冠狀病毒膜孔蛋白E作為藥物靶點的探討

王 歡，丁 鏟,2，廖瑛

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.江蘇省重大動物傳染病與人畜共患病預(yù)防與控制聯(lián)合創(chuàng)新中心，揚州225009）

病毒編碼的離子通道蛋白，是一種在病毒生命周期中起多種作用的小跨膜蛋白，屬于病毒膜孔蛋白家族。病毒膜孔蛋白具有兩親性，可在宿主細(xì)胞膜上多聚化，形成親水的離子通道（圖1），介導(dǎo)離子（Na+、K+、Ca2+、H+、Cl-）的運輸，影響病毒的入胞、基因組復(fù)制、子代病毒的組裝和出芽以及致病性[1]。許多高致病性病毒編碼膜孔蛋白，例如艾滋病毒（Human immunodeficiency virus，HIV-1）vpu蛋白[2]、丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）p7蛋白[3]、A型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）M2蛋白[4]、登革熱病毒（Dengue virus，DV）M蛋白[5]、輪狀病毒（Rotavirus，RV）nsp4蛋白[6]、呼吸道合胞體病毒（Respiratory Syncytial virus，RSV）SH蛋白[7]、腸道病毒（Enterovirus，EV）2B蛋白[8]和冠狀病毒（Coronavirus，CoVs）E蛋白[9-10]等。一些離子通道阻滯劑能阻滯病毒膜孔蛋白的功能，進而抑制病毒的增殖和降低其致病性，因此病毒膜孔蛋白可作為抗病毒治療的靶點。

圖1 病毒膜孔蛋白分類[1]Fig.1 Classification of viroporins

1 冠狀病毒簡介

冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬于套式病毒目（Nidovirale）冠狀病毒科（Coronaviridae）冠狀病毒屬（Coronavirus）。已知冠狀病毒家族有二十多種冠狀病毒，主要感染人、家畜、家禽、寵物，給人類和動物健康帶來嚴(yán)重的危害?？筛腥救祟惖墓跔畈《竟灿衅叻N，其中，人冠狀病毒-229E（Human coronavirus 229E，HCoV-229E）、人冠狀病毒-HKU1（Human coronavirus，HCoV-HKU1）、人冠狀病毒-NL63（Human coronavirus NL63，HCoVNL63）、人冠狀病毒-OC43（Human coronavirus，HCoV-OC43）四種冠狀病毒是引起人類感冒的常見病原體；2003年出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）[11]，2011年出現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）[12]，及2019年12月出現(xiàn)的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒-2（Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2，SARSCoV-2）[13]，可引起致命的呼吸系統(tǒng)疾病，造成大范圍的傳染，給公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重的威脅。目前尚無有效的藥物防控冠狀病毒的感染。

冠狀病毒具有囊膜，纖突蛋白S、包膜蛋白M和小包膜蛋白E位于病毒囊膜表面，核衣殼蛋白N與病毒單股正鏈RNA基因組結(jié)合形成螺旋核衣殼，包裹在病毒囊膜內(nèi)側(cè)（圖2）。冠狀病毒具有RNA病毒最長的單股正鏈RNA基因組，有5'帽子結(jié)構(gòu)和3'尾巴結(jié)構(gòu)，長度為26.2～31.7 kb。基因組由6～10個開放閱讀框架（open reading frame，ORF）組成，5'端三分之二序列屬于ORF1，編碼復(fù)制和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶；3'端的三分之一序列按照固定的排序編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白：(HE)-S-E-M-N和各個冠狀病毒特有的附屬蛋白。冠狀病毒具有15～16個非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，Nsp）。這些非結(jié)構(gòu)蛋白包括蛋白酶、RNA依賴型的RNA復(fù)制酶、RNA解旋酶、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶和RNA甲基化加帽酶等。參與病毒復(fù)制的非結(jié)構(gòu)蛋白和病毒基因組形成復(fù)制/轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，完成負(fù)鏈亞基因組RNA（Subgenomic RNA）的合成，亞基因組mRNA（Subgenomic mRNA）的轉(zhuǎn)錄和病毒基因組gRNA（Genomic RNA）的復(fù)制。

