戊型肝炎病毒動物模型的研究進展

唐塔婭，佘銳萍，劉天龍，田紀景

（中國農(nóng)業(yè)大學，北京 100193）

戊型肝炎（hepatitis，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus，HEV）引起的一種急性自限性疾病。研究發(fā)現(xiàn)HEV主要有4種傳播途徑，分別為糞口傳播、食源性傳播、血液和垂直傳播，其中主要以糞口途徑為主。在近幾十年里，戊型肝炎在亞洲和非洲一些發(fā)展中國家呈大規(guī)模暴發(fā)性流行，并且在歐洲及美國等發(fā)達國家也發(fā)現(xiàn)了散發(fā)病例[1]。目前戊型肝炎是世界衛(wèi)生組織認定的一個重要公共衛(wèi)生疾病。在感染HEV人群中，大部分患者表現(xiàn)為亞臨床癥狀，少部分表現(xiàn)為急性自限性肝炎。據(jù)估計，每年可發(fā)生2000萬例HEV感染，有臨床癥狀的HEV感染者超過330萬，其中死亡44 000例[2]。人群感染后死亡率為0.5%～4.0%，孕婦的病死率則高達30%[3]。此外，因器官移植或免疫功能缺陷而感染HEV的人群，還可能轉化為慢性肝炎，并形成肝硬化[4]。

戊型肝炎在全球范圍內(nèi)造成了嚴重的危害，并逐漸引起研究人員的重視，越來越多的動物種類被證實為HEV的宿主[5-6]。此外，國內(nèi)外多項研究表明，動物糞便和肉制品中可以檢出HEV RNA，并且食用被糞便污染的水源和未經(jīng)充分烹飪的動物肉制品是導致戊型肝炎發(fā)生的主要原因。截止到目前，已從家豬、野豬、兔、鼠、雞、鹿、雪豹等多種動物體內(nèi)檢出HEV核酸。雖然在狗、貓、馬、羊等動物體內(nèi)尚未檢出HEV核酸，但這些動物的血清中HEV抗體陽性率較高。下文就戊型肝炎實驗感染動物模型的研究進展做一綜述。

1 非人靈長類動物

近年來各國研究學者都在致力于建立HEV實驗動物感染模型。Balayan等[7]在1983年開創(chuàng)了戊型肝炎非人靈長類動物模型的先例。此后國內(nèi)外學者又陸續(xù)建立了10余種HEV的非人靈長類動物模型。黑猩猩被證實對HEV易感，并已用作動物模型以表征HEV病毒學和免疫學方面的特征[8-10]，但是目前已不再適用于侵入性生物醫(yī)學研究。此外，獼猴被證實可用于模擬急性HEV感染。Li等[11]發(fā)現(xiàn)接種了1型HEV的獼猴，其血清和糞便中可檢出HEV RNA，并且HEV抗原檢測呈陽性。Ji等[12]分別用豬HEV的a亞型和b亞型毒株感染獼猴，組織病理學檢查顯示獼猴的肝臟病變與人急性肝炎的病理學變化相似。黃芬等[13]在對中國云南獼猴的HEV血清流行病學和分子特征進行分析后，發(fā)現(xiàn)獼猴可能不是HEV的天然儲庫。隨后Huang等[14]提出了一種HEV跨物種感染的新途徑，他們通過給恒河猴灌喂被4型HEV污染的牛奶，發(fā)現(xiàn)恒河猴發(fā)生急性戊肝感染，從而證實了牛奶作為感染途徑的可能性，并存在將HEV傳播給人類的風險。Liu等[15]用來自中國的兔源HEV成功感染了2只食蟹猴，食蟹猴表現(xiàn)出典型的肝炎癥狀，這一研究提示了人們兔作為戊型肝炎傳染源的可能性。Lanford等[10]在最新研究中證實了食蟹猴和恒河猴對1-4型HEV均易感，這兩種動物模型可用于評估HEV備選疫苗的臨床反應。截止至今，研究人員已證實了黑猩猩、獼猴、恒河猴、食蟹猴以及非洲綠猴等非人靈長類對1-4型HEV的易感性。非人靈長類動物在感染人源HEV后的臨床表現(xiàn)和病程轉歸與人急性肝炎的癥狀極為相似，是研究HEV致病性較為理想的動物模型，但由于不是HEV的天然宿主，并且來源有限價格較昂貴，因此無法批量應用，這些問題都導致非靈長類動物在科研中的應用受到限制。

