顱內動脈瘤易感基因及檢測技術研究進展

劉軍 綜述 黃瑋 審校

1.柳州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 柳州 545006；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西 南寧 530021

顱內動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是由于顱內動脈內皮層薄弱導致的，以管壁變薄和局限性擴張為特征的獲得性腦血管異常疾病。比較常見的部位在頸內動脈、前交通與大腦前動脈的交界處、眼動脈與頸內動脈分叉部位、大腦中動脈的分叉部位[1]。從IA的發(fā)生到破裂出血這一過程受到多因素影響，包括了先天遺傳和后天因素。雖然相關報道很多，但不同國家和人種的研究結果迥異。因此，易感基因的多態(tài)性及人群、人種間差異及其影響因素成為今后研究的重點。為了更深入地研究顱內動脈瘤發(fā)生和發(fā)展的易感基因、檢測技術發(fā)展狀況，本文對近年來的相關研究進行系統(tǒng)綜述。

1 顱內動脈瘤的流行狀況

一項顱內動脈瘤的Meta 分析顯示，普通人群IA的平均發(fā)病率為3%左右[2]。而在年發(fā)病率0.9/10萬的蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)患者中，85%是由IA破裂引起。若沒有獲得及時且有效的救治，SAH 的病死率可達到50%，約占腦血管意外病亡事件的5%，即使獲得及時治療，仍然有部分患者面臨著再破裂出血的風險。因此，探查IA和其所致SAH的發(fā)病因素，開展一級和二級預防尤為關鍵[3]。然而，目前國內外關于IA影響因素的研究僅處于探索階段，不同地區(qū)和人群差異較大，確切的因素還有待更多的實證研究。

2 不同人群顱內動脈瘤發(fā)病的危險因素

不同的人種，IA 的發(fā)病率以迥然不同，特別是東西方的差異。一項以北高加索人種為基礎的研究結果顯示，1.8%的成人可以通過核磁共振篩查發(fā)現(xiàn)顱內動脈瘤[4]。而一項來自我國的橫斷面調查發(fā)現(xiàn)，這一比率高達7%[5]。由此可見，相比北高加索人種，中國人的IA發(fā)病率更為顯著。當然，由于多數(shù)血管性疾病的發(fā)生具有遺傳與環(huán)境交互影響，不能排除東、西方經(jīng)濟和文化差異在IA 致病因素中的貢獻。荷蘭的一項研究顯示，吸煙、高血壓可讓動脈瘤性SAH 發(fā)病率增至2倍，而有家族病史者則可增至6倍[6]。芬蘭30歲以上IA病例的親屬中1/10檢出顱內動脈病變[7]。這些IA 病例呈家族趨向的研究表明，先天因素可能是IA發(fā)病最為重要的危險因素。從血流變學的角度分析，血壓增高可增強血液對血管壁的剪切力和沖擊力，從而刺激形成動脈瘤。從分子生物學角度分析，由于家族特異性基因突變，導致動脈瘤壁中膠原合成量不足，當破壞增加的時候，更容易發(fā)生退變，從而打破動脈內壁自身修復的平衡機制。一系列的聯(lián)動反應，很有可能是解釋顱內動脈瘤形成和發(fā)展的主要原因。因此，有理由相信IA 易感基因的存在，但不同人群的易感基因可能存在一定的差異。因此，易感基因的多態(tài)性及人群、人種間差異將成為下一步研究重點。

3 IA易感基因多態(tài)性

隨著基因掃描定位和基因克隆技術的逐漸優(yōu)化,被復制的疾病關聯(lián)基因序列越來越多。中國和很多生物技術較發(fā)達的國家已經(jīng)可以應用孟德爾遺傳病(單基因病)的基因診斷技術有效控制甲型血友病、血紅蛋白病等先天性疾病的發(fā)病率[8-11]。但是糖尿病、高血壓和研究者所關注的IA，其環(huán)境誘因和遺傳因素在起作用程度各異。某一個易感基因位點或一小段序列結構上的變化不足以引起疾病發(fā)生，而有可能是若干易感基位點突變的微小作用的累加效應。然而，對于多基因病的分子診斷，目前還主要依靠疾病的表型，如測定血糖、血壓等。人類基因組多態(tài)性雖然具有一定的復雜性，但卻是多基因病基因診斷的基礎。IA 易感基因多態(tài)性的分析能夠幫助研究者更為全面的了解多基因共同病致病的機理，并有效的對疾病進行診斷、分型和提出個性化治療方案。由于不同受檢人群的易感基因多態(tài)性差異比較大，因此需要進行歸類分析。目前報道較多的、可重復性高的IA相關基因有Toll 樣受體基因、CDKN2B-AS1 基因、MYH11 基因、SMAD3基因、內皮一氧化氮合酶(ENOS)基因。

