程序性細胞死亡蛋白配體1 在結直腸癌免疫治療中的 研究進展

馮道夫，章志翔

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院 普通外科，天津 300052）

William Coley教授首先發(fā)現(xiàn)免疫宿主系統(tǒng)對控制癌癥的進展起到關鍵作用，他發(fā)現(xiàn)進展期肉瘤患者因同時感染兩種嚴重的細菌性皮膚病而使腫瘤完全緩解（CR）[1]。再者，免疫生物學揭示了免疫檢查點可協(xié)助腫瘤逃逸，從而研發(fā)出很多新型治療手段，如：細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4，CD152）、程序性細胞死亡蛋白1 （P D-1，C D 2 7 9）/程序性細胞死亡蛋白配體1（PD-L1，CD274，B7-H1）[2-4]。黑色素瘤、腎細胞癌與非小細胞肺癌已經(jīng)表明免疫檢測點抑制治療能夠持久緩解腫瘤生長。例如，轉移性黑色素瘤同時接受ipilimumab（抗CTLA-4抗體）與nivolumab（抗PD-1抗體），17%患者達到完全緩解效果，2年總體生存率達79%[5]。因此，免疫治療能夠使難治性腫瘤達到完全緩解，并有較長的緩解期。隨著抗PD-1單抗的上市，哪類患者能夠通過生物標記物來預測抗PD-1/PD-L1治療的療效顯得尤為重要。這樣不僅能夠知道哪些患者對該治療沒有效果，而且能夠減少患者出現(xiàn)抗體所致的自身免疫副作用[6]。

P D-1 是T 細胞免疫檢查點，其作用是在T 細胞活化效應期阻止自身免疫發(fā)生，也誘導細胞表達的PD-L1與程序性細胞死亡蛋白2（PD-L2，B7-DC）產(chǎn)生免疫耐受[7]。類似于CTLA-4，PD-1也可表達在調節(jié)T細胞（該免疫細胞可作用于免疫抑制的腫瘤微環(huán)境）以及活化的B細胞與NK細胞上[7]。P D-1/P D-L 1 的活化導致T 細胞的免疫耐受。在PD-1與PD-L1敲除小鼠實驗中，自身免疫表型要輕于CTLA-4敲除鼠[8-9]。該結論與臨床實踐中抗CTLA-4單抗比抗PD-1或抗PD-L1抗體出現(xiàn)的副作用較多是一致的[10]。

PD-L1表達在不同的細胞上，包括胎盤、血管內皮、胰腺胰島細胞、肌肉、肝細胞、上皮、間充質干細胞、B細胞、T細胞、樹突細胞、巨噬細胞以及肥大細胞[11]。PD-L2作為PD-1第二個配體，存在表達的細胞更局限，主要在樹突細胞、巨噬細胞以及肥大細胞上[12]。免疫攻擊因釋放IFN-γ導致黏膜的PD-L1上調，從而形成“免疫護盾”來保護慢性炎癥或感染所致的自身免疫損傷。上調的PD-L1與T細胞的PD-1相結合，達到消耗T細胞的目的[13]。與正常黏膜防止自身免疫攻擊作用相似，腫瘤細胞通過過表達的PD-L1來躲避免疫監(jiān)視，從而使腫瘤生長。本文主要對前期的臨床實踐經(jīng)驗與PD-L1免疫組化作為應用抗PD-1免疫治療前的生物標記物指標進行總結。

1 實體腫瘤的PD-L1 過表達

目前，PD-1/PD-L1抑制劑均需檢測PD-L1的表達。PD-L1的檢測是基于細胞蛋白水平的檢測，因此臨床試驗中以免疫組化方法為主。免疫組化是檢測蛋白表達的經(jīng)典手法，其通過抗體著色后由病理醫(yī)師鏡下觀察根據(jù)著色深淺來評價表達情況。目前在非小細胞肺癌治療中，對于每個PD-1/PD-L1抑制劑，開發(fā)了特異性PD-L1免疫組化檢測方法，以評估非小細胞肺癌中惡性腫瘤或免疫細胞上的PD-L1表達水平。

多種實體瘤能夠通過表達PD-L1來形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境并躲避T細胞的殺傷作用，這些腫瘤包括黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、胸腺瘤、卵巢癌以及結直腸癌。腫瘤PD-L1過表達的患者可能預后較差，這也使得治療上要著重研究于PD-1/PD-L1靶線軸上[14-18]。隨著HER-2過表達腫瘤的靶向治療獲得突破，免疫組化來篩選PD-L1表達的腫瘤患者顯得尤為重要[19]。然而，無論是哪種腫瘤會對抗PD-1/PD-L1治療有效，還是哪些患者會從治療中受益，利用免疫組化檢測PD-L1已成為重要的問題。

