Nanopore快速測(cè)序診斷飼養(yǎng)野豬非洲豬瘟疫情

閆曉敏，任照文，涂長(zhǎng)春，何 彪

（1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院蜂學(xué)學(xué)院，福州350002；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春130122）

近年來(lái)，新發(fā)、突發(fā)傳染病以及外來(lái)病給我國(guó)畜禽養(yǎng)殖與公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)，準(zhǔn)確而快速確診是有效防控和阻止疫情擴(kuò)散的重要前提。傳統(tǒng)病原分離鑒定、抗原抗體反應(yīng)以及以PCR為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)雖然在疫病診斷中發(fā)揮了不可或缺的重要作用，但是上述方法只能針對(duì)已知病原體，而且通常需要嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件，對(duì)新發(fā)未知病原的檢測(cè)存在技術(shù)局限性。隨著Illumina測(cè)序和PacBio單分子高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，病原診斷策略得以極大改進(jìn)，但由于儀器昂貴，樣品前期制備周期長(zhǎng)、建庫(kù)起始核酸量要求嚴(yán)格，且存在擴(kuò)增偏好性，缺乏本地測(cè)序能力，加上將樣本運(yùn)送到遠(yuǎn)程測(cè)序設(shè)施的實(shí)際困難，無(wú)法短時(shí)間內(nèi)完成檢測(cè)。納米孔測(cè)序作為新興三代測(cè)序技術(shù)在臨床病原檢測(cè)中展示出了較強(qiáng)的應(yīng)用前景，由于該技術(shù)具有單分子測(cè)序、長(zhǎng)讀長(zhǎng)及實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)分析等優(yōu)點(diǎn)，在基因組和轉(zhuǎn)錄組研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，顛覆了人們對(duì)高通量測(cè)序和疾病診斷的理解[1]。牛津納米孔技術(shù)公司（oxford nanopore technologies，ONT）MinIONTM測(cè)序儀，重量?jī)H90 g，攜帶方便，文庫(kù)構(gòu)建簡(jiǎn)單快速，適用于疫情現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)診斷和數(shù)據(jù)分析[2]。2017年，F(xiàn)aria等[3]利用MinION在資源有限的巴西疫區(qū)對(duì)寨卡病毒和黃熱病毒進(jìn)行了全基因組多重?cái)U(kuò)增子測(cè)序，成功地建立了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)平臺(tái)。2018年，尼日利亞暴發(fā)拉沙熱疫情。由于拉沙熱病毒的高度變異，很難通過(guò)特異性PCR擴(kuò)增病毒的全基因組，英國(guó)科學(xué)家通過(guò)隨機(jī)PCR擴(kuò)增結(jié)合納米孔測(cè)序在疫區(qū)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)完成了病毒的檢測(cè)和全基因組測(cè)序分析[4]。

作為全球最大的生豬養(yǎng)殖和消費(fèi)國(guó)，2018年8月份ASF入侵了我國(guó)，隨后快速蔓延至全國(guó)[5]，并于當(dāng)年11月傳播到了東北地區(qū)。ASFV一旦在野豬群流行傳播，將為我國(guó)ASF防控和消滅帶來(lái)新的困難，因此，開(kāi)展野豬疫情監(jiān)測(cè)與防控對(duì)阻止病毒在野豬群的流行十分必要。為開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確可靠的快速實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，及時(shí)獲取病原的基因信息，本研究采用先進(jìn)的納米孔快速測(cè)序技術(shù)對(duì)未知病原的臨床樣品直接進(jìn)行高通量測(cè)序，基于在線(xiàn)分析平臺(tái)實(shí)時(shí)分析成功地診斷了一起野豬ASF疫情。建立的方法在新發(fā)或突發(fā)疫情的快速診斷以及未知病原的快速鑒定中具有重要的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1.1 樣品信息和核酸提取 2019年2月，內(nèi)蒙古自治區(qū)阿爾山市大興安嶺重點(diǎn)國(guó)有林管局桑都爾林場(chǎng)散養(yǎng)野豬發(fā)生不明原因疫情，222頭野豬中210頭死亡，解剖發(fā)現(xiàn)病死豬脾臟顯著腫大至正常脾臟的5～6倍且易碎，呈暗紅發(fā)紫狀態(tài)，疑似ASF。該養(yǎng)殖場(chǎng)采集一份脾臟樣品送檢，在P2+生物安全實(shí)驗(yàn)室條件下，在樣品中加入裂解液滅活病原，隨后加入MEM研磨，4℃、8000×g離心10 min后取上清液，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒（TIANGEN，DP315）提取總核酸，50 μL無(wú)酶水洗脫后，RNA核酸分子通過(guò)Maxima H Minus Double-Stranded cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific K2561）合成雙鏈cDNA，通過(guò)普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（TIANGEN，DP204）完成DNA與cDNA的產(chǎn)物純化，采用Qubit dsDNA HS分析試劑盒在Qubit4.0核酸定量?jī)x中完成核酸定量，NanoDrop1000測(cè)定核酸純度，然后分裝儲(chǔ)存于-80℃超低溫冰箱待用。

