線粒體損傷在急性胰腺炎發(fā)病機制中的作用

吳英珂，王衛(wèi)星

（武漢大學人民醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430060）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一種由多種病因引起的胰酶異常激活后導致胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥性疾病，多數(shù)患者病情表現(xiàn)較輕，但仍有20%～30%患者可進一步發(fā)展為重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP ），SAP患者通常伴有一個或多個器官功能障礙[1]。AP炎癥過程中細胞損傷的發(fā)病機制仍未完全闡明，臨床上尚缺乏有效的治療方法。線粒體是細胞ATP合成的重要場所，近年來研究[2]表明線粒體損傷是AP發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。目前研究多認為鈣超載作為起始病理過程導致腺泡細胞內(nèi)線粒體損傷，進而導致細胞能量代謝障礙。隨后線粒體損傷與ATP耗竭、線粒體通透性改變、自噬損傷等多種病理機制介導腺泡細胞損傷和壞死，觸發(fā)炎癥反應[3-5]。此外AP的病情與壞死程度直接相關(guān)，而線粒體在調(diào)控細胞凋亡壞死平衡中具有重要作用。因此對線粒體損傷在AP發(fā)展過程中的基本病理機制進行深入探討可為臨床上AP的治療開辟新的途徑。

1 正常腺泡細胞線粒體功能與分布

線粒體是真核細胞內(nèi)由內(nèi)膜和外膜兩部分組成的細胞器，由外到內(nèi)分為外膜、膜間隙、內(nèi)膜以及基質(zhì)4 個功能區(qū)。線粒體內(nèi)膜向內(nèi)凹陷形成嵴，包含呼吸鏈蛋白和各種酶系，在膜間隙和基質(zhì)之間形成相對不滲透的屏障；外膜具有孔蛋白構(gòu)成的親水通道，對離子和小分子的通透性較高[6]。線粒體的主要功能是為細胞提供各種功能活動所需要的能量。此外，線粒體還是細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生的主要來源，并且在細胞氧化應激、細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡中均有重要調(diào)控作用[7]。

胰腺腺泡細胞中有3組不同的線粒體，分別是位于顆粒區(qū)和基底外側(cè)區(qū)之間邊界上的粒周線粒體，靠近質(zhì)膜處基底外側(cè)區(qū)的外周（或質(zhì)膜下）線粒體，和圍繞著細胞核的核周線粒體[8]。3組不同的線粒體在細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起著不同的作用。粒周線粒體防止Ca2+信號擴散到細胞的基底區(qū)，將生理Ca2+信號限制在頂端區(qū)域[9]。外周線粒體在局部為Ca2+泵介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取Ca2+提供所需的ATP，并且有充分的證據(jù)表明線粒體功能在鈣庫操控性的鈣內(nèi)流中起著至關(guān)重要的作用[9-10]。而核周線粒體作為細胞核的保護屏障，使細胞核免受Ca2+信號的入侵[8]。

2 線粒體鈣超載

最近研究[11]表明線粒體損傷和ATP耗竭在AP的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而腺泡細胞內(nèi)Ca2+濃度病理性升高是AP發(fā)病早期的標志性事件[12]。膽汁酸和非氧化乙醇代謝物可導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放，并激活腺泡細胞膜上的鈣釋放激活鈣通道蛋白1（ORAI1）誘導細胞外Ca2+內(nèi)流[13]。細胞內(nèi)Ca2+濃度的持續(xù)升高導致線粒體Ca2+超載和細胞內(nèi)ATP生成減少[14]。在這種情況下粒周線粒體不能緩沖頂端Ca2+濃度的升高，導致局部的Ca2+信號擴散到整個腺泡細胞[15]。由于ATP是肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶（sarco-endoplasmic reticulum Ca2+pump，SERCA）和質(zhì)膜Ca2+-ATP酶（plasma membrane Ca2+ATPase，PMCA）清除胞漿中Ca2+所必需的[16]，ATP生成的降低會損害細胞內(nèi)Ca2+清除能力，從而進一步促進了胞內(nèi)Ca2+的持續(xù)升高。持續(xù)的Ca2+超載導致線粒體膜通透性改變和線粒體損傷，這種惡性循環(huán)最終導致腺泡細胞壞死。因此，抑制或消除鈣超載的毒性作用是AP的一個潛在治療靶點，而Orai1通道的小分子抑制劑是目前治療AP最有前途的藥物之一[17]。Waldron等[18]應用ORAI1通道抑制劑CM4620減輕了AP小鼠和人腺泡細胞的壞死。目前該藥已完成第一階段臨床試驗，將進入第二階段臨床試驗以評估其在AP患者中的安全性和有效性[12]。

