蜱與巴貝斯蟲之間互作分子的研究進(jìn)展

姚佳玲，龔海燕

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241）

蜱為專性吸血的節(jié)肢動(dòng)物，屬于動(dòng)物界節(jié)肢動(dòng)物門、蛛形綱、蜱螨亞綱、寄螨目、蜱總科。全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18屬897種，我國已發(fā)現(xiàn)10屬119種，包括100種硬蜱和10余種軟蜱[1]。蜱的發(fā)育階段主要包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱，每個(gè)發(fā)育階段均需吸血才能完成。蜱的宿主非常廣泛，且與人類疾病關(guān)系密切，是許多重要病原的傳播媒介，可攜帶和傳播病毒、細(xì)菌、真菌、立克次氏體、螺旋體及原蟲等[2]，給人類健康、畜牧業(yè)生產(chǎn)及野生動(dòng)物帶來極大危害。

蜱傳病中，巴貝斯蟲病是由頂復(fù)門巴貝斯蟲引起的一類血液原蟲病，傳播媒介為硬蜱，因人獸共患而受到國內(nèi)外越來越多的關(guān)注[3]。根據(jù)目前文獻(xiàn)記載，硬蜱科的扇頭蜱（Rhipicephalus）、硬蜱（Ixodes）、血蜱（Haemaphysalis）、璃眼蜱（Hyalomma）是巴貝斯蟲的媒介宿主[4]。巴貝斯蟲除少數(shù)經(jīng)輸血傳播以外，主要通過感染蜱的叮咬傳播[5-6]。蜱在吸血過程中大量攝入蟲體，但巴貝斯蟲隨紅細(xì)胞到達(dá)蜱中腸后，大部分將被消滅或者退化，僅少數(shù)發(fā)育為配子體，隨后融合成合子才能穿透蜱中腸圍食膜并遷移到血淋巴中的各個(gè)器官[7-9]。這些“幸存者”會給媒介宿主帶來哪些影響，自身又有哪些變化？本文將對蜱的各個(gè)器官和巴貝斯蟲中涉及的互作分子進(jìn)行闡述，以期為阻斷巴貝斯蟲的傳播提供信息和基礎(chǔ)。

1 蜱體內(nèi)互作相關(guān)分子

1.1 中腸 防御素和抗菌肽類：中腸不僅是蜱的主要消化器官，而且是營養(yǎng)物質(zhì)的貯存庫，更是多種病原的載體。原蟲入侵時(shí)，刺激蜱的先天免疫反應(yīng)，快速合成防御素和蜱抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs），由此構(gòu)成了重要的體液防御機(jī)制。此類分子不僅對原蟲有抑制作用，且對細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和真菌同樣具有抗性[10-12]。中腸細(xì)胞內(nèi)有一種類防御素蛋白（Longicin），最初發(fā)現(xiàn)于長角血蜱（H.longicornis），研究表明重組Longicin在體外可有效抑制裂殖子增殖，且接種該蛋白質(zhì)使得感染小鼠體內(nèi)的田鼠巴貝斯蟲（B.microti）減少；而Longicin沉默則導(dǎo)致蜱的中腸、卵巢和卵等多個(gè)組織中染蟲率增加[13]。Longipain也是長角血蜱中分離出來的一種蛋白，屬于中腸半胱氨酸蛋白酶，功能與Longicin相似[14]。Microplusin是微小扇頭蜱（R.microplus）中富含半胱氨酸的AMPs家族中的一員[15]，研究發(fā)現(xiàn)具環(huán)扇頭蜱（R.annulatus）感染雙芽巴貝斯蟲（B.bigemina）時(shí)，Microplusin會過度表達(dá)[10]。

