15 mg·kg-1組腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，僅見少量PINK1蛋白表達(dá)。

Fig.3 Effect of TMP on protein expression of induced putative kinase 1（PINK1）in I/R induced AKI modeI rats observed by immuno-histochemistry.See Tab.1 for the rat treatment.IA：integrated absorbance.The red arrow shows PINK1 positive staining.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

如圖4所示，正常對(duì)照組大鼠腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)完整，僅見少量Parkin蛋白表達(dá)，且主要表達(dá)于胞漿；模型組大鼠腎組織中Parkin蛋白陽(yáng)性表達(dá)較正常對(duì)照組顯著減少（P＜0.01），腎小管結(jié)構(gòu)不完整細(xì)胞排列紊亂；與模型組比較，模型+TMP 10，15和20 mg·kg-1組Parkin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），其中15 mg·kg-1組升高最明顯，同時(shí)腎細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯改善。正常+TMP 15 mg·kg-1組腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，僅見少量Parkin蛋白表達(dá)。

Fig.4 Effect of TMP on protein expression of Parkin in I/R induced AKI modeI rats observed by immunohistochemistry.See Tab.1 for the rat treatment.The red arrow shows Parkin positive staining.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=8.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

AKI是一種臨床常見危重癥，是住院患者較為嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，在臨床危重患者中的發(fā)病率達(dá)＞21%且死亡率較高［10-12］。川芎的主要成分TMP對(duì)腎I/R損傷等具有明顯的療效，與傳統(tǒng)中醫(yī)記載的川芎具有活血化瘀功效一致?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，TMP對(duì)I/R導(dǎo)致的AKI具有顯著的修復(fù)和保護(hù)作用。

血清Cr和BUN是公認(rèn)的衡量腎損傷程度的指標(biāo)，正常情況下其含量較低，但在腎功能受損時(shí)含量顯著升高。組織勻漿中SOD活性和MDA含量與腎損傷程度相關(guān)，通過檢測(cè)SOD和MDA的水平也可以反映腎損傷的程度［13-16］。TNF-α是一種細(xì)胞活化產(chǎn)生的細(xì)胞因子，廣泛參與機(jī)體的細(xì)胞免疫、炎癥反應(yīng)以及腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控，TNF-α可使內(nèi)皮素合成增加，內(nèi)皮素可引起腎小球?yàn)V過率和腎血流量顯著下降和減少。因此，TNF-α含量可反映腎缺血情況，進(jìn)而可間接評(píng)估AKI的嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果顯示，AKI模型大鼠腎細(xì)胞病變明顯，腎小管細(xì)胞排列紊亂，可見大量蛋白管型，同時(shí)血清Cr，BUN和TNF-α水平升高，表明AKI模型大鼠腎功能受損。TMP能顯著降低AKI模型大鼠血清Cr，BUN和TNF-α水平，明顯改善AKI的病理，升高組織勻漿中SOD活性，同時(shí)降低MDA水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腎細(xì)胞的進(jìn)一步損傷。此研究結(jié)果與王娜等［17］研究結(jié)果一致。

線粒體是機(jī)體重要的細(xì)胞器。目前研究表明，細(xì)胞凋亡、橫紋肌溶解和I/R損傷等機(jī)制與AKI密切相關(guān)［8，18］。THOMAS等［9］研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是腎病發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要因素。線粒體功能障礙時(shí)，產(chǎn)生活性氧，釋放某種活性物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者均可促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展［7，20］。這很可能是誘導(dǎo)腎小管細(xì)胞損傷的重要原因［21］。線粒體作為ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，也易發(fā)生氧化損傷和應(yīng)激［22］，均是加重AKI的關(guān)鍵因素。因此，及時(shí)清除受損的線粒體是一種有效的保護(hù)途徑。研究報(bào)道，PINKl/Parkin途徑是介導(dǎo)線粒體自噬的主要信號(hào)通路［23-24］。TMP作為一種單體成分，闡明其確切的靶點(diǎn)對(duì)治療AKI藥物的開發(fā)也有重要意義。本研究結(jié)果顯示，TMP可以上調(diào)AKI模型大鼠腎組織PINK1和Parkin蛋白的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果也顯示，AKI模型組腎組織PINK1和Parkin蛋白表達(dá)極少，TMP可以上調(diào)PINK1和Parkin蛋白表達(dá)水平，從而促進(jìn)線粒體自噬，發(fā)揮腎保護(hù)作用。

綜上所述，TMP對(duì)I/R誘導(dǎo)的AKI具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激、上調(diào)PINK1和Parkin蛋白表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步明確TMP保護(hù)AKI的作用機(jī)制，將為TMP用于AKI的治療提供理論依據(jù)。