目前發(fā)現(xiàn)過表達P D-L 1 的腫瘤比例范圍很廣，這是因為受到很多因素的影響。目前該治療對黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌以及膀胱癌均有所效果，免疫組化表達PD-L1的范圍在14%～100%，這也表明PD-L1可以作為該治療的生物標記物[20-21]。在血液腫瘤中，流式細胞儀檢測的腫瘤PD-L1表達范圍在37%～58%，這是因為EBV與HTLV病毒引起的癌癥中PD-L1表達較高所致。與之相比，腫瘤組織學對檢測免疫檢查點不敏感，如結直腸癌與肉瘤，其檢出率在12%～53%，這也說明P D-L 1 免疫組化檢測不是決定P D-1/PD-L1表達情況的唯一手段[22]。

在結直腸癌中， 微小衛(wèi)星灶不穩(wěn)定型（MSI-H）腫瘤有較好的預后，這與腫瘤具有較高的T I L s 有關[23-24]。再者，與微小衛(wèi)星灶穩(wěn)定型（MSS）相比，MSI-H的結直腸癌具有較高的PD-L1表達水平（56% vs. 21%，P=0.007），這也預示著該類患者可能從PD-1/PD-L1 治療中獲益[25]。其中一種解釋是，MSI-H腫瘤缺少自身修復D N A 錯配的能力，突變的風險更高并能形成更多的新型抗原。這些新型抗原具有免疫原性，在MSI-H結直腸腫瘤微環(huán)境中能夠提高腫瘤浸潤淋巴細胞（T I L s）水平[26]。再者，免疫抑制的腫瘤微環(huán)境由免疫檢查點過表達（如PD-L1）而形成。臨床試驗方面，MSI-H結直腸癌免疫檢查點的抑制作用正在研究階段（N C T 0 2 0 6 0 1 8 8，NCT01876511）[27-28]。腫瘤的突變風險可能與免疫治療效果有關。從組織學來看，高突變風險（黑色素瘤、非小細胞肺癌與膀胱癌）也與免疫檢查點阻斷劑的療效有關，包括聯(lián)合治療[29-31]。這可能是因為大量的腫瘤突變可能誘導出“高質量”的免疫源性多肽，從而使檢查點抑制治療發(fā)揮出抗腫瘤的反應[32]。

2 PD-L1 免疫組化技術問題

2017年5月5日，VENTANA PD-L1（SP263）檢測獲得CE認證，作為抗PD-1治療KEYTRUDA的體外診斷檢測，檢測非小細胞肺癌腫瘤細胞膜中PD-L1的表達水平有助于識別適用pembrolizumab治療的患者。通過VENTANA PD-L1（SP263）檢測出腫瘤細胞膜中P D-L 1 的表達水平可能與nivolumab治療后生存期延長有關。目前PD-L1檢測仍然存在一些問題包括：檢測技術方面，如不同的檢測抗體、平臺以及不同的閾值的問題；生物學方面，如腫瘤內和腫瘤間異質性；組織來源方面，如細胞學標本，存檔標本與新鮮標本，原發(fā)部位與轉移灶等。

人類腫瘤樣本的PD-L1免疫組化表達是受很多因素影響的?？梢岳枚喾N手段來檢測PD-L1免疫組化抗體，包括2 8-8，5 H 1，M I H 1 以及405.9A11。這些檢測手段的特征區(qū)別還不清楚。缺少對“陽性”腫瘤PD-L1免疫組化染色的明確定義是最大問題，其腫瘤細胞染色的臨界值確定范圍由1%～50%，無法統(tǒng)一。這與腫瘤微環(huán)境中PD-L1表達的異質性相關[33-34]。

再者，免疫組化抗體對PD-L1的結合位點較少，因為其僅包含兩個小的疏水區(qū)域，而免疫組化常用的福爾馬林固定石蠟包埋方法（FFPE）效果較差[35-36]。由于缺少相應的結合位點，免疫組化抗體必須選擇獨特的疏水位點來與PD-L1相結合。再者，PD-L1免疫組化的臨界值無法統(tǒng)一，PD-L1免疫組化檢測系統(tǒng)的多樣化，這些都成為了臨床研究生物標記物的障礙。

目前PD-1/PD-L1抑制劑都有對應的PD-L1檢測方法，但是每種檢測所用到的抗體和技術都不同，導致PD-L1表達水平的設定不同，同時對于不同的瘤種PD-L1表達水平的設定也不同。國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）在內的多個國際組織都在努力推進不同PD-L1表達檢測技術分析，以期能夠提供不同檢測間可靠的對比數(shù)據(jù)。