蛋白酶和蛋白酶抑制劑類：半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin, cyst），可有效抑制木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶。在多種蜱中發(fā)現(xiàn)了編碼半光氨酸蛋白酶抑制劑的基因[16-17]；Hlcyst-2來自于長角血蜱中腸，在吉氏巴貝斯蟲（B.gibsoni）感染的幼蜱中表達(dá)量比正常幼蜱高1.8倍，其重組蛋白對體外培養(yǎng)的巴貝斯蟲表現(xiàn)出明顯的生長抑制作用，這些結(jié)果表明Hlcyst-2參與蜱的先天免疫[18]；鐮形扇頭蜱（R.haemaphysaloides）的Cystatin分子RHcyst-1和RHcyst-2在感染與未感染巴貝斯蟲蜱體內(nèi)的基因表達(dá)量分析表明，在半飽血若蜱階段，RHcyst-1和RHcyst-2基因顯著上調(diào)，在飽血若蜱及蛻皮后的成蜱階段，基因顯著下調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)表明蜱的Cystatin可抑制巴貝斯蟲的半胱氨酸蛋白酶[19]；此外，中腸中還存在其他保護(hù)蜱免受病原攻擊的蛋白酶和蛋白酶抑制劑[7,10-11,20]。

通道蛋白和受體類：微小扇頭蜱中腸中的BmVDAC，線粒體電壓依賴性陰離子選擇性通道多肽（也稱為線粒體孔蛋白），可與雙芽巴貝斯蟲有性階段蛋白結(jié)合，蟲體入侵時(shí)，BmVDAC過量表達(dá)[21-22]。VDAC被認(rèn)為位于線粒體外膜中，調(diào)節(jié)小分子進(jìn)入線粒體膜間隙的通量，并在細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡中起作用[23]。在蚊子中，VDAC在瘧原蟲入侵中腸的過程中發(fā)揮作用。同樣，伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）通過蜱中腸的傳播可能與VDAC結(jié)合組織型纖溶酶原激活物的能力有關(guān)[24-25]。此外，在肩突硬蜱（I.scapularis）中腸上皮細(xì)胞中鑒定到伯氏疏螺旋體外膜蛋白A的蜱受體（TROSPA），且此蛋白可能控制蜱體內(nèi)的細(xì)菌感染[26-28]。在具環(huán)扇頭蜱中，TROSPA的直系同源基因在雙芽巴貝斯蟲感染期間過表達(dá)，而基因敲除則使微小扇頭蜱和具環(huán)扇頭蜱中的巴貝斯蟲感染率分別降低了70%和83%[10]。用TROSPA免疫接種牛后，雙芽巴貝斯蟲從牛向蜱的傳播概率下降了80%[29]。在具環(huán)扇頭蜱中，這種受體不僅存在于中腸，還存在于唾液腺（salivary glands，SGs）和卵巢中[30]。在長角血蜱中，還鑒定出富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白（LRR），其重組蛋白對吉氏巴貝斯蟲具有生長抑制作用，且效果與傳統(tǒng)的抗生素藥物相似甚至更好[31]。中腸中還存在其他帶有結(jié)構(gòu)域的具有保護(hù)作用的分子，如MD-2相關(guān)的脂質(zhì)識別（ML）結(jié)構(gòu)域分子，含有與脂質(zhì)識別相關(guān)的蛋白質(zhì)[32]。

