貓爪草總皂苷通過下調(diào)信號(hào)素4D表達(dá)抑制人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖

童曄玲，任澤明，陳 璇，陳思思，朱佳依，戴關(guān)海

（浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310007）

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中80%～85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其惡性程度高，生物學(xué)特性復(fù)雜，且預(yù)后差，缺少早期診斷及有效的治療手段，5年生存率＜15%［1］。西醫(yī)治療NSCLC以手術(shù)、放化療和靶向治療為主。中醫(yī)藥治療有其獨(dú)特的優(yōu)勢，從中草藥中篩選有效的、靶向性高的腫瘤防治藥物是近年來的研究熱點(diǎn)。

中藥貓爪草（Ranunculus ternatus Thunb.）性溫，味甘、辛，入肝、肺經(jīng)，具有化痰散結(jié)、解毒消腫等功效，臨床用于治療瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷等［2］。近年來，貓爪草在中醫(yī)臨床上用于治療腫瘤，對(duì)肺癌、淋巴癌、甲狀腺瘤和乳腺腫瘤等均有較好的治療效果。貓爪草總皂苷（total saponin of R.ternatus，TSRT）和多糖是其主要活性成分，對(duì)人胃癌BGC823細(xì)胞［3］、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞［4］和肝癌H22細(xì)胞［5］等生長均有較好的抑制作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TSRT體外能較好地抑制人NSCLC A549和NCI-H460細(xì)胞的增殖，體內(nèi)能有效抑制A549裸鼠移植瘤生長［6-8］，并通過高通量測序技術(shù)檢測TSRT治療NSCLC A549細(xì)胞的相關(guān)基因，篩選差異表達(dá)基因，結(jié)合GO功能分析、Pathway富集分析、熒光定量PCR驗(yàn)證，最終聚焦到信號(hào)素4D（semaphorin 4D，Sema4D）。本研究觀察TSRT對(duì)Sema4D過表達(dá)慢病毒感染的A549細(xì)胞增殖的影響，并初步闡明其抗NSCLC的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

人NSCLC A549細(xì)胞，來源于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶（含0.02% EDTA）和PBS購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司；Sema4D過表達(dá)慢病毒載體（LV-Sema4D）和陰性對(duì)照慢病毒載體（LV-negative control，LV-NC）委托吉瑪制藥技術(shù)有限公司（上海）合成；Trizol購于美國Invitrogen公司；異丙醇、正丁醇和石油醚購于成都市科龍化工試劑廠；三氯甲烷購于南京化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇購于安徽安特食品股份有限 公 司 ；Sema4D、叢 狀 蛋 白 B1（PlexinB1，PlxnB1）、酪氨酸蛋白激酶（CENP-meta，c-Met）和真核翻譯延伸因子1α（eukaryotic translation elongation factor-1α，EF-1α）引物購于生工生物工程（上海）股份有限公司；逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑盒購于日本Takara公司；全蛋白提取試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；WES全自動(dòng)蛋白定量分析試劑盒（12～230 ku）購于美國Protein Simple公司；兔抗人Sema4D，PlxnB1和c-Met單克隆抗體購于英國Abcam公司；兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體購于美國Proteintech公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體和嘌呤霉素購于碧云天生物技術(shù)公司；Triton X-100和牛血清白蛋白購于上海澤衡生物技術(shù)有限公司；多聚甲醛、DAPI染色液和抗熒光淬滅封片劑購于博士德生物工程有限公司。

3111型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；ECLIPSE Ti型倒置熒光顯微鏡，日本Nikon公司；Centrifuge 5810R低溫離心機(jī)，德國Eppendorf公司；HR40-Ⅱ-A2型醫(yī)用凈化工作臺(tái)，青島海爾特種電器有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Costar公司；xCELLigence RTCA DP多功能實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀，艾森生物（杭州）有限公司；E-Plate 16檢測板，艾森生物（杭州）有限公司；7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國ABI公司；Nanodrop2000核酸蛋白質(zhì)定量儀、超低溫冰箱，美國Thermo公司；WES全自動(dòng)蛋白定量分析儀，美國Protein Simple公司；LSM800激光共聚焦顯微鏡，德國Zeiss公司。