1.2 Nanopore建庫(kù)測(cè)序

1.2.1 快速建庫(kù)測(cè)序 純化后的DNA與cDNA等量混合，參照納米孔快速建庫(kù)測(cè)序（RAD004，ONT）流程在10 min內(nèi)完成文庫(kù)構(gòu)建。將測(cè)序芯片（FLOMIN106，R9.4.1）組裝至MinION測(cè)序儀中，通過(guò)USB 3.0接口將MinIONTM與電腦（Intel(R) core(TM) i7-7700 @3.60 GHz；16.0 GB內(nèi)存；1 TB SSD）連接。將測(cè)序文庫(kù)通過(guò)Spot-ON樣品端口加入到芯片后，啟動(dòng)離線(xiàn)版本MinKNOW，并實(shí)時(shí)開(kāi)啟EPI2ME云分析平臺(tái)（https://epi2nanoporetech.com）。17 h 20 min后終止此次測(cè)序，使用Wash kit（WSH003，ONT）清洗芯片后，儲(chǔ)存于4℃冰箱。

1.2.2 連接法建庫(kù)測(cè)序 為驗(yàn)證不同建庫(kù)方案對(duì)病原體檢測(cè)的時(shí)效性與準(zhǔn)確性，進(jìn)一步參照連接法測(cè)序（LSK109, ONT）說(shuō)明構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，并將制備好的文庫(kù)加載到R9芯片上進(jìn)行1D測(cè)序，文庫(kù)制備流程耗時(shí)90 min。此外，由于單張芯片測(cè)序通量限制，采用3張測(cè)序芯片并行完成連接測(cè)序，單次測(cè)序運(yùn)行24 h。

1.3 非洲豬瘟病毒的定性與定量檢測(cè) 通過(guò)世界衛(wèi)生組織（Office International dés Epizooties，OIE）推薦的引物與特異性實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)[6]，對(duì)野豬源ASFV做進(jìn)一步驗(yàn)證與定量檢測(cè)。特異性PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠分析，膠回收目的片段，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并按照101～108copies/μL稀釋8個(gè)梯度。熒光定量PCR程序設(shè)定：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，55℃退火 10 s收集熒光，45個(gè)循環(huán)。

1.4 Sanger全基因組測(cè)序 參照ASFV Georgia 2007毒株[7]（GenBank登錄號(hào)：NC044959.1）的全基因組序列設(shè)計(jì)329對(duì)引物序列，采用一代Sanger技術(shù)進(jìn)行基因組測(cè)序，根據(jù)擴(kuò)增片段的重疊區(qū)域進(jìn)行SeqMan全基因組拼接，該部分測(cè)序與拼接工作由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司完成。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 Nanopore數(shù)據(jù)分析 通過(guò)cd-hit軟件的默認(rèn)參數(shù)對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw data）去除接頭，F(xiàn)iltlong軟件過(guò)濾小于300 bp的短片段和平均質(zhì)量值小于7的低質(zhì)量的序列，得到總的Clean data用于后續(xù)分析，并通過(guò)NanoPlot進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。BWA-MEM[8]采用默認(rèn)參數(shù)將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)映射到本地核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)得到的病毒序列進(jìn)行在線(xiàn)BLAST驗(yàn)證。

1.5.2 ASFV有參組裝與可視化分析 利用Minimap2[9]將測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到Sanger全基因組，Miniasm進(jìn)行基因組拼接。Samtools[10]進(jìn)行數(shù)據(jù)排序，并建立索引。通過(guò)Integrative Genomics Viewer（IGV）可視化序列覆蓋度，以及序列的插入缺失情況。