其他分子：Bm86為膜結(jié)合糖蛋白，在微小扇頭蜱中腸細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)，其可能參與中腸內(nèi)血液的內(nèi)吞作用[33-35]。在使用基于Bm86抗原的疫苗Gavac?R的一項(xiàng)研究中，接種疫苗的與未接種的狗相比，接種疫苗的狗體表的若蜱呈現(xiàn)更低水平的犬巴貝斯蟲（B.canis）感染。而攜帶Bm86抗體的牛喂食蜱后，抗體引起蜱中腸消化細(xì)胞裂解，進(jìn)而血液滲漏到蜱淋巴中[36]。由此可以推測，中腸細(xì)胞的裂解可能抑制了合子的進(jìn)入和/或下游動(dòng)合子的分化，從而損害了若蟲對犬巴貝斯蟲的獲取。但也有研究表明，Bm86的RNA干擾不影響牛巴貝斯蟲（B.bovis）經(jīng)卵傳播[34]。Subolesin，最先發(fā)現(xiàn)于肩突硬蜱，經(jīng)鑒定為昆蟲和脊椎動(dòng)物中先天性免疫相關(guān)分子Akirin的直系同源基因[37-38]，在真核生物包括蜱類高度保守[30,39]，是抗蜱和蜱傳播病（TTBP）候選抗原中很有潛力的分子之一。Subolesin家族蛋白在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)病原體感染反應(yīng)的細(xì)胞通路中的相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)[40-41]。Subolesin沉默引起微小扇頭蜱中雙芽巴貝斯蟲感染水平下降[42]，但具環(huán)扇頭蜱中雙芽巴貝斯蟲的感染水平降低不顯著[10]。Subolesin和含有Subolesin保護(hù)性表位（Q38）的嵌合體進(jìn)行疫苗接種，影響了雙芽巴貝斯蟲向蜱傳播[29]，由此表明，Subolesin與巴貝斯蟲的感染有一定關(guān)系。

蜱中腸是巴貝斯蟲穿越媒介宿主，上行到唾液腺的第一道屏障，了解腸上皮細(xì)胞和內(nèi)容物中的蛋白分子與巴貝斯蟲的互作，將有助于抗巴貝斯蟲疫苗的研發(fā)，從而阻斷巴貝斯蟲在蜱體內(nèi)的遷移以進(jìn)一步阻斷巴貝斯蟲的傳播。

1.2 血淋巴與卵巢 巴貝斯蟲成功入侵蜱中腸上皮后，其合子在血淋巴的幫助下，通過減數(shù)分裂，成為動(dòng)合子。在淋巴液中，巴貝斯蟲經(jīng)無性繁殖，從而產(chǎn)生多個(gè)孢子囊并經(jīng)卵傳播，導(dǎo)致在蜱所有生命階段及蜱所有器官中都可攜帶孢子囊[43]。

當(dāng)蜱被微生物，如巴貝斯蟲入侵時(shí)，血淋巴細(xì)胞增加其循環(huán)次數(shù)以破壞和控制入侵者，吞噬小顆粒物質(zhì)和微生物[44-45]。除了吞噬作用外，血淋巴中還通過其他方式保護(hù)自身，如形成結(jié)節(jié)和包囊，或通過血淋巴中存在的分子AMPs、溶菌酶、蛋白酶、蛋白酶抑制劑和凝集素等直接作用于病原體[46-47]。雙芽巴貝斯蟲在到達(dá)血淋巴時(shí)表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)性并黏附于微小扇頭蜱血細(xì)胞膜上[48]，但蜱是如何在血淋巴水平上控制病原的還不得而知。

幾乎所有巴貝斯蟲種均可在雌蜱中垂直傳播，這是該屬的獨(dú)有特征[8,49]，可視為病原為了長期存在于生態(tài)系統(tǒng)中而進(jìn)化出來的適應(yīng)性[8]。感染巴貝斯蟲的蜱卵巢蛋白組學(xué)研究鑒定出多個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括鈣網(wǎng)蛋白、谷氨酰胺合成酶和Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑家族；其次為蜱溶菌酶和一組可能屬于AMPs家族的小蛋白質(zhì)[50]。巴貝斯蟲感染可能影響蜱卵巢中參與應(yīng)激反應(yīng)、解毒和免疫反應(yīng)相關(guān)的基因[51]，這些基因大部分可翻譯得到參與卵巢免疫反應(yīng)的蛋白酶和蛋白酶抑制劑。當(dāng)蜱卵巢被感染時(shí)，發(fā)現(xiàn)假定的免疫親和素（Imnp）和Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑（Spi）基因表達(dá)上調(diào)[50]。Imnp基因敲除導(dǎo)致子代幼蟲感染水平顯著上升，表明此分子可能控制原蟲入侵蜱卵巢，并影響子代幼蟲發(fā)育。