2 豬

1990年，Balayan等[16]用人源HEV經(jīng)口和靜脈途徑感染豬，結果表明豬對人源HEV具有易感性。Meng等[17]首次從豬體內(nèi)分離得到了1株豬HEV后，是首次報道的豬感染HEV的實驗進行了基因測序，對比結果提示豬源HEV與美國人源HEV有極高的同源性，豬源HEV還可以感染黑猩猩和恒河猴，這一研究結果暗示動物作為戊型肝炎傳染源的可能性。Feagins等[18]將人源4型HEV衣殼基因克隆于豬源3型HEV主干中，制成基因嵌合HEV，成功感染了豬動物模型，進一步證實了3型和4型HEV的人畜共患性質(zhì)。Cossaboom等[19]用來自中、美兩國的兔源HEV毒株感染SPF豬，結果顯示感染了中、美兩國兔源HEV的豬中均出現(xiàn)糞便排毒，感染美國兔源HEV的豬還表現(xiàn)出一過性的病毒血癥，該現(xiàn)象表明豬對兔源HEV有一定易感性。Sanford等[20-21]將豬HEV、大鼠HEV和禽HEV的重組衣殼抗原接種到豬體內(nèi)，誘導HEV IgG的特異性應答，研究發(fā)現(xiàn)該免疫應答對3型HEV具有部分交叉保護作用。將豬用作HEV疫苗試驗的動物模型，并用于評估重組HEV抗原的交叉保護潛力，這對于開發(fā)針對3型和4型HEV的疫苗至關重要。

豬是HEV重要的儲存宿主和感染源之一，作為感染模型可用于研究HEV的病原分布，分子學特征、傳播及感染機制等，但豬只能感染基因3、4型HEV且無明顯的臨床表現(xiàn)[22]，不能復制人感染HEV的致病機制，還存在飼養(yǎng)處理不便等缺點，因此豬動物模型在HEV研究中應用受限。

3 嚙齒動物

Johne等[23]在2009年首次從德國野生大鼠糞便中檢出了鼠源HEV。此后，研究人員在歐洲、亞洲和美國幾個國家的動物體內(nèi)也檢測到了鼠源HEV[24]。Guan等[25]用含有鼠源HEV的組織勻漿靜脈接種大鼠，證實了鼠源HEV具有嗜肝性，但感染后的大鼠不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。這表明鼠HEV可以作為感染模型，但不適用于發(fā)病機制的研究。Hong等[26]用1型HEV感染蒙古沙鼠，沙鼠的肝臟、脾臟和腎臟內(nèi)顯示出組織病理學變化，在接種后7～42 d在糞便樣品中檢測到HEV RNA，ALT水平僅適度增加，但未檢測到HEV特異性抗體，因此還需要進一步研究蒙古沙鼠是否真的對人類HEV感染敏感。Maneerat等[27]用含感染性HEV分離株TK-037/92的人體糞便懸浮液靜脈接種Wistar大鼠，結果證實HEV可以在Wistar大鼠中復制。Debing等[28]用鼠HEV株LA-B350感染無胸腺裸鼠，結果顯示無胸腺裸鼠對LA-B350易感，并與免疫功能低下的慢性戊型肝炎患者的情況相似。此外還發(fā)現(xiàn)利巴韋林能夠有效抑制無胸腺裸鼠中的LA-B350復制，這證實了大鼠模型對抗病毒研究的適用性。