1.5.3 多序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析 對(duì)Sanger測(cè)序及Nanopore測(cè)序獲得的序列進(jìn)行隨機(jī)篩選，得到ASFV D345L基因的603 bp部分重合片段，采用MEGA 7.0[11]進(jìn)行多序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析，并利用最大似然法中的Tamura3-parameter模型以及Bootstrap1000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 未知病原的快速檢測(cè) 臨床研究中，在短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)新發(fā)突發(fā)病原體的快速檢測(cè)與鑒定對(duì)于重大突發(fā)疫情的應(yīng)急處置與防控工作至關(guān)重要。牛津納米孔公司的MinIONTM測(cè)序儀小巧便攜，可快速布防于條件受限的疫區(qū)，在疫情現(xiàn)場(chǎng)與筆記本電腦和無(wú)線(xiàn)WiFi連接，即可實(shí)時(shí)讀取數(shù)據(jù)完成病原體的快速檢測(cè)。美國(guó)農(nóng)業(yè)部在2019年借助MinIONTM測(cè)序儀對(duì)于實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的ASFV毒株以及實(shí)驗(yàn)感染豬的全血樣本進(jìn)行富集后在短期內(nèi)快速檢測(cè)到了ASFV的特異序列[12]。本研究直接針對(duì)疑似野豬臨床脾臟樣本，在樣本送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后150 min內(nèi)即完成了樣品的前期制備，經(jīng)10 min快速構(gòu)建文庫(kù)，結(jié)果在測(cè)序4 min時(shí)首批獲得1.25 kb的序列讀數(shù)（reads），實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)量806.98 kb，同步EPI2ME數(shù)據(jù)時(shí)分析比對(duì)得到了有效覆蓋ASFV全基因組的特異性序列，在獲取序列的時(shí)效性上遠(yuǎn)優(yōu)于其他測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序運(yùn)行17 h 20 min后共計(jì)獲得1.06 GB原始測(cè)序數(shù)據(jù)，共計(jì)553 071條reads。通過(guò)生物信息分析流程比對(duì)得到367條病毒reads，其中213條（58.04%）比對(duì)為ASFV基因序列，其余為豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（16.89%）、豬巨細(xì)胞病毒（25.07%）。此外還獲得103 020條噬菌體序列，由于樣品處理前期未去除宿主基因組，因而宿主基因組序列占據(jù)全部reads的81.31%。對(duì)于復(fù)雜稀缺的臨床樣本類(lèi)型，可根據(jù)實(shí)際需求去除宿主基因組，實(shí)現(xiàn)樣本富集從而節(jié)約測(cè)序成本獲取更多有效數(shù)據(jù)。另一方面，將Nanopore測(cè)序技術(shù)與病毒宏基因組研究手段相結(jié)合可滿(mǎn)足于疫情突發(fā)時(shí)對(duì)未知病原快速檢測(cè)需求。

2.2 ASFV的熒光定量檢測(cè) 為驗(yàn)證上述結(jié)果，采用ASFV P72基因特異PCR對(duì)野豬脾臟組織樣本進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果成功地?cái)U(kuò)增出了250 bp目的片段（圖1），確診野豬樣品為ASFV陽(yáng)性，與納米孔測(cè)序結(jié)果完全一致。進(jìn)一步熒光定量PCR方法對(duì)該樣品進(jìn)行ASFV基因定量檢測(cè)，結(jié)果顯示病毒載量為2.1E+6 copies/200 mg。該樣品中的病毒量相對(duì)較高，且ASFV基因組較大，Nanopore測(cè)序技術(shù)針對(duì)此類(lèi)臨床樣本無(wú)需PCR擴(kuò)增直接建庫(kù)測(cè)序，由此表明，Nano pore測(cè)序技術(shù)非常適用于ASF的臨床快檢應(yīng)用。

2.3 Sanger全基因組測(cè)序結(jié)果 經(jīng)Sanger測(cè)序技術(shù)最終獲得該樣品ASFV毒株基因組全長(zhǎng)189 403 bp，命名為InnerMongolia-AES01。截取其P72基因在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行在線(xiàn)BLAST分析，結(jié)果顯示，該序列與ASFV Georgia 2007株、中國(guó)流行毒株同源性為100%，同屬于基因Ⅱ型。該毒株全基因組包含188個(gè)ORFs，序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MK940252。

圖1 非洲豬瘟病毒P72基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplified P72 gene from ASFV

2.4 納米孔測(cè)序結(jié)果

2.4.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將原始測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾后進(jìn)行NanoPlot統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。從表中可以看出通過(guò)連接法（LSK）測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)，無(wú)論在測(cè)序通量或者是測(cè)序讀長(zhǎng)與序列質(zhì)量方面，均優(yōu)于快速測(cè)序方案，對(duì)3次連接測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后獲得9.0 GB過(guò)濾后數(shù)據(jù)，與核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后獲得到1826條ASFV序列，最快得到ASFV序列耗時(shí)3 h。本研究通過(guò)比較分析快速測(cè)序和連接法發(fā)現(xiàn)，連接法獲取病原微生物的時(shí)效性較差，但是序列質(zhì)量更高，適用于病原基因組特征的研究。

表1 過(guò)濾后測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of Nanopore clean data

