日本血吸蟲融合表達(dá)抗原rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2的免疫保護(hù)研究

秦芳林，李肖純，程貴鳳，吳洛濱，任雨琪，金亞美

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海200241；2.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西030800）

血吸蟲病嚴(yán)重危害人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲[1]。血吸蟲成熟雌蟲大量產(chǎn)卵，卵堆積在宿主肝臟和腸系膜靜脈形成的肉芽腫是導(dǎo)致宿主病理性損傷的根本原因，大量蟲卵排出體外又造成血吸蟲病的傳播和流行。血吸蟲雌雄合抱是雌蟲成熟產(chǎn)卵的前提，未合抱的雌蟲呈發(fā)育阻遏狀態(tài)無法產(chǎn)正常卵[2]，既不會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生嚴(yán)重的病理損害，也不會(huì)引起該病的再傳播。因此從控制血吸蟲的生殖發(fā)育來防治血吸蟲病具有重要意義。

ELAV-like是一類mRNA結(jié)合蛋白，含有3個(gè)高度保守的RNA識(shí)別基序RRM（RNA recognition motif），對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持起重要作用，且多項(xiàng)研究表明，RRM RNA結(jié)合蛋白在細(xì)胞代謝過程中起著重要作用，在人和其他多種生物中其表達(dá)量變化或突變會(huì)引起發(fā)育異?；?qū)е律窠?jīng)性疾病的產(chǎn)生[3-5]。ELAV在果蠅中首次克隆獲得，因其表達(dá)改變致果蠅視神經(jīng)發(fā)育異常并于胚胎期死亡而得名。人類中與ELAV-like 1同源的HuR在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，通過與ARE（AU-rich element）元件結(jié)合來調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，它的異常表達(dá)導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育異常。HuR對(duì)胎盤的形態(tài)學(xué)發(fā)生和血管形成以及胎兒的維持有重要作用，該基因缺失將導(dǎo)致胚胎致死或發(fā)育異常[6-8]。ELAV-like 2在小鼠的生殖腺及非洲爪蟾的睪丸、卵巢和特異性的胚胎中也有表達(dá)，且研究表明，小鼠體內(nèi)ELAV-like 2蛋白過早降低會(huì)導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂效益下降[9-10]。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)ELAV-like 1和ELAV-like 2在日本血吸蟲單性感染雌蟲中高表達(dá)[11-12]，這預(yù)示該基因可能對(duì)日本血吸蟲尤其是雌蟲的生長(zhǎng)生殖有重要影響。本研究評(píng)估了重組蛋白rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2的免疫保護(hù)效果，為血吸蟲病防治研究奠定一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株與試驗(yàn)動(dòng)物 日本血吸蟲中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所血吸蟲病研究室提供；BALB/c小鼠（6～8周齡，雄性）購(gòu)于上海杰思捷試驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 主要試劑與儀器 ExTaqHS、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司；核酸回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21和DH5α購(gòu)于天根生物科技有限公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；MONTANIDEISA206VG佐劑購(gòu)于賽彼科特殊化學(xué)品有限公司；TRizol購(gòu)于Sigma公司；pET28a、IPTG由本實(shí)驗(yàn)室保存；PCR引物合成及測(cè)序由上海英俊生物科技有限公司完成。

1.3SjELAV-like 1和SjELAV-like 2全長(zhǎng)基因的克隆、表達(dá) 根據(jù)NCBI登錄的相應(yīng)序列，用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)引物，以日本血吸成蟲cDNA為模板，參考文獻(xiàn)[1-2]，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SjELAV-like 1-F：5'-CCGGAATTCGTTGGTTCAATGTCAGA TAGTCCAT-3'（下劃線處為EcoRⅠ），SjELAVlike 1-R：5'-CCGCTCGAGTTGTTGTTGTTGTCAA TGTAATCAC-3'（下劃線處為XhoI），SjELAVlike 2-F：5'-GCCGGATCCATGGTTGTATATCAT GATCG-3'（下劃線處為BamHⅠ），SjELAV-like 2-R：5'-CCGCTCGAGTCAGATTTTAGAGGCAG CTATA-3'（下劃線處為XhoⅠ）。雙酶切PCR產(chǎn)物及表達(dá)載體pET28a，用T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，陽性克隆采用菌液PCR和序列測(cè)序鑒定。將測(cè)序正確的重組克隆接種于LB培養(yǎng)基，D600達(dá)0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集0、1、2、3、4、6 h的菌體蛋白，以確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。大量表達(dá)重組蛋白經(jīng)3次反復(fù)凍融，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，同時(shí)用SDS-PAGE凝膠電泳分析，判定其表達(dá)情況。將包涵體蛋白洗滌后溶于8 mol/L尿素，用His Bind Resin鎳柱親和層析法純化。因ELAV-like 2的等電點(diǎn)（PI）為7.91，為防止等電沉淀，純化rSjELAVlike 2時(shí)將所需Buffer的pH值調(diào)為8.5。