圖2 冠狀病毒模型圖[14]Fig.2 Model of coronavirus

2 冠狀病毒膜孔蛋白-E蛋白

冠狀病毒的E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，屬于跨膜整合蛋白，長度介于76～109個氨基酸[15-16]。在病毒復(fù)制過程中，E蛋白大量表達，但是只有少部分整合到病毒顆粒里。E蛋白在病毒感染過程中主要發(fā)揮兩個功能：（1）跟M相互作用，參與子代病毒的組裝和釋放。大部分E蛋白位于宿主細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的膜結(jié)構(gòu)上，參與病毒的組裝、出芽和胞內(nèi)運輸[16-18]。缺失E蛋白的重組病毒，病毒滴度顯著降低，病毒成熟發(fā)生缺陷，或產(chǎn)生沒有感染性的子代病毒，說明E蛋白在病毒的成熟和擴散中發(fā)揮重要作用[19-25]。（2）參與病毒致病過程：E蛋白的穿膜區(qū)大約為25個氨基酸，形成至少一個兩親性α螺旋，通過同源寡聚化在膜上形成離子通道，屬于病毒膜孔蛋白[26]。SARSCoV[9,18,27-28]、HCoV-229E[29]、鼠肝炎病毒（Murine hepatitis virus，MHV）[30]和禽傳染性支氣管炎病毒IBV（Infectious bronchitis virus，IBV）[29]的E蛋白，均能形成離子通道。最近發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV E蛋白的C端四個氨基酸是PDZ結(jié)合序列（PDZ-binding motif，PBM），能夠結(jié)合多個宿主蛋白，調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，促進病毒感染，跟病毒的致病性相關(guān)。

E蛋白對于冠狀病毒的正常增殖和致病性具有重要作用。在豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和MERS-CoV基因組中刪除E基因，病毒能夠復(fù)制，但是不能傳播和擴散[21-22,24]；在MHV和SARS-CoV基因組中刪除E基因，病毒能復(fù)制，但是病毒滴度降低了20到1000倍[19-20]；動物實驗中表明，缺失E基因的SARS-CoV毒力大大降低，并降低了炎癥反應(yīng)，可作為疫苗候選株[31-34]。在所有冠狀病毒E蛋白的研究中，對SARS-CoV的E蛋白研究最為透徹。SARS-CoV E蛋白，具有76個氨基酸，能夠形成同源六聚體離子通道，其活性中心在形成α螺旋結(jié)構(gòu)的穿膜區(qū)（10～35 aa）[9]。穿膜區(qū)的Asn15和Val25, 是決定SARS-CoV E 蛋白離子通道活性的關(guān)鍵氨基酸。將Asn15和Val25進行突變，使E蛋白失去離子通道活性，重組的SARS-CoV毒力明顯減弱，并降低了炎癥反應(yīng)[35]。因此，E蛋白的離子通道活性，促進病毒的增殖和致病性。最近研究表明，SARS-CoV E蛋白能夠激活炎癥小體，促進炎癥反應(yīng)[35-36]。因此，抑制E蛋白離子通道活性，除了能夠抑制病毒增殖，還能夠抑制肺部的炎癥反應(yīng)，是一個很好的抗病毒藥物設(shè)計靶點。