2.4.2 ASFV序列統(tǒng)計(jì) 圖2表明，經(jīng)Nanopore快速測(cè)序與連接測(cè)序方案共同獲得的2039條ASFV序列與Sanger測(cè)序獲得的全基因組數(shù)據(jù)（GeneBank登錄號(hào)：MK940252）相比較，同源性為74.32%～100%，最短讀長(zhǎng)僅116 bp，最長(zhǎng)讀長(zhǎng)19 821 bp，覆蓋ASFV基因組的10.46%，大多數(shù)序列讀長(zhǎng)在500～5000 bp，在序列讀長(zhǎng)方面遠(yuǎn)優(yōu)于二代illumina測(cè)序，但是序列準(zhǔn)確度僅為77.78%與85.64%，不及其他測(cè)序平臺(tái)得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確高。

圖2 ASFV序列讀長(zhǎng)與同源性分布圖Fig.2 ASFV sequence read length and identity

2.4.3 ASFV序列的可視化 本研究通過(guò)Minimap2軟件將Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到ASFV參考基因組，并借助IGV軟件將比對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。從圖3可以看出測(cè)序所得序列對(duì)ASFV全基因組序列覆蓋度良好，單位點(diǎn)平均測(cè)序深度5.02，最大測(cè)序深度14，整體ASFV序列覆蓋率達(dá)99%。圖3、圖4顯示，Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)存在大量的插入與缺失。圖4中紅色標(biāo)記的SQK-RAD04與SQK-LSK109序列中能直觀觀察到多個(gè)位點(diǎn)存在1～2個(gè)堿基的插入與缺失，由此，導(dǎo)致兩者與Sanger測(cè)序獲得的AES01株親緣關(guān)系偏離，但是所得到的序列仍與ASFV基因Ⅱ型株序列處于同一進(jìn)化分支，表明Nanopore測(cè)序所得數(shù)據(jù)雖能判定病毒種類(lèi)但其準(zhǔn)確度仍存在較大改進(jìn)空間。對(duì)于Nanopore測(cè)序得到的reads非偶然的片段插入與缺失，需要提高測(cè)序深度或者采用2+3的組裝策略才能獲得高質(zhì)量的全基因組序列。因而將兩種建庫(kù)策略獲得的ASFV特異性序列進(jìn)行初步組裝后覆蓋了99%的全基因組序列，但是由于測(cè)序深度的限制，導(dǎo)致拼接后的序列仍存在個(gè)別位點(diǎn)的插入與缺失。下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)能夠獲得良好的基因組覆蓋深度，但是短讀長(zhǎng)的技術(shù)特點(diǎn)以及測(cè)序中引入的擴(kuò)增會(huì)使得組裝結(jié)果的片段化。ASFV基因組兩端為反向重復(fù)序列，因而需要利用Nanopore測(cè)序產(chǎn)生的長(zhǎng)讀長(zhǎng)序列構(gòu)建基因組框架，進(jìn)一步借助NGS平臺(tái)填補(bǔ)框架，從而在短期內(nèi)完成基因組拼接工作。劉翟等[13]借助通量更高的Nanopore PromethION平臺(tái)以及NGS測(cè)序平臺(tái)采用2代+3代測(cè)序組裝策略完成了ASFV病毒分離株的測(cè)序與全基因組拼接工作，對(duì)于大基因組精準(zhǔn)組裝方面具有重要參考意義[13]。但是PromethION測(cè)序儀相對(duì)于掌上MinIONTM測(cè)序儀可移動(dòng)性較差，不利于疫情暴發(fā)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)序平臺(tái)的快速布置，因而對(duì)于新發(fā)突發(fā)與再發(fā)病原體的快速識(shí)別與鑒定方面，Nanopore MinION測(cè)序平臺(tái)仍有不可比擬的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

綜上，本研究基于先進(jìn)的Nanopore測(cè)序與便攜式高性能計(jì)算機(jī)平臺(tái)在4 min內(nèi)于一起發(fā)病的家養(yǎng)野豬體內(nèi)實(shí)時(shí)檢測(cè)到了ASFV的特異性序列，一方面，實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床樣品ASFV的快速檢測(cè)，表明 Nanopore測(cè)序技術(shù)在新發(fā)或突發(fā)傳染病的快速診斷以及未知病原的快速鑒定中具有重要的應(yīng)用價(jià)值；另一方面，本研究明確了ASF在家養(yǎng)野豬群中的傳播與流行，進(jìn)而擴(kuò)大了ASF的宿主與地理分布范圍，提示在ASF疫情的消滅戰(zhàn)役中應(yīng)注意加強(qiáng)對(duì)野豬群的監(jiān)測(cè)與防控。

圖3 IGV ASFV序列的可視化比對(duì)Fig.3 Visual aligment ASFV sequence by IGV

圖4 基于重合片段構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)及相關(guān)序列的可視化結(jié)果Fig.4 Visualization of phylogenetic trees and related sequences based on coincidence fragments