1.4 免疫 6～8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、佐劑對(duì)照組、空白對(duì)照組，每組10只。試驗(yàn)組將純化后的融合蛋白分別與206佐劑混合（46∶54）皮下注射進(jìn)小鼠體內(nèi)，佐劑對(duì)照組皮下注射PBS與206佐劑混合物，空白對(duì)照組皮下注射PBS。每隔兩周免疫1次，共免疫3次，ELAV-like 2免疫前和每次免疫后2周眼眶采血，收集血清用ELISA檢測(cè)抗體變化水平。3次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚貼片攻擊感染402條日本血吸蟲尾蚴。42 d后以肝門靜脈灌注法收集蟲體并計(jì)數(shù)，收集肝臟并分別計(jì)算肝臟荷卵數(shù)同時(shí)進(jìn)行肝卵孵化，計(jì)算減卵率和減孵化率。

1.5 減蟲率和減卵率的計(jì)算 減蟲率=（1-實(shí)驗(yàn)組蟲體數(shù)目/佐劑對(duì)照組蟲體數(shù)目）×100%。蟲卵計(jì)數(shù)：剖殺小鼠肝臟稱重，置于50 mL離心管內(nèi)加去氯水適量，勻漿后定容至20 mL，取1 mL勻漿液和10% NaOH等體積混合，37℃消化30 min，消化過程中不時(shí)混勻并取少量觀察，待消化完全，搖勻后取50 μL于顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，重復(fù)3次取平均值：減卵率=（1-實(shí)驗(yàn)組卵胚數(shù)/佐劑對(duì)照組卵胚數(shù)）×100%。蟲卵孵化：取4 mL肝臟勻漿液至細(xì)頸燒瓶，加入去氯水至瓶頸上3～5 cm，液面上塞入薄層棉花（避免氣泡產(chǎn)生）棉花上方再加入適量去氯水，26～28℃孵化，分別于孵化2 h、6 h時(shí)，將上層含毛蚴液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，用碘酊固定并染色毛蚴，4000×g離心5 min，棄上清液，沉淀用去氯水定容至2 mL，取50 μL顯微鏡下計(jì)數(shù)毛蚴，重復(fù)3次取平均值。孵化率=（毛蚴總數(shù)/卵胚總數(shù)）×100%

減孵化率=（1-實(shí)驗(yàn)組孵化率/佐劑對(duì)照組孵化率）×100%

2 結(jié)果

2.1SjELAV-like-1和SjELAV-like-2基因的克隆表達(dá)和蛋白純化 以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板，擴(kuò)增基因SjELAV-like-1和SjELAV-like-2的已知編碼區(qū)域，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示單一條帶，分子量與已知序列大小相符（圖1）。經(jīng)雙酶切連接轉(zhuǎn)化測(cè)序成功后，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中成功表達(dá)，二者都在4 h表達(dá)量最高，且蛋白都以包涵體的形式存在；用His-bind鎳柱親和層析法獲得融合表達(dá)蛋白，分子量分別約為62 kDa和64.2 kDa，見圖2-4。

2.2 免疫小鼠后特異性抗體水平變化 分別在免疫前、1免、2免、3免后2周收集小鼠血清，用ELISA方法對(duì)rSjELAV-like 2特異性IgG水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組與佐劑對(duì)照組相比，1免后特異性IgG已產(chǎn)生，2免后特異性抗體水平顯著提升、3免后特異性抗體持續(xù)升高（圖5），而差異極顯著（p<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。佐劑對(duì)照組與空白對(duì)照組無顯著性差異。

2.3 免疫保護(hù)效果 剖殺小鼠后，靜脈灌注沖蟲，收集蟲體并計(jì)數(shù)；小鼠肝臟勻漿并孵化蟲卵，顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵和毛蚴，分別計(jì)算減蟲率、減卵率、減孵化率（表1）。結(jié)果顯示：rSjELAV-like 1免疫可產(chǎn)生減蟲率17.81%，減卵率44.52%，但該免疫反而提升了蟲卵孵化能力（20.38%）；rSjELAV-like 2免疫可產(chǎn)生減蟲率36.03%，減卵率為51.34%，減孵化率為46.83%。