3 PD-L1 免疫組化生物學機理

從機制上講，僅在細胞膜上表達時，通過IFN-γ誘導或致癌基因激活，PD-L1才表現(xiàn)出生物學活性[37]。與炎癥引起的PD-L1表達不同，致癌基因介導的PD-L1表達具有獨特的組織病理學與生物學特征。炎癥引起的PD-L1主要是通過IFN-γ介導的局部免疫應答來實現(xiàn)，而致癌基因的PD-L1表達是整體彌散的。在炎癥反應中的PD-L1作為適應性免疫抗性的組成部分，往往與免疫反應有關，而致癌基因介導的PD-L1表達不存在免疫浸潤反應[38-39]。大量的信號通路與組織學PD-L1表達有關。在結直腸癌中，PTEN的缺失或BRAF的過表達與PD-L1上調有關。激活Akt與RAS通路聯(lián)合PTEN缺失會導致免疫組化中PD-L1高水平表達，并降低體外T細胞的殺傷能力[39]。在結直腸癌細胞系中，siRNA下調PTEN會導致PD-L1過表達，與IFN-γ刺激無關[40]。值得注意的是，這些研究的PD-L1免疫組化染色顯示，在腫瘤中PD-L1呈彌散性分布，這與致癌基因介導的PD-L1表達結果一致。PD-L1上調與PI3K、mTOR及MEK/ERK信號均相關，所以PD-L1的調控涉及很多信號通路，而不是單一的?？傊?，很多信號通路與PD-L1調節(jié)有關，這也說明靶向治療與免疫治療聯(lián)合用藥的必要性。

與致癌基因介導的PD-L1表達相比，IFN-γ誘導的PD-L1表達是指動態(tài)的生物標志物，并有明確的炎癥發(fā)生部位，在活檢樣品中可以發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫微環(huán)境的具體情況。在腫瘤代謝微環(huán)境中，其他因素（如缺氧）能夠通過HIF1α誘導PD-L1上調[41-42]。PD-L1主要表達在腫瘤表達，與免疫細胞分泌的IFN-γ相結合。該假說是指PD-L1過表達可能是腫瘤在被TILs殺傷時起到的保護作用，并形成免疫抑制的腫瘤微環(huán)境。這與PD-1的生物學特性相一致，T細胞的PD-1上調與T細胞活化有關。然而隨著時間的推移，PD-1過表達則是T細胞耗竭的標志，可能是因為其他免疫檢查點的表達，如LAG-3、TIM-3等等。因此，PD-L1免疫組化的結果依賴于組織活檢的時間與是否接受過治療這兩方面。這就能夠解釋在黑色素瘤與卵巢癌中PD-L1表達與預后良好有關，而在其他組織中（如腎癌）則與預后較差有關[22,43-44]。

除了在時間的影響，腫瘤PD-L1的空間因素也需要考慮。很少有文章去比較原發(fā)瘤與轉移瘤之間表達PD-L1的差別。原發(fā)瘤與轉移瘤的PD-L1表達量相近。然而，在結直腸癌中，33例樣本中 5例不一致，3例患者僅在原發(fā)瘤中表達PD-L1，而2例患者僅在轉移瘤中表達[45]。在接受PD-1/PD-L1治療后，目前這些患者的臨床緩解率仍未報道，但僅依靠PD-L1作為陰性生物標記物來作為PD-1/PD-L1免疫治療的排除標準是不可取的。再者，是否選擇合適的病理部位進行活檢也是需要考慮的。而在FFPE處理之前，原發(fā)性腫瘤標本的直接檢測可能更具有意義。

4 PD-L1 免疫組化的臨床實踐經(jīng)驗

研究顯示，P D-L 1 的表達與P D-1/P D-L 1 抑制劑的療效相關。KEYNOTE-024研究結果也表明，PD-L1表達對pembrolizumab至關重要。基于KEYNOTE-024研究結果，F(xiàn)DA批準對于PD-L1表達≥50%，且無明確驅動基因突變的初診的晚期非小細胞肺癌患者可以一線選擇pembrolizumab。目前，PD-L1檢測已經(jīng)寫進了肺癌NCCN指南。此外，相關臨床試驗的研究顯示在MSI-H的結直腸癌中，PD-L1的表達水平與患者使用免疫檢查點抑制劑的療效亦存在關聯(lián)。

對于結直腸癌而言，很多PD-1/PD-L1免疫治療正在進行臨床研究階段。而很多臨床研究沒有報道，或正在申請PD-L1免疫組化作為診斷手段的專利，限制了PD-L1作為生物標記物的數(shù)據(jù)。再者，免疫組化臨界值不同也影響其標準化的建立。盡管如此，目前研究數(shù)據(jù)表明，免疫組化PD-L1過表達與提高緩解率、無瘤生存率及總生存率有關。

基于對MSI-H腫瘤免疫原性腫瘤微環(huán)境的認識，以及抗P D-1 治療的顯著成效。在臨床試驗中，10例MSI-H結直腸癌患者中，有4例（40%）達到了免疫相關的臨床緩解。免疫相關的緩解評估主要依賴于RECIST原則。利用PD-1抑制劑nivolumab對MSI-H腫瘤進行了進一步的臨床研究。70例MSI-H腫瘤患者在2周內用nivolumab進行治療。在最初的報告中，47例隨訪至少12周的患者中，12例（26%）達到了臨床緩解，平均達到緩解時間為2.12個月。另有14例（30%）患者達到病情穩(wěn)定，疾病控制率為55%。在美國臨床腫瘤學家協(xié)會（ASCO）GI癌癥研討會的后續(xù)報告中，緩解率（ORR）為31%，其中69%的患者通過評估達到了病情穩(wěn)定的效果。雖然該研究比pembrolizumab的治療效果要小，但這些結果表明該藥物能顯著改善患者病情。不同緩解率的原因尚不清楚，可能與患者人群的差異有關，而不是與藥物的療效不同有關。

與其他種類癌癥一樣，nivolumab和ipilimumab聯(lián)合應用的臨床療效已得到肯定。在CheckMate 142中，nivolumab聯(lián)合ipilimumab給藥，隨后nivolumab單藥治療。30例患者中，27例可在中期分析中進行評估。9例（33%）患者達到臨床緩解，14例（52%）患者病情達到穩(wěn)定，疾病控制率85%。聯(lián)合用藥方法似乎提供了更高的疾病控制的可能性，但會出現(xiàn)更多的3/4級免疫不良事件（AEs）?；谶@些數(shù)據(jù)，目前的NCCN指南已經(jīng)進行了修改，將pembrolizumab與nivolumab均納入轉移性或不可切除的MSI-H結直腸癌的治療方案中。

在結直腸癌中，PD-L1陽性的患者似乎更對PD-1/PD-L1 免疫治療敏感?；谀壳坝邢薜臄?shù)據(jù)，MSI-H的結直腸癌中免疫組化高表達PD-L1對PD-1/PD-L1治療的緩解效果更為理想，但對于接受免疫治療PD-L1陰性的患者而言，其緩解與生存資料較少。然而，這方面研究仍需要大量樣本的大型臨床試驗來證實。

PD-L1免疫組化作為預測的生物學標志物應用在很多臨床試驗的癌癥組織檢測中。nivolumab的一期臨床研究包括了黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、轉移性結直腸癌（mCRC）以及轉移性去勢耐藥性前列腺癌（mCRPC）[46-48]。免疫組化應用5H1抗體并且臨界值在5%，60%的腫瘤檢測為PD-L1陽性。PD-L1陽性的腫瘤緩解率達36%，而陰性的緩解率為0%。MPDL3280A試驗應用PD-L1免疫組化技術檢測了黑色素瘤、腎細胞癌、非小細胞肺癌、轉移性結腸癌與胃癌[49-52]。PD-L1陽性的患者緩解率達39%，而陰性的緩解率達13%。

5 總 結

免疫治療代表了多個方面腫瘤治療的范式轉變。雖然靶向治療改善了信號缺失所造成的腫瘤源性問題，但免疫檢查點抑制劑能夠直接調動患者先天性免疫系統(tǒng)達到免疫穩(wěn)態(tài)，由自身耐受轉變?yōu)榫哂屑毎拘?，最終能夠誘導抗腫瘤免疫反應。隨著CTLA-4、PD-1與PD-L1免疫檢查點抑制劑的誕生，人們又把目光放在宿主免疫系統(tǒng)上，而不是腫瘤內部信號轉導的途徑。PD-L1過表達可能不是腫瘤源性的調控基因，但是能夠在微環(huán)境中保護腫瘤而不受免疫細胞的殺傷。

PD-L1過表達的患者對抗PD-L1藥物更為敏感。因此，PD-L1免疫組化可能并不能成為有效的生物標志物。很少有生物標志物能代表兩個變量。例如，一名患者檢測其中一種生物標記物，但患者接受相應的治療后并未得到緩解，這是因為繼發(fā)的生物學或分子改變使得腫瘤繼續(xù)生長。相似的是，生物標志物檢測為陰性的患者可能會從相應的治療中獲益，這是因為活化的生物學通路可能相互作用，從而激活了其他的信號通路。技術方法因素與臨界值的選取標準也可能影響生物標記物的應用?？傊苌俚纳飿擞浳锬軌蛎鞔_界定其臨界值，人們只能通過統(tǒng)計學手段來評估其臨床的應用價值，從而使患者受益。