肺癌微環(huán)境細胞分類研究進展

麥曉君 周鳳麗

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州 510630)

原發(fā)性肺癌是最常見的腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。由于其發(fā)病隱匿，臨床影像學(xué)發(fā)現(xiàn)的結(jié)節(jié)性病變多根據(jù)結(jié)節(jié)大小及形態(tài)、有無肺癌危險因素等建議患者3個月至1年復(fù)查胸部CT(影像學(xué)隨訪策略：2018年版肺結(jié)節(jié)診治中國專家共識)，但由于部分患者依從性較差，未規(guī)律復(fù)診，且部分肺癌進展較快，以至于多數(shù)肺癌發(fā)現(xiàn)時已是晚期。因此，肺癌患者的早期診斷對患者的預(yù)后至關(guān)重要。近年來，腫瘤免疫成為腫瘤領(lǐng)域的熱點。許多研究通過各種檢驗方法對比肺癌微環(huán)境與肺部良性疾病中各種免疫細胞的比例以發(fā)現(xiàn)其中的差異，或?qū)Ψ伟┑脑缙谠\斷有所幫助。同時，各種免疫細胞對腫瘤的作用各不相同，一些免疫細胞可通過促進腫瘤血管形成參與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，而另一些免疫細胞則可通過發(fā)揮直接腫瘤殺傷、募集其他免疫細胞等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。通過研究發(fā)現(xiàn)各種免疫細胞在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用，可為腫瘤的治療提供新的靶點。

1 肺癌微環(huán)境中的適應(yīng)性免疫細胞

1.1T淋巴細胞亞群 腫瘤患者常處于免疫低下狀態(tài)，腫瘤細胞通過一系列機制逃避機體免疫系統(tǒng)的對抗。而肺癌患者中T淋巴細胞常為主要的免疫細胞。其中CD4+T淋巴細胞為重要的輔助性細胞，可通過分泌多種細胞因子促進免疫反應(yīng)；而CD8+T淋巴細胞則是通過直接殺傷作用，清除被病毒或細菌感染的細胞及表達特異性新抗原的腫瘤細胞。肺癌患者的腫瘤微環(huán)境常出現(xiàn)一系列免疫紊亂，包括CD4+降低、CD8+升高，CD4+/CD8+降低。相比于肺結(jié)核及其他肺感染性疾病患者，肺癌患者肺泡灌洗液CD4+不同程度降低，CD8+不同程度升高，CD4+/CD8+降低；而良性肺部疾病患者恰好相反，如結(jié)節(jié)病患者，CD4+明顯升高，CD8+降低，CD4+/CD8+升高；特發(fā)性間質(zhì)性肺炎患者則是CD4+、CD8+及CD4+/CD8+接近于正常。因此，可設(shè)想通過流式細胞術(shù)檢測肺泡灌洗液中CD4+、CD8+及CD4+/CD8+對患者評估T細胞免疫狀態(tài)，有利于肺癌及其他肺部疾病的早期診斷[1]。另外，T淋巴細胞參與了機體的細胞免疫，而其中的調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(regulatory T cells，Tregs)在機體抵抗腫瘤的防御機制中發(fā)揮重要作用。Tregs可以通過抑制T淋巴細胞、樹突狀細胞及自然殺傷細胞(natural killer cells，NK)的活性維持免疫耐受。有研究標(biāo)記表達CD4+/CD25high/FoxP3+/CD127-的Tregs，使用流式細胞學(xué)檢測肺泡灌洗液中Tregs含量，發(fā)現(xiàn)肺癌患者的肺泡灌洗液中Tregs含量高于良性病變患者。且在非鱗狀細胞類型肺癌(尤其是腺癌)的腫瘤微環(huán)境中，肺泡灌洗液中的Tregs比例高于肺鱗狀細胞癌患者。由此研究可以推測，通過檢測肺泡灌洗液中Tregs的比例，可以分析肺癌患者腫瘤微環(huán)境的局部免疫狀態(tài)，有利于肺癌免疫治療的開展，并在一定程度上可以在抗腫瘤免疫治療前預(yù)測其預(yù)后[2]。除了可通過檢測T淋巴細胞亞群的比例及計數(shù)早期診斷肺癌，T淋巴細胞對肺癌的治療也有重要意義。劉睿等[3]總結(jié)了抗原嵌合受體T細胞(CAR-T)經(jīng)歷的四代變革、治療肺癌所出現(xiàn)的副作用、治療肺癌的多個靶點，包括內(nèi)皮生長因子受體(epidermal growth receptor，EFGR)、酪氨酸激酶受體(EphA2)、黏蛋白(mucoprotein1，MUC1)、人類表皮生長因子2(human epidermal growth factor receptor2，HER2)。