1.2 藥物和TSRT的制備

貓爪草購于華東醫(yī)藥股份有限公司，經(jīng)鑒定為毛茛科植物小毛茛的干燥塊根。貓爪草粉碎成粗顆粒，加入6倍量85%乙醇提取3 h；過濾，濾液減壓回收乙醇，用石油醚萃取2次；再以水飽和正丁醇萃取3次，正丁醇萃取液用0.1 mol·L-1NaOH萃取2次，正丁醇液回收至干，得總皂苷；以人參皂苷Rb1為對(duì)照品測得總皂苷含量為62.33%。臨用前用培養(yǎng)液溶解，過濾除菌，4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建Sema4D過表達(dá)慢病毒載體LV-Sema4D（3×1011TU·L-1）及陰性對(duì)照慢病毒載體LV-NC（9×1011TU·L-1），A549細(xì)胞按5×107L-1，每孔500 μL接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后以最佳病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）=10加入過表達(dá)慢病毒及陰性對(duì)照病毒感染A549細(xì)胞，并加入聚凝胺Polybrene 5 mg·L-1以增加感染效率。24 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。用嘌呤霉素1.0 mg·L-1連續(xù)篩選14 d得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分4組：感染Sema4D過表達(dá)慢病毒的A549細(xì)胞為過表達(dá)組（LV-Sema4D組），感染Sema4D過表達(dá)慢病毒的A549細(xì)胞加入TSRT 100 mg·L-1干預(yù)為給藥組（LV-Sema4D+TSRT組），感染陰性對(duì)照病毒的A549細(xì)胞為陰性對(duì)照組（LV-NC組），未感染慢病毒的A549細(xì)胞為細(xì)胞對(duì)照組。

1.5 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）連續(xù)檢測細(xì)胞指數(shù)

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107L-1，先在E-Plate板上每孔放入50 μL培養(yǎng)基測基線，隨后按照1.4分組加入Sema4D 100 μL過表達(dá)慢病毒感染的A549細(xì)胞、感染陰性對(duì)照病毒的A549細(xì)胞或未感染慢病毒的A549細(xì)胞，每組3復(fù)孔，置37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，記錄細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）。隨后給藥組加100 mg·L-1TSRT干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，記錄48，72和96 h CI。

1.6 熒光定量PCR檢測Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整密度為5×107L-1，按照1.4分組接種細(xì)胞于24孔板中，每孔500 μL，每組3復(fù)孔，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后給藥組加入TSRT 100 mg·L-1干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和實(shí)時(shí)PCR檢測。引物序列見表1，EF-1α為內(nèi)參基因。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃ 5 s，4℃保存。PCR 反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。采用相對(duì)定量分析方法（2-ΔΔCt法）進(jìn)行分析。

Tab.1 Primer sequences for PCR

1.7 Western印跡法檢測Sema4D，PIxnB1和c-Met蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×107L-1，按照1.4分組接種細(xì)胞于6孔板中，每孔2.5 mL，每組3復(fù)孔，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后給藥組加入TSRT 100 mg·L-1干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。按照WES全自動(dòng)蛋白定量分析試劑盒的操作說明，在反應(yīng)板內(nèi)每孔依次加入蛋白樣品3 μL，抗體稀釋液10 μL，兔抗人Sema4D、PlxnB1和c-Met抗體（一抗，1∶50稀釋）10 μL，兔抗人GAPDH抗體（內(nèi)參，1∶1000稀釋）10 μL，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗）10 μL，發(fā)光液15 μL，清洗緩沖液500 μL，用WES全自動(dòng)蛋白定量分析儀進(jìn)行檢測，并用Compass軟件進(jìn)行峰面積（peak area，PA）分析，蛋白相對(duì)表達(dá)水平用PA目標(biāo)蛋白/PA內(nèi)參蛋白比值表示。