3 細胞內(nèi)ATP 耗竭

Maléth等[19]在離體豚鼠胰腺導管上皮細胞中觀察到高濃度的非結(jié)合膽汁酸引起線粒體的形態(tài)學損傷和隨后的ATP耗竭。此外，他們還發(fā)現(xiàn)ATP耗竭可直接抑制胰管碳酸氫鹽和液體的分泌。在膜片鉗全細胞記錄中通過增加貼片移液管中ATP的濃度可以在體外補充細胞ATP。Judák等[20]通過貼片移液管在細胞內(nèi)給予5 mM ATP降低了乙醇、棕櫚油酸、棕櫚油酸乙酯對分離豚鼠胰腺導管上皮細胞中囊性纖維跨膜調(diào)控因子（cystic fibrosis transmembrane regulator，CFTR）氯離子通道的抑制作用。Booth等[21]用同樣的方法補充ATP阻止了?；悄懰崃蛩猁}（TLC-S）導致的腺泡細胞內(nèi)Ca2+的持續(xù)升高和壞死。這些研究提示體外補充ATP可以防止AP時腺泡和導管細胞的功能障礙和損傷，然而這種方法仍只能停留在實驗研究階段。一項多中心雙盲隨機對照臨床研究[22]表明，通過早期高熱量腸內(nèi)營養(yǎng)來維持ATP生成對AP患者來說是必要的。此外，近年來臨床對腸道喚醒作用的重視使得腸內(nèi)營養(yǎng)成為AP治療過程中的關(guān)鍵一環(huán)[23]。

4 線粒體膜通透性改變

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochon drial permeability transition pore，MPTP）是位于線粒體內(nèi)膜上的對環(huán)孢菌素A敏感的高電導通道，由Ca2+激活。一旦被激活，它允許小于1500 Da溶質(zhì)和水在線粒體內(nèi)膜上非選擇性擴散[24]。MPTP形成的具體分子機制還未完全明確，最近有研究[25-26]表明F0F1ATP合成酶參與MPTP的形成。MPTP有一過性開放和持續(xù)性開放兩種開放狀態(tài)。前者被認為是生理性的，通過在線粒體基質(zhì)和信號傳導所需的細胞質(zhì)之間快速交換溶質(zhì)（例如Ca2+，氧自由基）來發(fā)揮生理作用。而持續(xù)性的開放則是病理性的，導致線粒體膜電位喪失，活性氧釋放，細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)受損，線粒體腫脹，以及促凋亡因子釋放到細胞質(zhì)中以引發(fā)細胞死亡[24]。這兩種功能均受親環(huán)素D的調(diào)控[27]。

胰腺炎致病因素通過第二信使受體三磷酸肌醇（inositol 1, 4, 5-trisphosphate receptor，IP3R）引起鈣的異常釋放，從而使對鈣信號敏感的胰腺腺泡線粒體超載，進而引起高電導MPTP的持續(xù)開放和膜電位喪失，導致ATP生成崩潰和隨后的壞死[28]。而在小鼠或人胰腺腺泡細胞，藥理性或遺傳性地抑制MPTP對AP中的膜電位丟失、ATP生成障礙和壞死有保護作用[28]。這一機制在雨蛙素誘導、TLC-S誘導、脂肪酸乙酯誘導和氨基酸誘導胰腺炎等多種AP模型中得到證實，在親環(huán)素D基因敲除小鼠和給予PMTP抑制劑TRO40303的野生型小鼠中典型的病理反應明顯減輕[28-29]。此外，另一研究[30]顯示親環(huán)素D小分子抑制劑也能通過保護線粒體減輕小鼠和人腺泡細胞的壞死，改善AP的嚴重程度。綜上所述MPTP是AP治療的一個潛在藥物靶點，然而無論是TRO40303還是親環(huán)素D抑制劑都需要進一步的臨床試驗以驗證其臨床有效性。