1.2B淋巴細胞 瘤內(nèi)B淋巴細胞同樣是肺癌微環(huán)境免疫細胞的重要組成之一 。體內(nèi)B淋巴細胞既有抗肺癌作用，亦有促進肺癌細胞生長及轉(zhuǎn)移的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)循環(huán)中的B淋巴細胞可分泌炎癥因子并通過分化成為Be1、Be2兩種亞型分別產(chǎn)生與Th1、Th2細胞相似的細胞因子譜，從而調(diào)節(jié)Th1∶Th2比例，參與腫瘤發(fā)展過程[4-6]。其中，鱗狀細胞性肺癌通過鱗狀細胞癌抗原等腫瘤相關(guān)性抗原刺激體內(nèi)循環(huán)中的B淋巴細胞產(chǎn)生抗體并形成循環(huán)免疫復(fù)合物(CIC)，而CIC能激活骨髓細胞的FcγR信號通路，募集體內(nèi)白細胞至腫瘤微環(huán)境來幫助肺癌的轉(zhuǎn)移及生長[7]。由此推測，通過抑制B細胞活化或阻斷B細胞介導(dǎo)的固有免疫細胞募集的藥物干預(yù)可有效預(yù)防癌前病變的發(fā)展。然而瘤內(nèi)B淋巴細胞對肺癌起抗腫瘤作用。瘤內(nèi)B淋巴細胞可誘導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答分化、促進CD4+T記憶細胞形成、增強活化CTLs的增殖和存活，由此發(fā)揮抗癌作用。另外，瘤內(nèi)B淋巴細胞還存在一種新功能：誘導(dǎo)和維持腫瘤內(nèi)三級淋巴結(jié)構(gòu)。此淋巴結(jié)構(gòu)在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用，并與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。通過向癌灶中轉(zhuǎn)移CXCL13和淋巴毒素等細胞因子可刺激瘤內(nèi)B淋巴細胞和三級淋巴結(jié)構(gòu)的形成，協(xié)助其他免疫細胞進入腫瘤內(nèi)，以此產(chǎn)生保護性免疫作用，為提高腫瘤疫苗的效率提供了理論依據(jù)[8]。另有實驗發(fā)現(xiàn)，部分肺鱗狀細胞癌及高分化腺癌的瘤內(nèi)B淋巴細胞通過分化漿細胞并分泌IgG4發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。在肺癌刺激下，瘤內(nèi)B淋巴細胞可產(chǎn)生特異性抗體并形成原位免疫復(fù)合物，以此殺死腫瘤細胞。Michael等[10]研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌的癌巢中存在著腫瘤生發(fā)中心。而瘤內(nèi)B淋巴細胞多位于腫瘤生發(fā)中心，通過流式細胞學(xué)等技術(shù)提取其中的記憶B淋巴細胞，克隆其輕鏈及重鏈的產(chǎn)物或可尋找治療肺癌的新靶點[11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，瘤內(nèi)B淋巴細胞具有直接殺傷腫瘤的能力，其可通過TRAIL/Apo1信號通路介導(dǎo)殺傷體外腫瘤細胞[12]。