1.8 免疫熒光法檢測Sema4D蛋白表達(dá)水平

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整密度為5×107L-1，按照1.4分組接種細(xì)胞于6孔板中（內(nèi)置細(xì)胞爬片），每孔2.5 mL，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后給藥組加入TSRT 100 mg·L-1干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出爬片；PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，吸干固定液；漂洗3次，0.1% Triton X-100穿孔10 min；漂洗3次，加入封閉緩沖液，室溫輕搖封閉60 min；吸棄封閉液，滴加兔抗人Sema4D抗體（一抗，1∶50稀釋），4℃孵育過夜；漂洗3次，滴加Alexa Fluor 647標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗，1∶500稀釋），室溫避光孵育2 h；漂洗3次，滴加DAPI避光孵育10 min；漂洗3次，吸棄液體，用抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片，記錄熒光強(qiáng)度（fluorescence intensity，F(xiàn)I）值變化，以FI值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)Sema4D細(xì)胞株的鑒定

加入過表達(dá)慢病毒LV-Sema4D及陰性對(duì)照病毒LV-NC感染的A549細(xì)胞，用嘌呤霉素連續(xù)篩選14 d，置于倒置熒光顯微鏡下拍照（圖1），可見明顯的綠色熒光，表明穩(wěn)定表達(dá)Sema4D細(xì)胞株構(gòu)建成功。

Fig.1 EstabIishment of ceII Iines stabIy expressing semaphorin 4D（Sema4D）（×100）.LV-NC group：A549 cells infected with negative control virus；LV-Sema4D group：A549 cells infected with Sema4D overexpressing lentivirus.

2.2 TSRT對(duì)細(xì)胞指數(shù)的影響

由圖2可見，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LV-NC組增殖曲線無顯著差異，LV-Sema4D組略有上升，LV-Sema4D+TSRT組明顯下降。由表2可見，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LV-NC組的48，72和96 h CI值無顯著差異；與LV-NC組相比，LV-Sema4D組72 h CI值升高（P＜0.01），48和96 h CI值無顯著差異；與LV-Sema4D組相比，LV-Sema4D+TSRT組48，72和96 h CI值均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 TSRT對(duì)A549細(xì)胞Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表達(dá)的影響

由圖3可見，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LV-NC組Sema4D，PlxnB1和c-Met mRNA表達(dá)無顯著差異；與LV-NC組相比，LV-Sema4D組上述3個(gè)mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干預(yù)后，與LV-Sema4D組相比，上述3個(gè)mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.2 Effect of totaI saponin of Ranunculus Ternatus（TSRT）on ceII index of A549 ceIIs by reaI time ceII anaIysis.Cell control group：A549 cells；LV-NC group：A549 cells infected with negative control virus；LV-Sema4D group：A549 cells infected with Sema4D overexpressing lentivirus；LV-Sema4D+TSRT group：LV-Sema4D cells treated with TSRT 100 mg·L-1.±s，n=3.

Tab.2 Effect of TSRT on ceII index of A549 ceIIs by reaI time ceII anaIysis

Fig.3 Effect of TSRT on mRNA IeveIs of Sema4D，PlxnB1 and c-Met in A549 ceIIs by reaI-time PCR.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with LV-Sema4D group.

2.4 TSRT對(duì)A549細(xì)胞Sema4D，PIxnB1和c-Met蛋白表達(dá)的影響

由圖4可見，與細(xì)胞對(duì)照組相比，LV-NC組Sema4D，PlxnB1和c-Met蛋白表達(dá)無顯著差異；與LV-NC組相比，LV-Sema4D組上述3個(gè)蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干預(yù)后，與LV-Sema4D組相比，上述3個(gè)蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。

2.5 TSRT對(duì)A549細(xì)胞Sema4D蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of TSRT on Sema4D，PIxnB1 and c-Met expression in A549 ceIIs by Western bIotting.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.B was the semiquantitative result of A.PA：peak area.±s，n=3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，compared with LV-Sema4D group.