5 腺泡細胞自噬受損

生理條件下，大自噬通過自噬體形成，及隨后的自噬體與溶酶體融合來降解衰老、受損的細胞器，從而對腺泡細胞發(fā)揮保護作用[31]。而當溶酶體相關(guān)膜蛋白（LAMPs）降解導致自噬受損時，大量異常增大的含有未消化降解物質(zhì)的自噬體堆積，導致腺泡細胞酶原顆粒的降解效率降低和酶原激活[32-33]。自噬效率降低主要表現(xiàn)為胰腺的自噬標記物LC3-II和自噬底物p62/SQSTM1水平的增加，泛素化蛋白積累增多[34]。AP中溶酶體蛋白水解功能下降的一個特點是組織蛋白酶的加工成熟缺陷，尤其是關(guān)鍵的組織蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）。有研究[35]發(fā)現(xiàn)在L-精氨酸（L-Arg）誘導AP 模型中，親環(huán)素D 基因敲除不僅恢復了CTSB的加工成熟，而且使自噬通量正常，導致LC3-II、p62和泛素化蛋白水平下降和腺泡細胞空泡化的明顯減少。為了進一步證實AP中線粒體與自噬損傷的關(guān)系，研究者使用GFP-LC3小鼠與親環(huán)素D基因敲除小鼠雜交的小鼠，親環(huán)素D在GFPLC3小鼠體內(nèi)的消融幾乎完全阻止了Arg-AP誘導的內(nèi)源性LC3-II和GFP-LC3-II的積累[28,35]。另有研 究[36]表明，Arg-AP激活的線粒體自噬同樣被親環(huán)素D基因敲除所阻止。親環(huán)素D敲除使自噬正常化提示自噬受損可能是線粒體損傷的關(guān)鍵下游效應。

近年來的研究顯示調(diào)控自噬的藥物可能對AP的治療具有意義。應用海藻糖使Arg-AP模型中的自噬活性增強后，小鼠的胰腺炎反應明顯減輕，且胰蛋白酶原的活化被完全阻止[35]。此外，BRD4和成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）均能通過上調(diào)SIRT1來恢復自噬通量，從而減輕小鼠AP嚴重程度[37-38]。番茄紅素可通過調(diào)節(jié)自噬來減輕小鼠的AP嚴重程度，然而需要更多的研究來確定其具體機制以及其對人類胰腺炎的預防和治療作用[39]。臨床回顧性研究顯示他汀類藥物可降低AP的發(fā)病率及改善預后[40-41]。而在大鼠AP模型中，辛伐他汀通過誘導自噬體與溶酶體融合恢復了自噬通量，從而減輕了線粒體損傷和AP炎癥反應[42]。辛伐他汀在臨床應用中具有安全性，然而其在AP患者中的有效性還有待臨床試驗來驗證。線粒體損傷和自噬受損都是AP發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進一步研究兩者間具體分子機制與聯(lián)系并使這些途徑正?；兄谡业紸P的潛在治療方法。