2 肺癌微環(huán)境中的固有免疫細胞

2.1肺癌微環(huán)境中的巨噬細胞 巨噬細胞也是人體免疫系統(tǒng)的重要成員，其可分為M1型及M2型。其中M1型為經(jīng)典活化的巨噬細胞(classically activated macrophage)，主要通過IFN-γ、TNF或LPS誘導(dǎo)，可高水平表達腫瘤壞死因子、IL-12、IL-23等炎癥因子，誘發(fā)Th1型免疫應(yīng)答，具有促炎癥和抗腫瘤作用；而M2型則為替代性活化的巨噬細胞(alternatively activated macrophage)，由IL-4或IL-13等誘導(dǎo)，可分泌IL-10和多種趨化因子，主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，參與細胞生長、血管生成、免疫抑制、組織修復(fù)和間質(zhì)形成等過程[13]。肺癌微環(huán)境中的巨噬細胞以M2型巨噬細胞為主，有研究表明，M2型巨噬細胞可能通過誘導(dǎo)上調(diào)VEGF-C及其特異性受體VEGFR3的表達促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而VEGFR3是近年來研究較多的與血管和淋巴管的生長發(fā)育相關(guān)的受體，尤其是對淋巴管的生長發(fā)揮重要作用[14]。M2型巨噬細胞還可通過產(chǎn)生一些酶(如MMP-2等)調(diào)整腫瘤微環(huán)境的代謝，而這些酶的活性與腫瘤的侵襲性相關(guān)，參與腫瘤的轉(zhuǎn)移[15]。另外，M2型巨噬細胞還可分泌IL-10等細胞因子抑制免疫應(yīng)答，并降低TNF-α、IL-12、IL-1等免疫刺激因子表達從而促進腫瘤生長[16，17]。因此，通過對腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的分類及計數(shù)可對腫瘤的早期診斷及預(yù)后有所幫助。有研究表明，CD163+M2型巨噬細胞增多是NSCLC進展的獨立危險因素。可通過檢測CD163+M2型巨噬細胞的計數(shù)了解腫瘤的進展。此外，該研究推測，NSCLC細胞或通過表達VEGF招募M2型巨噬細胞，可通過抗VEGF單克隆抗體(貝伐單抗)抑制腫瘤血管形成，阻止M2型巨噬細胞的募集[18]。此外，基于對M2型巨噬細胞的治療策略還包括：①抑制趨化因子配體2、7、8，阻止腫瘤相關(guān)巨噬細胞聚集；②阻止巨噬細胞向M2型極化；③逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細胞的表型[19-21]。

2.2肥大細胞 肥大細胞也是固有免疫細胞的重要一員。循環(huán)中的肥大細胞對許多腫瘤而言起著促進其生長及轉(zhuǎn)移的作用。例如，肥大細胞可以通過促進腫瘤血管形成、自分泌局部激素介質(zhì)及分泌各種生長因子促進肺腺癌及肺鱗狀細胞癌細胞的轉(zhuǎn)移及生長[22-25]；其脫顆粒過程中的產(chǎn)物可促進宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移[26]；并且其釋放的組胺與結(jié)直腸癌的惡變程度相關(guān)[27]。另有研究表明，瘤內(nèi)肥大細胞在NSCLC的癌巢基質(zhì)細胞中占有優(yōu)勢，并與NSCLC的生存率相關(guān)[28]。該研究表明，人體內(nèi)肥大細胞具有兩種表型，其中一種含有類胰蛋白酶(MCT)，而另一種包含類胰蛋白酶及糜酶(MCTC)。MCT主要位于黏膜上皮及固有層中，而MCTC主要位于皮膚及結(jié)締組織中。瘤內(nèi)的此兩種表型對于NSCLC的生存率均有改善，提示肥大細胞能參與到抗腫瘤免疫過程中。肥大細胞可通過分泌TNF-α促進T淋巴細胞增殖，而通過TNF-α促進生長的T淋巴細胞又可正反饋促進肥大細胞增殖，兩者共同發(fā)揮抗腫瘤作用[29]。另外，肥大細胞可通過脫顆粒釋放蛋白酶破壞腫瘤基質(zhì)，腫瘤細胞外基質(zhì)及細胞結(jié)構(gòu)受到破壞，從而抑制腫瘤的生長[28]。

2.3樹突狀細胞 樹突狀細胞(dendritic cells,DC)是機體功能最強的專職抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原。未成熟的DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始T細胞，處于啟動、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。DC通常少量分布于與外界接觸的皮膚(黏膜)部位，主要為皮膚、鼻腔、肺、胃與腸的內(nèi)層。血液中也可發(fā)現(xiàn)未成熟型DC。當(dāng)其被活化時，會移至淋巴組織中與T細胞和B細胞互相作用，刺激相應(yīng)的免疫反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過基因修飾的DC可通過CCL21趨化吸引幼稚T淋巴細胞聚集，并分化為腫瘤特異性的T淋巴細胞對抗腫瘤[30]。此外，DC可通過分泌CCL1、CCL17促進CD8+T淋巴細胞的活化[31]。除經(jīng)典的DC外，還有一種漿細胞樣DC(plasmacy-toid dendritic cells，pDCs)，其可通過抗原呈遞，調(diào)節(jié)NK細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞平衡，具有聯(lián)系固有免疫及適應(yīng)免疫的作用。此外，在不同細胞因子作用下，pDCs既可誘導(dǎo)免疫耐受，亦可發(fā)揮免疫刺激作用。用具有抑制作用的配體CTLA4-Ig或OX2(CD200)刺激pDCs，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生吲哚胺2,3-雙加氧酶，進而抑制T淋巴細胞增殖，產(chǎn)生免疫耐受[32]。許多腫瘤瘤內(nèi)有大量未成熟的DCs及pDCs浸潤，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，表達于pDCs的ICOS配體可通過聚集具有免疫抑制作用的CD4+T淋巴細胞促進乳腺癌生長[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)，TLR激動劑可促進腫瘤瘤內(nèi)浸潤的pDCs產(chǎn)生IFN-1，并激活瘤內(nèi)未成熟DCs誘導(dǎo)具有抗腫瘤作用的T淋巴細胞的免疫反應(yīng)并發(fā)揮抗血管生成作用。此研究通過使用咪唑喹啉作用于pDCs，調(diào)節(jié)T淋巴細胞發(fā)揮抗黑色素瘤的作用[34]。而pDCs在肺癌方面的研究較少，有待進一步探索。

