細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對癡呆小鼠認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制研究

老年性癡呆癥(senile dementia，SD)，由德國Alois Alzheimer博士在19世紀(jì)初第一次描述，故又稱阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease)。它是一種與高齡密切相關(guān)、以進(jìn)行性認(rèn)知功能下降為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病。其發(fā)病機(jī)制還不清楚，但國內(nèi)外均傾向于tau蛋白過度磷酸化與β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)級聯(lián)假說。SD病理改變?yōu)椋孩俅竽X皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元數(shù)量及其突觸聯(lián)系減少；②神經(jīng)元外老年斑(senile plaques，SP)；③神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)；后二者為SD特征性病變。目前尚無防治SD的特效藥[1-4]。遠(yuǎn)志始記于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被奉作養(yǎng)命上品中藥，具有安神益智、交通心腎的功效。遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志的主要活性成分之一，具有對抗氧化損傷、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用。而細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(tenuifolin，TEN)是遠(yuǎn)志皂苷堿的水解產(chǎn)物，其抗膽堿酯酶的活性較強(qiáng)；但有關(guān)TEN防治癡呆的文獻(xiàn)甚少[5-9]。本研究探討TEN改善癡呆小鼠認(rèn)知障礙的作用及機(jī)制，試圖為TEN開發(fā)抗癡呆藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 MT-200水迷宮行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。三氯化鋁(純度>98%)、D-半乳糖(純度>98%)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)和乙酰膽堿酯酶(AchE)測試試劑盒(南京建成生物工程研究所)。TEN(純度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)。安理申鹽酸多奈哌齊片(十堰市中醫(yī)醫(yī)院)。谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測試試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。β淀粉樣蛋白42(Aβ42)、可溶性淀粉樣前體蛋白α(sAPPα)酶聯(lián)免疫法試劑盒(均購自美國Elabscience公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明小鼠60只，雄性，10月齡，體質(zhì)重(40±5)g，SPF級，購于湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心[使用許可證號：SYXK(鄂)2016-0031]。小鼠給藥前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，光照12 h/d，室溫20～24 ℃，自由飲食，剔除逃避反應(yīng)明顯遲緩者。

1.3 復(fù)制SD小鼠模型 將三氯化鋁、D-半乳糖分別配成水溶液，前者按40 mg/(kg·d)讓小鼠飲用，后者按500 mg/(kg·d)頸背部皮下注射；持續(xù)時(shí)間均為3個月。SD模型判定標(biāo)準(zhǔn)：采用水迷宮測試，小鼠潛伏期>40 s，并隨機(jī)抽取其中的10%行腦切片檢查，觀察到大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元明顯減少、Aβ斑或神經(jīng)原纖維變性，則該批小鼠SD模型制作成功[10]。

1.4 分組、給藥及標(biāo)本制作 ①分組：取SD模型小鼠45只，隨機(jī)分為SD模型組、TEN干預(yù)組、安理申對照組，每組15只；另取健康小鼠15只作為正常對照組。②給藥：TEN干預(yù)組、安理申對照組分別給予TEN(15 mg/kg)、安理申(3 mg/kg)灌胃1次/日；SD模型組和正常對照組分別給予同體積的生理鹽水。先稱重、計(jì)算藥量，再灌胃給藥，療程為3個月。完成療程后，行水迷宮測試。③取腦：靠近枕骨剪下小鼠頭部，剔除顱骨表面軟組織，暴露顱骨；沿中線處剪開顱骨，并向兩側(cè)翻開；將腦組織與腦膜、腦神經(jīng)輕輕離斷，取出全腦；在冰盤上精心分離大腦皮質(zhì)和海馬，分別置入EP管，放入液氮保存待用。

1.5 觀察指標(biāo)與測試方法

1.5.1 行為學(xué)測試 ①定位航行實(shí)驗(yàn)：將小鼠頭朝向池壁從不同象限放入水中，觀察并記錄每只小鼠尋找平臺并爬上去所用的時(shí)間，即潛伏期(IP)；若小鼠超過60 s未找到平臺，IP以60 s計(jì)。每天訓(xùn)練3次，每次間隔30 min，連續(xù)訓(xùn)練5 d。②空間探索實(shí)驗(yàn)：除去平臺，讓小鼠自由地探索原平臺的位置，時(shí)間設(shè)置為30 s；記錄每只小鼠第1次穿越原平臺位置的時(shí)間(TFCOPP)及在原平臺象限活動的時(shí)間(TSOPQ)。