筆者所在團隊近年來在HEV長爪沙鼠動物模型方面進行了系統(tǒng)的研究（表1）。毛晶晶等[29]用豬源HEV成功感染長爪沙鼠，觀察結果表明HEV可損傷長爪沙鼠的腸道結構，同時能激發(fā)腸道的黏膜免疫功能。楊依霏等[30-31]用豬源HEV感染長爪沙鼠，研究結果表明HEV可以誘導肝細胞線粒體凋亡途徑激活，這是HEV造成沙鼠肝臟結構功能損傷的重要機制之一。Soomro等[32-33]研究了沙鼠通過腹腔注射感染豬源HEV后腎臟的損傷機制。研究結果表明，線粒體Caspase-3蛋白酶的激活可能誘導蒙古沙鼠HEV感染急性期后腎上皮細胞壞死和細胞死亡。隨后他們又檢測了豬源HEV對長爪沙鼠睪丸組織結構和分子變化的影響和作用，結果表明，HEV在睪丸組織中病毒蛋白產(chǎn)生結構和分子變化，進而破壞血睪屏障并誘導生殖細胞凋亡。石蕊寒等[34]也采用了已有的豬源HEV感染沙鼠模型，證實了HEV能夠在沙鼠腦和脊髓組織中進行復制從而引發(fā)病理損傷。此外，劉天龍等[35]也用豬源HEV感染了本實驗室建立的長爪沙鼠HEV模型，研究結果表明，HEV感染能引起沙鼠機體抗氧化能力降低，肝臟糖代謝紊亂，并通過激活肝細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑引發(fā)肝細胞損傷。雖然嚙齒類動物具有背景清晰、病死率低、重復性好、選模方法簡便和繁殖力強等優(yōu)點，但鼠作為動物模型感染后無明顯的臨床表現(xiàn)，且鼠源HEV的人畜共患潛力尚不清楚，因此還需要進一步的深入研究。

表1 豬源HEV感染的沙鼠模型的系統(tǒng)研究Table 1 Systematic study of gerbil model of pig-derived HEV infection

4 兔

兔源HEV最早在中國兔群中被檢測到，基因測序結果顯示，兔源HEV與3型HEV最密切相關。隨后研究人員在美國、亞洲及歐洲部分國家的兔群中也陸續(xù)檢測到兔源HEV[36-39]。這些研究表明，兔是HEV的天然宿主之一。在2015至2016年期間，根據(jù)法國的一項研究發(fā)現(xiàn)，在919名HEV感染患者中，有5名感染了與兔HEV密切相關的病毒，這表明兔HEV毒株可能傳染給人類并引起人畜共患感染[40]。兔是最常使用的實驗動物之一，兔源HEV的發(fā)現(xiàn)，揭示了兔作為感染模型的可能性。

Ma等[41]研究發(fā)現(xiàn)，兔在感染HEV毒株后可出現(xiàn)糞便排毒，體內(nèi)可檢測到HEV抗體，并且感染HEV時，血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）活性顯示升高，這表明兔發(fā)生急性肝損傷。Cheng等[42]在一項研究中發(fā)現(xiàn)兔對1型HEV不易感，并且在接種了血清轉化的3型HEV后兔也沒有表現(xiàn)出病毒血癥和糞便排毒。Xia等[43]研究發(fā)現(xiàn)用兔HEV感染懷孕母兔，可導致高死亡率和病毒的垂直傳播現(xiàn)象，并可見兔肝臟的局部肝細胞明顯壞死，相反，當用兔HEV感染非妊娠兔時則病死率較低，甚至沒有明顯的病理變化。Wang等[44]在一項研究中發(fā)現(xiàn)，慢性感染兔HEV的兔還會出現(xiàn)腎臟損傷，并且在其尿液中可檢測到HEV RNA，將該尿液樣品注射到SPF兔體內(nèi)可成功誘導兔感染HEV。