3.1 Toll 樣受體(TLR4)基因多態(tài)性 IA 的病理和生理起因與動脈壁的慢性炎性反應關系密切。其中，核素-kappa B(NF-κB)被證明是腦動脈炎性反應和動脈瘤形成和發(fā)展的關鍵中間介質[12]。而TLR4有助于刺激NF-κB 在動脈粥樣硬化動脈壁中被激活。日本的一項研究提示，無論是人類還是試驗大鼠，TLR4基因表達區(qū)域都位于腦動脈瘤壁上的內皮細胞層中，在IA 形成的早期呈現(xiàn)過渡上調的趨勢。同時，TLR4 基因的表達也啟動了NF-κB 及其炎性反應[13]。北京地壇醫(yī)院的學者鑒定了11 022 組動脈瘤病例組織與對照組織間的差異甲基化位點，篩選出了包括TLR4 在內的三個基因與IA 發(fā)生、發(fā)展有較強的相關性，TLR4 基因呈現(xiàn)出了高表達和低甲基化的特性[14]。重慶市的臨床研究也表明了TLR4多態(tài)性與IA有較強的相關性，主要突變位點為rs11536889[15]。

3.2 CDKN2B-AS1 基因多態(tài)性 日本和幾個歐洲國家聯(lián)合實施的全基因組研究(GWAS)和病例對照復制分析制定了一個IA常見突變位點文庫[16]。其中的HDAC9、EDNRA、RP1、SOX17、RBBP8 和CDKN2B-AS1基因位點上或附近區(qū)域的常見突變與IA 有關。我國湖南省人民醫(yī)院通過對以上基因進行驗證發(fā)現(xiàn)，只有CDKN2B-AS1 基因，特別是其rs10757272 上的多態(tài)性與IA發(fā)病顯著相關[17]。這一點說明，該基因的突變在我國人群中識別IA具有一定的意義。

3.3 MYH11 基因多態(tài)性 MYH11 基因所表達的是平滑肌細胞中特有的肌球蛋白重鏈，是平滑肌細胞收縮的主要組成單元。一項關于主動脈夾層和胸主動脈瘤的研究顯示，MYH11 和ACTA2 基因之間的交互作用可以調節(jié)平滑肌細胞的收縮，這對維持大動脈完整結構起到至關重要的作用[18]。同時，MYH11也在動脈瘤組織中參與了多信號通路的調節(jié)，進一步改變炎性反應和細胞骨架，因此，MYH11 多態(tài)性可能在動脈瘤的發(fā)生發(fā)展中起到較為重要的作用[19]。

3.4 SMAD3基因多態(tài)性 平滑肌細胞中的轉化生長因子β(TGF-β)信號也有助于維持血管結構完整性，減少正常胚胎發(fā)育后胸主動脈內、外膜間的相互作用。多項研究證明，SMADs 基因調控蛋白可幫助TGF-β的典型信號通路進行細胞核內基因轉錄。在SMADs 蛋白中，由SMAD3 基因編碼的SMAD3 是調節(jié)膠原表達、細胞外基質沉積和纖維化反應的關鍵蛋白[20]。因此，SMAD3被證實為家族性胸動脈瘤的主要病因[21]，但其對IA的影響有待進一步臨床研究。