蜱的卵黃蛋白原受體（vitellogenin receptor，VgR）與巴貝斯蟲的垂直傳播有關(guān)。VgR沉默后，未能檢測到叮咬感染犬的長角血蜱體內(nèi)的吉氏巴貝斯蟲DNA[52]，由此可能表明巴貝斯蟲分子對蜱VgR具有配體結(jié)合活性，從而侵入正在發(fā)育的卵母細(xì)胞。

卵巢是雌蜱生殖系統(tǒng)中的一個(gè)主要結(jié)構(gòu)，包括巴貝斯蟲在內(nèi)的很多病原體可以經(jīng)卵傳播，新孵化的帶蟲幼蜱可將病原傳染給宿主，而卵巢中的一些分子可通過減少卵和胚胎發(fā)育，從而降低蜱的繁殖率并阻斷蜱媒病原經(jīng)卵傳播，所以卵巢中與病原體相互作用的分子將有望成為疫苗開發(fā)的靶標(biāo)。

1.3 唾液腺 當(dāng)巴貝斯蟲上行到達(dá)唾液腺時(shí)，經(jīng)歷最后的增殖階段并產(chǎn)生子孢子，成為具有感染性的蟲體。SGs是巴貝斯蟲完成媒介中生活史所必須克服的最后一道屏障，且與中腸中所面臨的障礙相似[8]。

軟蜱和硬蜱的唾液組學(xué)研究多有被報(bào)道[53-60]，其中研究表明AMPs，包括防御素、microplusin/hebraein（一種抗菌肽）、含Kunitz結(jié)構(gòu)域的蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、蛋白酶等分子參與蜱的防御機(jī)制。盡管已知唾液腺分子對巴貝斯蟲的傳播尤為重要，但關(guān)于唾液腺分子對巴貝斯蟲感染的影響的報(bào)道卻十分少見。

在帕氏鈍緣蜱（Ornithodoros parkeri）的唾液轉(zhuǎn)錄組和肩突硬蜱基因組中均發(fā)現(xiàn)一種假定的血清淀粉樣蛋白A，在脊椎動(dòng)物中，這種蛋白質(zhì)在炎癥反應(yīng)的急性期發(fā)揮作用[10,53]。在抗蜱感染的牛中發(fā)現(xiàn)其血清淀粉樣蛋白A表達(dá)增加表明其參與由蜱感染產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)[61]。當(dāng)具環(huán)扇頭蜱感染雙芽巴貝斯蟲時(shí)，血清淀粉樣蛋白A基因的表達(dá)會因感染而上升，基因敲除導(dǎo)致微小扇頭蜱和具環(huán)扇頭蜱中感染水平分別降低66%和86%[10]。

在蜱卵巢、中腸和唾液腺中均存在鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin）[10,62]，其作用尚不清楚。有些研究表明其在唾液腺和唾液中的存在可能與逃避宿主防御反應(yīng)有關(guān)[61-63]，但不具備抗血栓和補(bǔ)體抑制功能[64]。此基因在感染雙芽巴貝斯蟲的具環(huán)扇頭蜱中過表達(dá)。鈣網(wǎng)蛋白下調(diào)對微小扇頭蜱中的病原體感染具有顯著影響，但對具環(huán)扇頭蜱感染率影響不顯著[10]。據(jù)此，認(rèn)為鈣網(wǎng)蛋白參與蜱吸血過程[10,65]，且可能在巴貝斯蟲感染過程中改變鈣的代謝。巴貝斯蟲可能和馬泰勒蟲（T.equi）（以前稱為馬巴貝斯蟲（B.equi）一樣，在侵入蜱細(xì)胞時(shí)需要鈣離子。重組鈣網(wǎng)蛋白免疫接種牛后，未能減少蜱對巴貝斯蟲的感染，這可能是由于蛋白質(zhì)的免疫原性低所致[65]。鈣網(wǎng)蛋白抗血清也不能顯著降低微小扇頭蜱中的雙芽巴貝斯蟲感染[62]。其他分子，例如已經(jīng)討論過的TROSPA，也存在于蜱唾液腺，其可能是巴貝斯蟲的受體。