Fig.5 Effect of TSRT on protein expression of Sema4D in A549 ceIIs by immunofIuorescence method（×200）.See Fig.2 for the cell treatment for 48 h.B was the semiquantitative result of A.FI：fluorescence intensity.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with LV-NC group；#P＜0.05，compared with LV-Sema4D group.

由圖5可見，Sema4D的表達(dá)定位在細(xì)胞膜。與細(xì)胞對(duì)照組相比，LV-NC組Sema4D熒光強(qiáng)度無明顯差異；與LV-NC組相比，LV-Sema4D組熒光強(qiáng)度顯明顯強(qiáng)（P＜0.01）；TSRT 100 mg·L-1干預(yù)后，與LV-Sema4D組相比，Sema4D熒光強(qiáng)度減弱（P＜0.05），提示TSRT干預(yù)可降低Sema4D蛋白的表達(dá)。

3 討論

化痰祛瘀解毒為中醫(yī)辨證論治肺癌的重要原則［9］。貓爪草具有化痰散結(jié)、解毒消腫之功效，是化痰祛瘀解毒中藥的代表，也是中醫(yī)臨床治療肺癌的常用藥。皂苷類成分作為主要活性成分之一已顯示出較好的抗腫瘤效果［3-8］。本研究所用TSRT的總皂苷含量為62.33%（以人參皂苷Rb1為對(duì)照品），其他成分主要為4-氧代-5-（O-β-D-葡萄糖基）-戊酸-正丁基酯、4-氧代-5-（O-β-D-葡萄糖基）-戊酸甲酯和苯甲醇O-β-D-葡萄糖苷等，未見明顯的細(xì)胞毒性［10］。本課題組前期研究考察了TSRT抗A549細(xì)胞增殖的量-效關(guān)系和時(shí)-效關(guān)系，結(jié)合［3H］TdR同位素?fù)饺雽?shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、RTCA-DP檢測和CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示TSRT 25～200 mg·L-1體外與人NSCLC A549和NCI-H460細(xì)胞作用24，48和72 h，均能抑制細(xì)胞增殖和集落形成，引起細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期［6-8］。通過高通量測序技術(shù)檢測TSRT干預(yù)A549細(xì)胞后的相關(guān)基因改變，篩選獲得＞200個(gè)差異表達(dá)基因；對(duì)差異基因作GO功能分析和Pathway富集分析，得到56個(gè)基因，這些基因主要富集在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞代謝等功能分類；經(jīng)PCR驗(yàn)證和統(tǒng)計(jì)分析，信號(hào)素家族的Sema4D在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，TSRT治療后顯著下調(diào)。進(jìn)一步考察了TSRT 25～200 mg·L-1對(duì)無轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞Sema4D mRNA表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)TSRT 50，100和200 mg·L-1作用48 h，可顯著降低A549細(xì)胞Sema4D mRNA表達(dá)，且TSRT 100 mg·L-1作用最佳。因此，選擇本研究選擇該濃度。

本研究首先構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sema4D的A549細(xì)胞株，以此為細(xì)胞模型觀察TSRT對(duì)細(xì)胞增殖的影響。運(yùn)用RTCA技術(shù)連續(xù)監(jiān)測96 h CI值，結(jié)果表明，LV-NC組相比，LV-Sema4D組72 h CI值顯著升高，TSRT干預(yù)后48，72和96 h CI值均顯著降低。CI反映的是細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞黏附狀態(tài)的變化，細(xì)胞數(shù)量越多，貼壁越好，CI越大。RTCA結(jié)果提示，穩(wěn)定表達(dá)Sema4D的A549細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，而TSRT可逆轉(zhuǎn)該效應(yīng)。