3 討論

血吸蟲病歷史悠久、分布廣泛、危害嚴(yán)重。對(duì)血吸蟲病的治療主要依靠化學(xué)藥物如：吡喹酮，但因血吸蟲中間宿主釘螺難以消滅，化學(xué)藥物治療不能解決重復(fù)感染，因此加強(qiáng)血吸蟲病免疫預(yù)防研究極為重要。

圖3 融合蛋白表達(dá)形式的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.3 SDS-PAGE analysis of fusion protein expression

圖4 融合蛋白rSjELAV-like 1和 rSjELAV-like 2純化后產(chǎn)物SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified rSjELAV-like 1 and rSjELAV-like 2

圖5 rSjELAV-like 2免疫后小鼠特異性IgG水平變化Fig.5 Analysis of specific IgG induced in mice immunized with rSjELAV-like 2

ELAV-like家族基因編碼RNA 結(jié)合蛋白，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響 mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯，控制蛋白的時(shí)空表達(dá)，并調(diào)控 RNA 與蛋白質(zhì)的結(jié)合及其相互作用，決定基因的表達(dá)水平及終產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[3-4]。ELAV-like 1可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制限制神經(jīng)突觸的生長(zhǎng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和維持有重要作用[13]。ELAV-like 2與Sxl基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制及其相似，Sxl是果蠅性別發(fā)育決定的調(diào)節(jié)開關(guān)，與果蠅的性別決定和維持有很大的關(guān)系[14-15]。而日本血吸蟲的ELAV-like 2與果蠅的Sex-lethal（Sxl）蛋白有一定的同源性，由此可推測(cè)SjELAV-like 2在血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中應(yīng)也有同樣重要的功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)SjELAV-like 1和SjELAV-like 2在25天的單性感染血吸蟲雌蟲中高表達(dá)，二者主要表達(dá)于血吸蟲體表，且其表達(dá)受干擾不僅引起形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變而且對(duì)血吸蟲的生殖產(chǎn)卵能力和卵胚孵化能力都有顯著的影響[11-12]，說明二者對(duì)血吸蟲尤其是雌蟲的生長(zhǎng)和生殖發(fā)育有一定的影響。

表1 融合蛋白免疫BALB/c小鼠引起的免疫效果分析Table 1 Protection level in BALB/c mice induced by fusion protein immunization

本研究成功克隆并融合表達(dá)了rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2蛋白，評(píng)估了這兩個(gè)血吸蟲雌蟲生殖發(fā)育相關(guān)蛋白的免疫保護(hù)效果。免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明rSjELAV-like 1和rSjELAV-like 2有一定的免疫保護(hù)效果，對(duì)宿主的荷蟲數(shù)有不同程度的降低，且rSjELAV-like 2減蟲效果優(yōu)于rSjELAV-like 1，同時(shí)它對(duì)減輕宿主肝臟的卵荷也顯著優(yōu)于rSjELAVlike 1。對(duì)宿主體內(nèi)雌蟲所產(chǎn)蟲卵孵化能力上這兩個(gè)蛋白表現(xiàn)出相反的影響，rSjELAV-like 1免疫反而會(huì)提升卵胚孵化能力，rSjELAV-like 2免疫則會(huì)降低卵胚孵化能力。

日本血吸蟲成熟雌蟲日產(chǎn)卵量可達(dá)3000個(gè)，卵沉積在宿主肝臟中會(huì)形成肉芽腫，破壞肝組織，造成宿主嚴(yán)重病理損害；蟲卵排出體外又會(huì)造成血吸蟲病的傳播和流行[16]。因此減低宿主卵荷和降低蟲卵孵化對(duì)血吸蟲病病理損害的減輕和傳播的阻斷具有重要意義。rSjELAV-like 2免疫不僅能降低宿主肝臟中蟲卵數(shù)目，而且降低蟲卵孵化能力；rSjELAVlike 1免疫能降低宿主肝臟蟲卵數(shù)目，但對(duì)蟲卵孵化能力反而是提高的。二者都對(duì)宿主肝臟蟲卵孵化有一定影響，都可以降低宿主體內(nèi)蟲荷和宿主肝臟卵荷，對(duì)減輕宿主病理損害有一定的幫助，且rSjELAV-like 2免疫可顯著降低宿主肝卵孵化，在阻斷血吸蟲病傳播方面可發(fā)揮一定作用，更適合作為抗血吸蟲病疫苗候選分子。