2.4自然殺傷細胞 NK細胞是一種大顆粒淋巴細胞，它可在無需抗原預(yù)敏的情況下、非MHC限制的識別并殺死腫瘤細胞及病原體感染的細胞，是機體重要的免疫細胞之一，也是非特異性免疫的重要一員。有研究發(fā)現(xiàn)，肺癌微環(huán)境中的NK細胞浸潤程度與原發(fā)性肺癌的病理類型、肺癌患者的吸煙史、腫瘤大小及腫瘤預(yù)后相關(guān)[35]。NK細胞在肺鱗狀細胞癌的浸潤高于肺腺癌；有吸煙史的肺癌患者的癌巢NK細胞浸潤少于無吸煙史患者；肺癌癌灶越大，NK細胞浸潤越多，肺癌患者預(yù)后越好。在肺癌腫瘤微環(huán)境中，NK細胞的抑制性受體顯著升高，而刺激性受體明顯下降。該研究通過小鼠實驗推測，NKG2D、Ly49I的下調(diào)及NKG2A的上調(diào)或與腫瘤免疫耐受的產(chǎn)生相關(guān)。其中，NKG2A是NK細胞的抑制性配體受體；而NKG2D是NK細胞及T淋巴細胞的刺激性受體，其識別可輔助腫瘤免疫監(jiān)督并通過觸發(fā)穿孔素介導(dǎo)的細胞凋亡作用發(fā)揮抗腫瘤作用；Ly49I亦是NK細胞上的刺激性受體，其可幫助NK細胞溶解腫瘤細胞。周智鋒等[36]用Ficoll分離得到外周血單個核細胞，按IL-2+IL-12+IL-15+IL-18組合方案培養(yǎng)獲得NK細胞，對比NSCLC患者化療及化療聯(lián)合NK細胞回輸治療效果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合NK細胞回輸治療的中位生存期高于僅使用化療治療，并且通過檢測腫瘤組織中NK細胞刺激性受體NKG2D的配體——MICA表達可預(yù)測NK細胞回輸治療的療效。還有研究通過吉非替尼作用于腫瘤微環(huán)境中的NK細胞，增強其對肺癌腫瘤細胞的細胞毒性發(fā)揮抗腫瘤作用[37]。早期曾有研究使用IL-2刺激NK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用，但由于IL-2的毒性及受IL-2驅(qū)動的Treg擴增的限制而失敗[38]。因此，要使用NK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用必須解決以下問題：①阻斷抑制NK細胞活化的抑制性受體；②消除抑制NK細胞功能的Treg；③使NK細胞有機會進入實體腫瘤內(nèi)；④中和腫瘤細胞分泌的抑制性因子，如TGF-β；⑤消除髓源性抑制性細胞(MDSCs)；⑥提供NK細胞活化、刺激增殖及存活所必須的細胞因子和生長因子[39]。近年來，NK細胞抗腫瘤的研究也取得了一定的進展。有實驗通過刺激NK細胞表達腫瘤相關(guān)嵌合抗原受體發(fā)揮抗腫瘤作用并取得成功[40]。另外，有實驗通過設(shè)計雙特異性蛋白，其中一個臂與腫瘤抗原結(jié)合，另一個臂與激活的NK細胞受體結(jié)合，通過此種交聯(lián)刺激NK細胞發(fā)揮抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用定向裂解腫瘤細胞[41]。

綜上所述，通過研究肺癌微環(huán)境中免疫細胞的計數(shù)、比例及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，可為肺癌的早期診斷、預(yù)后判斷及靶點選擇提供重要參考。當(dāng)然，其中仍有部分問題需要解決，各種免疫細胞的互動網(wǎng)絡(luò)及不同細胞因子對不同免疫細胞的作用仍需要進一步研究，這也將為腫瘤免疫治療開啟新篇章。