3.5 ENOS 基因多態(tài)性 內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，ENOS)以L-精氨酸為底物，利用氧生成一氧化氮和L-瓜氨酸，在血管內皮細胞中發(fā)揮舒張血管、調節(jié)血壓、松弛血管平滑肌和抑制內皮細胞增殖的作用。美國和土耳其的研究均發(fā)現(xiàn)ENOS 的多態(tài)性與SAH 是有關的[22]?？墒牵谌毡竞晚n國的研究發(fā)現(xiàn)，其變異等位基因的分布在破裂組及未破裂組之間沒有統(tǒng)計學差異[23]。ENOS基因的多態(tài)性與蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生有一定的相關性。

4 顱內動脈瘤的分子檢測技術進展

高分辨率的基因組識別技術是易感基因探索的先決條件。自1953年Watson和Criek提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結構模型，到1990年人類基因組計劃的正式啟動，再到2001年2月科學家宣布完成人類基因組的全部序列圖譜，這半個世紀中生命科學檢測領域已經(jīng)取得了質的飛躍。目前用于IA 易感基因檢測的方法主要有染色體陣列技術(基因芯片技術)、比較基因組雜交技術和基因測序技術。

4.1 染色體陣列技術 染色體陣列技術也叫基因芯片技術(gene chip)，屬于計算機芯片的一種，在生物芯片中應用最為廣泛，已經(jīng)趨于成熟[24]。其技術屬分子雜交，通過基因探針和固化在支持物上的cDNA、EST 或寡核苷酸雜交，經(jīng)洗脫、激光掃描后，運用計算機將所得的信號進行自動化分析。該技術在基因發(fā)現(xiàn)，基因組學研究，尤其是在基因表達譜的研究中具有非常重要的價值。

4.2 比較基因組雜交 比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)是將消減雜交、熒光原位雜交相結合，用于檢測DNA序列的拷貝數(shù)變異并將其定位在染色體上的方法[25]。技術的整體操作性較好，能一次性對相關的備選基因組進行整體測試，能篩查出染色體的微重復、微缺失和非整倍體等變異。但其不足有：(1)于分辨率不高一般只有5～10 Mb；(2)不能檢測多倍體DNA；(3)嵌合體能力有限，收到克隆敏感性和空間分辨率制約；(4)常出現(xiàn)臨床意義不明的拷貝數(shù)變異，無法判斷相關因子屬于正向影響還是負向影響[26]。

4.3 基因組測序 對于多易感基因檢測，基因組測序特別是全基因組測序，由于其囊括了各種可能的突變位點，具有較高的分辨率，可以全面的分析可能存在與疾病先關的多態(tài)性片段和位點[27-28]。1977 年Sanger 等科學家發(fā)明的雙脫氧核苷酸末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學降解法，標志著第一代測序技術的誕生。此后經(jīng)過幾十年的發(fā)展產生了第二和第三代測序技術技術，逐漸實現(xiàn)了高通量、低成本、長讀取長度。全基因組測序雖然分辨率最高，但其費用仍然比較昂貴，且分析繁瑣、復雜。相比之下，多重PCR靶向二代測序SNP分型方法相比于形態(tài)學、免疫學以及生物化學方法有著明顯優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在測序通量大、建庫方便、測序深度高、特異性強、分辨率高和性價比高等方面。多重PCR靶向二代測序方案，在兩端添加的條形碼可以一次對上萬個樣本進行標記，并在單次上樣可得全部序列，使得高通量的樣本得以快速有效鑒定。在建庫過程中，只需幾步PCR 反應擴增，純化后可以直接進行測序，建庫方便[29]。在費用上，考慮到PCR的試劑費用以及一部分不當損耗，分攤到每個樣本，引物加上反應試劑的費用微不足道。

5 展望

總之，IA的發(fā)生是先天易感和后天環(huán)境共同參與的結果，通過系統(tǒng)綜述發(fā)現(xiàn)，亞洲地區(qū)和世界其他地區(qū)的易感基因位點有一定差異。當然，目前由于病例數(shù)較少，基因檢測費用較高，還缺乏大樣本的證據(jù)。探索其確切的發(fā)病機制及影響因素還需要基于多中心、大樣本的更多的實證研究?？尚械幕驒z測技術已經(jīng)逐漸更新至二代基因測序技術，多重PCR靶向二代測序方案在這一領域更具優(yōu)勢，但仍需解決檢測費用的瓶頸。