6 AP 中細胞死亡的線粒體機制

線粒體除了提供能量，還在細胞死亡的調(diào)控中起著核心作用，包括細胞凋亡和壞死[6]。線粒體調(diào)節(jié)細胞死亡的核心作用主要通過線粒體膜通透性（mitochondrial membrane permeabilization，MMP）來實現(xiàn)。線粒體膜通透性觸發(fā)凋亡和壞死途徑的主要形式分別是線粒體駐留蛋白細胞色素C釋放進入胞質(zhì)和線粒體去極化。線粒體去極化由MPTP介導，導致膜電位喪失并最終引起ATP耗竭和壞死。而線粒體外膜通透性（mitochondrial outer membrane permeability，MOMP）系統(tǒng)調(diào)控細胞色素C的釋放，細胞色素C可與凋亡蛋白酶激活因子1和凋亡蛋白procaspase-9相互作用，形成凋亡小體并激活procaspase-9。caspase-9依次激活效應物caspase例如caspase-3，進而介導下游的凋亡事件[43]。因此，線粒體中的MMP是調(diào)節(jié)細胞兩種死亡途徑的中心環(huán)節(jié)。

腺泡細胞死亡是AP 的主要病理反應之一，在AP過程中，腺泡細胞同時發(fā)生壞死和凋亡。值得注意的是，動物模型中AP的嚴重程度與壞死程度成正比，與凋亡程度成反比[44]。此外，刺激腺泡細胞凋亡可減少壞死和AP的嚴重程度，而應用caspase抑制劑抑制凋亡則壞死加重[44]。經(jīng)典的MPTP開放的一個關(guān)鍵特征是線粒體腫脹，導致線粒體外膜破裂。而胰腺MPTP具有與典型MPTP不同的性質(zhì)特點，Ca2+誘導的離體胰腺線粒體去極化與腫脹和線粒體外膜破裂無關(guān)[45]。此外，Ca2+誘導的去極化使胰腺線粒體中的ROS顯著降低[45]，而肝和其他器官線粒體中的MPTP開放則導致ROS大量釋放。研究[46]表明ROS氧化心磷脂可促進細胞色素C脫離，增加細胞膜間隙細胞色素C水平從而引起釋放。因此，由于胰腺MPTP的特殊性，其內(nèi)存在一種負反饋調(diào)節(jié)，即線粒體去極化抑制細胞色素C的釋放。這種負調(diào)控機制的影響是膜電位的丟失不僅介導壞死，同時也會抑制細胞凋亡。由此可見，胰腺炎腺泡細胞的死亡方式是在線粒體水平上通過Ca2+、膜電位水平和ROS的相互作用來調(diào)控的[47]。

此外，Bcl-2家族蛋白也是細胞死亡的重要調(diào)控因子，尤其是對凋亡的調(diào)控，它們通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性，介導細胞色素C釋放到胞質(zhì)中來發(fā)揮作用[48]。對分離的線粒體和腺泡細胞的研究表明，上調(diào)蛋白Bcl-XL和Bcl-2的表達通過防止線粒體去極化和隨后的ATP耗竭防止胰腺腺泡細胞壞死[49]。此外，研究顯示高壓氧療法通過誘導AP大鼠caspase依賴的凋亡減輕AP嚴重程度，其機制可能是通過Bcl-2家族成員調(diào)控線粒體凋亡途徑[50]。缺氧誘導因子1α基因敲低通過維持線粒體穩(wěn)態(tài)改善細胞內(nèi)能量應激，減輕壞死促進凋亡，從而降低AP炎癥反應[51]。靶向線粒體對細胞凋亡與壞死的平衡進行調(diào)控可能是AP的一個潛在治療策略。

7 總結(jié)與展望

AP的病理發(fā)展機制是由多種因素介導的復雜生物學過程，而線粒體損傷在其中的作用越來越受到關(guān)注。鈣超載、ATP耗竭、線粒體膜通透性改變、自噬受損等在AP病理發(fā)展過程中互相影響，而作為細胞能量供應中心，線粒體的損傷始終貫穿在這些病理機制中，深入探討其與各個環(huán)節(jié)之間的具體機制，有助于找到新的臨床上治療AP的方法。此外，線粒體對細胞死亡途徑的調(diào)控也在AP中發(fā)揮著重要作用，然而線粒體是否可以作為靶點在臨床上治療AP仍需要更進一步的探究。