唾液腺是分泌唾液的主要器官，也是傳播巴貝斯蟲的主要載體，在病原-載體-宿主相互作用中起到關(guān)鍵性的橋梁作用，因此了解并解析蜱唾液腺分子與巴貝斯蟲的互作，將有利于發(fā)現(xiàn)或開發(fā)有效的藥物及疫苗，阻斷病原體向宿主的傳播。

2 巴貝斯蟲體內(nèi)與蜱的互作分子

巴貝斯蟲進(jìn)入中腸后，由于大多數(shù)死亡或者退化，不易分離，因此巴貝斯蟲在蜱蟲期的分子研究相對困難，報(bào)道也較少。在蜱中腸內(nèi)，僅少數(shù)巴貝斯蟲發(fā)育成配子，進(jìn)一步以合子形式穿透中腸上皮細(xì)胞。目前，已在牛巴貝斯蟲基因組中鑒定出10個(gè)6-Cys基因（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J），其中A、B、E、H、I和J基因在牛巴貝斯蟲感染的蜱中腸中轉(zhuǎn)錄，并且基因A、B和E也在隨后的牛巴貝斯蟲動(dòng)合子期轉(zhuǎn)錄，而基因C僅在動(dòng)合子中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些結(jié)果表明，巴貝斯蟲6-Cys基因在有性階段與蜱中腸存在一定聯(lián)系[66]。近年，對牛巴貝斯蟲的紅細(xì)胞期和蜱蟲期的細(xì)胞表面蛋白的蛋白組學(xué)分析和比較，表明有兩種蛋白（BBOV_I002220和BBOV_IV006250）在蜱蟲期表達(dá)量顯著增加，且在雙芽巴貝斯蟲中呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式[67]。預(yù)示這兩種蛋白為巴貝斯蟲在蜱體內(nèi)存活所必須，與蜱的互作存在一定關(guān)系。此外，雙芽巴貝斯蟲在有性繁殖期，即蜱蟲期特異表達(dá)一種轉(zhuǎn)甲基酶（BBBOND_0204030），但在紅細(xì)胞期無表達(dá)，因此，此基因即可作為蜱感染巴貝斯蟲的分子標(biāo)記，也可為蜱-巴貝斯蟲互作提供新的信息[68]。此外，研究發(fā)現(xiàn)雙芽巴貝斯蟲的HAP2在體外誘導(dǎo)的有性繁殖階段及感染的蜱中均有表達(dá)，而在紅細(xì)胞期不表達(dá)，并且抗HAP2特異性抗體能夠在體外阻斷合子的形成，這說明該蛋白可能與蜱存在互作關(guān)系[69]。

了解巴貝斯蟲在蜱蟲期差異表達(dá)的分子，可以為解析蜱與巴貝斯蟲的互作機(jī)制提供前期信息，也為疫苗的研發(fā)提供新的信息和潛在的靶點(diǎn)。

3 小結(jié)

目前，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多蜱與病原體的相互作用被發(fā)掘出來，但是關(guān)于蜱-巴貝斯蟲的互作機(jī)制信息卻相對較少。而阻斷蜱載入和傳播巴貝斯蟲的關(guān)鍵是新疫苗的研發(fā)，而新疫苗的研發(fā)需要篩選出潛在的候選抗原。本綜述收集蜱與巴貝斯蟲互作相關(guān)分子的相關(guān)信息，為后期篩選與鑒定新的候選抗原提供基礎(chǔ)和依據(jù)。