筆者所在團隊近年來在兔感染HEV模型的建立上取得了良好的進展（表2）。毛晶晶等[45]通過檢測實驗感染兔腸道內(nèi)的ORF2抗原信號，證實了兔腸道上皮細胞在HEV復制過程中的重要作用。吳橋興等[46]采用4型豬HEV成功感染了新西蘭兔，感染兔表現(xiàn)出典型的病毒性肝炎變化和多種肝外器官損傷。雖然通過灌胃途徑感染能更客觀的反應在自然感染狀況下病毒的致病機制，但與腹腔注射途徑相比感染的陽性率較低。此外他們還發(fā)現(xiàn)病毒在感染兔后能通過唾液排出。該研究證實了新西蘭兔可以作為豬HEV跨種間感染的動物模型。An等[47]通過腹腔注射4型豬HEV感染兔，研究了HEV在卵巢和子宮內(nèi)的復制以及HEV引起的組織結構變化，發(fā)現(xiàn)卵巢是HEV的復制位點之一，并且HEV在卵巢組織中的復制促進了生殖細胞的凋亡。這是為研究HEV垂直傳播的機制提供了新思路。

5 其他動物

2001年，美國研究人員從患有肝脾綜合征的雞中分離出了一種新的HEV毒株，禽源HEV與人源HEV有極高的同源性，但僅局限于在禽類動物中傳播，至今尚未發(fā)現(xiàn)禽HEV感染人的現(xiàn)象。因此禽作為HEV動物模型的應用價值非常有限[48-49]。2010年，荷蘭學者首次從雪貂糞便中檢出HEV RNA，該病毒株與基因1-4型HEV、兔源HEV、禽源HEV的基因相似性為54.5%～60.5%，與鼠源HEV的相似性較高，為72.3%[50]。雖然雪貂為HEV新的動物宿主，但尚無因感染HEV而致病的相關報道，其能否作為實驗感染HEV的理想動物模型尚待進一步研究。Yu等[51]的一項研究表明，樹鼩可以被人源4型HEV感染，在血清、糞便、膽汁、脾臟和腎臟組織中可以檢測到HEV RNA，血清ALT升高并有輕度肝損傷。體內(nèi)可檢測到HEV IgG和IgM抗體。該研究表明樹鼩具備作為人源HEV感染模型的潛力，值得進一步研究。

表2 豬源HEV感染的兔模型的系統(tǒng)研究Table 2 Systematic study of rabbit models of pig-derived HEV infection in our laboratory

6 展望

本文就上述動物模型對HEV毒株的實驗敏感性進行了歸納（表3）。隨著研究人員對戊型肝炎的研究日漸深入，越來越多的HEV動物宿主被發(fā)現(xiàn)，這對HEV在發(fā)達國家的散發(fā)流行進行了很好的解釋，同時對于戊型肝炎病毒理想動物模型的選擇也具有十分重要的借鑒意義?，F(xiàn)代醫(yī)學器官移植技術發(fā)展迅猛，這使得人類通過動物器官移植感染上HEV的風險顯著增高。建立HEV實驗動物模型不僅可以闡明HEV的感染及致病機理，在促進HEV新型疫苗的開發(fā)及評估方面也意義重大，并且也為建立新的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供了更多的可能性。但目前關于HEV實驗動物模型的研究仍然存在一些問題，比如實驗中所用的動物模型以嚙齒類動物與兔居多，對于其他動物模型的研究報道較少，HEV感染方式以靜脈和腹腔注射為主，經(jīng)口及其他途徑感染的研究較少，以及機體自身的免疫反應與HEV感染后的發(fā)病機制是否相關等問題。綜上，已經(jīng)建立的動物模型對病毒復制、發(fā)病機制和保護性免疫應答的研究在某種程度上還是初步的，如果要加深對戊型肝炎病毒的認識并改善對戊型肝炎的控制狀況，還需進一步開發(fā)戊型肝炎病毒的小動物模型。

表3 不同動物物種對HEV毒株的實驗敏感性Table 3 Experimental sensitivity of different animal species to HEV strains