3 靶向病毒膜孔蛋白的藥物

3.1 鹽酸金剛烷胺 在靶向病毒膜孔蛋白的藥物中，鹽酸金剛烷胺對A型禽流感病毒M2蛋白的作用機制及其臨床使用效果較為清楚[37-38]。鹽酸金剛烷胺是最早用于抑制禽流感病毒的抗病毒藥，美國FDA于1968年批準(zhǔn)其作為A型禽流感預(yù)防藥物，并于1976年確認(rèn)其為A型禽流感治療藥物。該藥特異性靶向A型禽流感病毒編碼的膜孔蛋白M2。M2是A型禽流感的一個重要組成成分，在病毒囊膜上形成同源四聚體離子通道。當(dāng)病毒結(jié)合細(xì)胞表面受體發(fā)生內(nèi)吞后，M2在內(nèi)吞小體被酸性環(huán)境激活，氫離子選擇性通過M2通道，進入病毒囊膜內(nèi)部中心區(qū)[39]。病毒內(nèi)部的酸化導(dǎo)致靜電相互作用減弱，M1和核衣殼蛋白復(fù)合體分離[40]。隨之而來的膜融合，使發(fā)生脫殼的核衣殼蛋白復(fù)合體進入細(xì)胞質(zhì)，轉(zhuǎn)運進細(xì)胞核進行病毒復(fù)制。當(dāng)病毒完成基因組復(fù)制和蛋白合成，M2插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，通過高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)（trans-Golgi network，TGN）轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面。在酸性的TGN、M2把氫離子轉(zhuǎn)運出高爾基體內(nèi)腔，維持病毒HA蛋白的亞穩(wěn)態(tài)構(gòu)型[41]。另外，M2蛋白對于A型禽流感子代病毒在細(xì)胞表面的出芽非常重要。鹽酸金剛烷胺能夠進入M2形成的四聚體離子通道中心（圖3、4），阻斷氫離子進入病毒囊膜內(nèi)部，抑制M2的離子通道功能，影響病毒的脫殼，并影響后續(xù)的病毒復(fù)制、蛋白合成、病毒的組裝和出芽[42]。M2基因容易突變，使得A型禽流感對鹽酸金剛烷胺出現(xiàn)抗藥性，因此在雞場需要謹(jǐn)慎用藥。由于世界各地的A型禽流感病毒出現(xiàn)抗藥性，美國疾控中心目前不推薦鹽酸金剛烷胺用于A型禽流感的治療。此外，鹽酸金剛烷胺還能夠抑制HCV p7蛋白[43]、登革熱病毒M蛋白[5]和冠狀病毒E蛋白[44]，并已經(jīng)用于HCV治療的臨床實驗[45]。

圖3 鹽酸金剛烷胺分子結(jié)構(gòu)式Fig.3 Molecular structural formula of amantadine

圖4 鹽酸金剛烷胺（紅色）抑制A型禽流感M2蛋白（藍色）的模型圖[41]Fig.4 Model of amantadine (red) inhibiting influenza A M2 protein (blue)

有報道顯示，抗A型禽流感臨床藥物鹽酸金剛烷胺，能夠明顯抑制SARS-CoV E蛋白的離子通道活性[44]。在病毒實驗中，鹽酸金剛烷胺能夠靶向E蛋白，抑制鼠肝炎冠狀病毒MHV的增殖[46]。由于冠狀病毒E蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相當(dāng)保守，因此，鹽酸金剛烷胺是對冠狀病毒感染進行治療的一個候選藥物。

3.2 六亞甲基阿米洛利 目前，除了鹽酸金剛烷胺外，一種抑制HIV-1 vpu蛋白的六亞甲基阿米洛利[47]，也能結(jié)合SARS-CoV[48]、HCoV-229E[29]、和MHV的E蛋白[29,49]，抑制其活性（圖5、6）[48]。已有研究證實，六亞甲基阿米洛利能夠廣譜性抑制HCoV-229E[29]、貓傳染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis virus，F(xiàn)IPV）[50-51]和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）[52]的增殖。

圖5 六亞甲基阿米洛利的分子結(jié)構(gòu)式Fig.5 Molecular structural formula hexamethylene amiloride

圖6 六亞甲基阿米洛利與SARS-CoV E蛋白的抑制性結(jié)合[47]Fig.6 Model of hexamethylene amiloride inhibiting SARS-CoV E protein

4 展望

我們對SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERSCoV的E蛋白序列做了比對，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2跟SARS-CoV的E蛋白具有很高的同源性，只有4個氨基酸的差異，離子通道活性位點Asn15和Val25完全保守（圖7）。因此，在SARS-CoV-2 E蛋白的藥物研發(fā)中，完全可以借鑒SARS-CoV的研究經(jīng)驗。根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，鹽酸金剛烷胺和六亞甲基阿米洛利是治療SARS-CoV-2的候選藥物。其中，鹽酸金剛烷胺已用于抗A型禽流感的臨床治療，或許可以成為SARS-CoV-2的治療方案之一。

圖7 SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的E蛋白序列比對Fig.7 Sequence alignment of E protein of SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV