miR-221在病毒性心肌炎患兒外周血中的表達(dá)及其臨床意義

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一類心肌病毒感染所導(dǎo)致的常見心血管疾病，常見的可導(dǎo)致心肌感染的病毒主要有腺病毒(adenovirus，ADV)和柯薩奇B組病毒(coxsackievims B，CVB)[1-2]。近年來，急性VMC發(fā)病率逐年上升，VMC也是兒科的常見疾病，已成為青少年猝死的主要原因之一，此外還可導(dǎo)致擴(kuò)張型心臟病的發(fā)生，導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)與功能出現(xiàn)異常，嚴(yán)重威脅著兒童的生命健康[3]。迄今為止尚無有效的VMC治療方法，其具體的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，通常僅進(jìn)行對(duì)癥治療，因此探究闡明VMC的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義[4]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，可以通過與靶RNA的非編碼區(qū)結(jié)合而直接抑制蛋白翻譯或降解靶RNA[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在病毒感染性疾病的進(jìn)程中起著重要作用，miRNAs可以調(diào)控宿主與病原體雙方的基因表達(dá)調(diào)控[6]。此外，miRNAs在小鼠心血管疾病模型以及臨床病人的心臟中均有特異性表達(dá)，提示其表達(dá)可能與先天性心臟病的發(fā)生有關(guān)[7]。miR-221在多種腫瘤中高表達(dá)而發(fā)揮癌基因的作用，是miR-221/222家族的成員，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-221在心力衰竭病人血清中高表達(dá)，且miR-221的循環(huán)表達(dá)量在心肌梗死組織中異常高，提示它可作為心肌梗死早期診斷的標(biāo)志物之一[8-10]。因此，本研究對(duì)我院收治的67例VMC患兒進(jìn)行研究，旨在探究miR-221在VMC患兒外周血中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒符合2000年由中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)心血管學(xué)組制定的VMC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]；年齡4～12歲；無精神疾病，可以配合研究進(jìn)行；研究對(duì)象與家屬均了解本研究?jī)?nèi)容，自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒無心肌病、先天性心臟病等其他心臟疾病；近期無感染史；近期無腹瀉史。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)收集2015年7月—2017年12月我院收治的VMC患兒67例，均符合2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)心血管學(xué)組制定的VMC臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，根據(jù)超聲心動(dòng)圖左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions，LVEF)及血清肌鈣蛋白I(cTnI)結(jié)果，將心肌炎患兒分為輕型VMC組(37例)與重型VMC組(30例)兩組，其中輕型VMC組LVEF>50%，cTnI<0.1 μg/L或正常；重型VMC組LVEF<50%，cTnI>0.2 μg/L或超出正常值。其中輕型VMC組男21例，女16例；年齡4～12(8.25±3.67)歲。重型VMC組患兒男19例，女11例，年齡4～11(8.61±4.11)歲。收集同期于我院體檢的健康兒童30名作為健康對(duì)照組，男17例，女13例，年齡4～12(8.47±3.20)歲。3組間臨床資料(性別、年齡)經(jīng)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法 所有患兒均需進(jìn)行對(duì)癥治療、營(yíng)養(yǎng)心肌、保護(hù)重要臟器、抗病毒等綜合治療方案，重型VMC組患兒需同時(shí)給予靜脈輸注大劑量丙種球蛋白(IVIG)，總量2 g/kg，分2～5 d進(jìn)行，以及連用3 d的甲基強(qiáng)松龍(MP)，劑量為15 mg/kg。

1.3 研究方法

1.3.1 血液樣本的采集 分別于患兒急性期和恢復(fù)期抽取靜脈血，而健康對(duì)照組則進(jìn)行一次性抽取靜脈血，收集靜脈血3 mL置于EDTA防凝管內(nèi)，于4 ℃采用離心機(jī)離心，3 000 r/min離心10 min，留取上清液(血清)分為3管，用于進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3.2 Real-time PCR檢測(cè)血清中miRNA-221表達(dá)水平 ①總RNA提?。喝?00 μL 血清樣本，采用RNA抽提試劑盒進(jìn)行血清總RNA的提取，試劑盒購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，完全按照試劑盒說明書操作，最后溶于RNase-Free的水中，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣本的總RNA的濃度和吸光度比值，當(dāng)A260/A280在1.8～2.0為符合實(shí)驗(yàn)要求的RNA。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將提取的2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，按照說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)體系20 μL：包括Random primer 0.5 μL Random primer 0.5 μL、oligo(dT)0.5 μL、10 mmol/L dNTP 2 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、5×buffer 4 μL M-MLV 0.5 μL、total RNA 1 μg，剩余用H2O(RNase free)補(bǔ)齊，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min合成雜合雙鏈，42 ℃ 30 min水解RNA鏈，85 ℃ 5 min合成DNA雙鏈。③Real-time PCR：采用ABI 7500定量PCR儀(購(gòu)自美國(guó)ABI公司)進(jìn)行Real-time PCR，試劑盒為購(gòu)自上海吉瑪公司的Hairpin-it miRNAs熒光定量PCR試劑盒，反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物 2 μL、miR-221正、反向引物(5 μmoL)各1 μL、Taq DNA聚合酶0.2 μL、dNTP(2.5 mmoL)1 μL、2×Real-time PCR緩沖液10 μL，用H2O(RNase free)補(bǔ)齊至20 μL。miR-221的上下游引物分別為5′-CCG CAG CTA CAT CTG GCT ACT G-3′ 和5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′[12]。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s變性，60 ℃ 1 min退火，共40個(gè)循環(huán)。經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)后，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-221的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 cTnI與肌酸激同工酶(CK-MB)的檢測(cè) ①cTnI的檢測(cè)：采用電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，儀器為Roche-2010分析儀，檢測(cè)儀器與試劑盒均購(gòu)自羅氏公司，檢測(cè)步驟完全按照說明書進(jìn)行，正常參考值為：0～0.09 μg/L。②CK-MB的檢測(cè)：采用ELISA法進(jìn)行檢測(cè)，儀器為AU5800全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)儀器購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，檢測(cè)完全按照說明書進(jìn)行，正常參考值為：0～24 U/L。

2 結(jié) 果

2.1 VMC患兒外周血miR-221、cTnI、CK-MB的表達(dá)變化 在VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的miR-221水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且重型VMC組患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的miR-221水平明顯高于輕型VMC組患兒(P<0.05)。在重型VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的cTnI水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對(duì)照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的cTnI水平與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在重型VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的CK-MB水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對(duì)照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期時(shí)外周血中的CK-MB水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，恢復(fù)期時(shí)外周血中的CK-MB水平與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 VMC患兒外周血miR-221、cTnI、CK-MB的表達(dá)變化(±s)

注：t1值、P1為重型VMC組與輕型VMC組的急性期相比；t1值、P2為重型VMC組與輕型VMC組的恢復(fù)期相比。與健康對(duì)照組相比，1)P<0.01

2.2 VMC患兒外周血miR-221表達(dá)量與cTnI、CK-MB含量的相關(guān)性 對(duì)VMC患兒外周血miR-221表達(dá)量與cTnI、CK-MB含量進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，VMC患兒外周血miR-221表達(dá)量與cTnI和CK-MB均具有顯著的負(fù)相關(guān)性，r2分別為-0.794、-0.871(P<0.05)，而健康對(duì)照組則無明顯相關(guān)性，r2分別為0.022，0.027。

3 討 論

VMC患兒通常都存在病毒感染病史，臨床表現(xiàn)往往是由于其心肌炎癥的部位及嚴(yán)重程度決定，其中絕大多數(shù)的輕型患兒無明顯臨床癥狀，而重型VMC則可表現(xiàn)為心力衰竭、擴(kuò)張型心肌病，甚至猝死等等[3]。小兒VMC是小兒時(shí)期常見的心臟感染性疾病，當(dāng)病毒感染小兒心肌后會(huì)對(duì)心肌造成直接性損傷，或通過激發(fā)自身免疫反應(yīng)而引起心肌細(xì)胞的間質(zhì)炎細(xì)胞纖維滲出和浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞壞死和變性等，也可引起心包、心內(nèi)膜和其他臟器的炎性病變[12]?；純旱呐R床表現(xiàn)具有多變性、易變性和多樣性等特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)輕重不一[1]。目前，雖然引起VMC的病原體已非常明確，但造成心肌損傷的具體機(jī)制仍不明確。

miRNA自1993年被發(fā)現(xiàn)以來，已逐漸被證實(shí)參與到各種病理生理過程中，成為研究的熱點(diǎn)[5]。近年來，有研究報(bào)道顯示miRNA也參與到了VMC的進(jìn)程中，并存在密切關(guān)系[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在CVB3誘導(dǎo)的VMC小鼠心肌組織中進(jìn)行miRNA微陣列技術(shù)檢測(cè)，篩選出miR-126-5p、miR-199a、miR-29a、miR-146a和miR-210等22個(gè)miRNAs的表達(dá)下調(diào)，而miR-320、miR-21、miR-23a等5個(gè)miRNAs的表達(dá)上調(diào)[13]。也有研究報(bào)道，miR-148a與miR-155在急性VMC病人的心臟室間隔組織中表達(dá)明顯增高，miR499與miR-208b的水平也出現(xiàn)了明顯升高，并且與心肌損傷存在正相關(guān)[14-15]。這些結(jié)果均提示，miRNA在VMC的進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用。miR-221作為一種癌基因在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，如甲狀腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等，它位于X染色體的p11.3區(qū)，與miR-222組成一個(gè)集群[8]。研究報(bào)道，miRNA-221/222在CVB3感染的VMC病人和C3H小鼠感染后7 d，于心臟組織中出現(xiàn)高表達(dá)，而抑制miRNA-221/222可增加循環(huán)中的白細(xì)胞數(shù)量、病毒負(fù)荷，使心肌壞死程度加重[16]。而也有研究報(bào)道，miR-221在心力衰竭心肌組織中呈高表達(dá)，并在心肌梗死組織中出現(xiàn)循環(huán)miR-221的高表達(dá)，提示循環(huán)miR-221是診斷早期心肌梗死的標(biāo)志物[9-10]。

為進(jìn)一步探究VMC患兒外周血中miR-221的表達(dá)意義，本研究對(duì)我院收治的67例VMC患兒進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的miR-221水平明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且重型VMC組患兒明顯高于輕型VMC組患兒(P<0.05)；在重型VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的cTnI水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對(duì)照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在重型VMC患兒急性期與恢復(fù)期時(shí)外周血中的CK-MB水平明顯高于輕型VMC組患兒和健康對(duì)照組(P<0.05)，而輕型VMC組患兒急性期時(shí)明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，恢復(fù)期時(shí)與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)VMC患兒外周血miR-221表達(dá)量與cTnI、CK-MB含量進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，VMC患兒外周血miR-221表達(dá)量與cTnI和CK-MB均具有顯著的負(fù)相關(guān)，r2分別為-0.794、-0.871(P<0.01)，而健康對(duì)照組則無明顯相關(guān)性，r2分別為0.022、0.027。

綜上所述，VMC患兒外周血中的miR-221表達(dá)水平增高，且與患兒的心肌損傷程度有關(guān)，提示其在VMC患兒的疾病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。