Sema4D作為信號(hào)素家族的成員之一，在促進(jìn)NSCLC增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Sema4D在NSCLC中的陽性表達(dá)率明顯高于肺良性病變組，在60例NSCLC患者中，Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期NSCLC的Sema4D陽性表達(dá)率分別為48.4%和82.8%。siRNA干擾后，A549細(xì)胞Sema4D mRNA和蛋白水平顯著降低，且A549細(xì)胞增殖、侵襲和遷移可以通過沉默Sema4D基因來抑制，其機(jī)制可能與抑制蛋白激酶B磷酸化有關(guān)［11］。運(yùn)用免疫組化方法檢測95例肺癌組織和20例正常肺組織Sema4D表達(dá)水平。結(jié)果顯示，肺癌組織Sema4D陽性表達(dá)率為71.6%，明顯高于正常肺組織（陽性表達(dá)率10.0%），且Sema4D表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［12］。因此，Sema4D有可能成為抗NSCLC的新靶點(diǎn)和預(yù)后的新指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，TSRT 100 mg·L-1能顯著抑制穩(wěn)定過表達(dá)Sema4D的A549細(xì)胞Sema4D表達(dá)水平，抑制A549細(xì)胞增殖，提示TSRT可能通過靶向Sema4D發(fā)揮抗NSCLC的作用。

PlxnB1是Sema4D的高親和力受體，以異源二聚體的形式分布于內(nèi)皮細(xì)胞膜上，其細(xì)胞外部分的分子結(jié)構(gòu)與c-Met分子有28%的相似度，在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，且與預(yù)后差相關(guān)［13］。IKEYA等［14］報(bào)道，在85例結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中，Sema4D表達(dá)陽性的標(biāo)本中74.1% PlxnB1表達(dá)陽性，二者的陽性表達(dá)存在顯著相關(guān)性，且雙陽性組預(yù)后更差，復(fù)發(fā)率更高。XIA等［15］報(bào)道，利用RNAi技術(shù)下調(diào)NSCLC中PlxnB1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)體外成管能力明顯下降，且不能通過增加外源性Sema4D而逆轉(zhuǎn)，說明Sema4D必須與PlxnB1結(jié)合才能發(fā)揮效應(yīng)。因此，Sema4D和PlxnB1聯(lián)合高表達(dá)可作為腫瘤惡性程度的雙指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)Sema4D的A549細(xì)胞PlxnB1的表達(dá)也相應(yīng)增高，佐證了二者陽性表達(dá)存在相關(guān)性，且提示腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加；而TSRT干預(yù)后二者表達(dá)均下調(diào)，提示TSRT可能通過下調(diào)Sema4D和PlxnB1表達(dá)，減少Sema4D與PlxnB1結(jié)合而發(fā)揮抗A549細(xì)胞增殖的作用。

c-Met是受體酪氨酸激酶家族中一類獨(dú)特的亞族，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中為過表達(dá)狀態(tài)，并呈現(xiàn)高水平的自體磷酸化。c-Met激酶能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞遷移，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力并誘發(fā)腫瘤新生血管的生成［16］。Sema4D和PlxnB1結(jié)合后活化c-Met的酪氨酸激酶，引起c-Met以及下游的效應(yīng)物生長因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)結(jié)合蛋白1的磷酸化，繼而發(fā)生腫瘤生長、血管形成、細(xì)胞遷移和侵襲等生物學(xué)過程［14］。本研究結(jié)果表明，過表達(dá)Sema4D的A549細(xì)胞中，PlxnB1的表達(dá)也相應(yīng)增加，c-Met表達(dá)亦增加，提示腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加；TSRT干預(yù)使Sema4D，PlxnB1和c-Met表達(dá)均下調(diào)；提示TSRT可能通過Sema4D/PlxnB1/c-Met軸發(fā)揮抗A549細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，TSRT可能通過下調(diào)Sema4D表達(dá)，減少Sema4D與PlxnB1結(jié)合，抑制c-Met信號(hào)途徑，從而抑制A549細(xì)胞增殖，初步闡明TSRT抗NSCLC的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。