1.5.2 腦勻漿抗氧化指標(biāo)、AchE/ChAT活性及Aβ42/sAPPα含量檢測 從液氮中取出小鼠大腦皮質(zhì)和海馬組織，稱量，按質(zhì)量/體積比1∶9加入4 ℃生理鹽水，用組織勻漿器分別制成10%的皮質(zhì)勻漿液和海馬勻漿液，離心、取上清液，分裝于EP管并標(biāo)明名稱。按試劑盒說明，用比色法分別檢測海馬勻漿中AchE、ChAT活力；按試劑盒說明分別檢測腦勻漿中SOD、GSH-Px活性和MDA濃度；按試劑盒說明操作，于450 nm處檢測吸光度(A)值，分別計(jì)算出腦組織中Aβ42、sAPPα含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 與正常對照組比較，SD模型組IP、TFCOPP延長，而TSOPQ縮短；與SD模型組比較，安理申對照組、TEN干預(yù)組IP、TFCOPP縮短，而TSOPQ延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TEN干預(yù)組較安理申對照組IP、TFCOPP縮短、TSOPQ延長，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠行為學(xué)能力比較(±s) s

1)與正常對照組比較，P<0.01；2)與SD模型組比較，P<0.05；3)與安理申對照組比較，P<0.05

2.2 各組小鼠海馬組織中AchE、ChAT活性比較 與正常對照組比較，SD模型組AchE活性升高，而ChAT活性降低；與SD模型組比較，安理申對照組、TEN干預(yù)組AchE活性分別降低，而ChAT活性分別升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TEN干預(yù)組較安理申對照組AchE活性降低、ChAT活性升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

2.3 各組小鼠腦組織中抗氧化指標(biāo)比較 與正常對照組比較，SD模型組GSH-Px、SOD活性降低，而MDA濃度升高；與SD模型組比較，安理申對照組、TEN干預(yù)組GSH-Px、SOD活性升高，而MDA濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。TEN干預(yù)組較安理申對照組GSH-Px、SOD活性升高、MDA濃度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表2 各組小鼠海馬組織中AchE、ChAT活力比較(±s)

1)與正常對照組比較，P<0.01；2)與SD模型組比較，P<0.05；3)與安理申對照組比較，P<0.05

表3 各組小鼠腦組織中抗氧化指標(biāo)比較(±s)

1)與正常對照組比較，P<0.01；2)與SD模型組比較，P<0.05；3)與安理申對照組比較，P<0.05

2.4 各組小鼠腦組織Aβ42、sAPPα表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，SD模型組Aβ42濃度升高，而sAPPα濃度降低(P<0.05)；與SD模型組比較，TEN干預(yù)組Aβ42濃度降低，而sAPPα濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但安理申對照組上述兩指標(biāo)變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TEN干預(yù)組較安理申對照組Aβ42濃度降低、sAPPα濃度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組小鼠腦組織Aβ42、sAPPα表達(dá)水平比較(±s)

1)與正常對照組比較，P<0.05；2)與SD模型組比較，P<0.05；3)與安理申對照組比較，P<0.05

3 討 論

最新研究顯示，我國正快速進(jìn)入老齡化社會。而SD主要在老年群體發(fā)病，由此SD成為損害老年人身心健康的主要疾病之一。然而，關(guān)于SD防治藥物的研究進(jìn)展極其緩慢，其根本原因是沒有弄清SD的病因和發(fā)病機(jī)制，因此不能建立與人類SD發(fā)病相符合的動物模型。但可以肯定的是，人類SD的發(fā)病是一個長時(shí)間發(fā)生發(fā)展的過程，抗SD藥物的研究必須模擬人類SD發(fā)病過程進(jìn)行一系列研究。基于這種認(rèn)識，本團(tuán)隊(duì)一直致力于SD慢性模型的創(chuàng)建。如本研究選擇三氯化鋁、D-半乳糖對小鼠產(chǎn)生復(fù)合、慢性作用，較好地模擬了SD病人的發(fā)病環(huán)境、認(rèn)知變化、行為特征及主要病變，建立了更貼近人類SD的復(fù)合模型[4，10]。

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科草本植物遠(yuǎn)志或卵葉遠(yuǎn)志的干燥根，臨床常用其治療心腎不交引起的神志恍惚、健忘驚悸、失眠多夢等癥，TEN是其主要提取物，具有多種生物活性。在水迷宮測試中，小鼠找到平臺的時(shí)間即IP越短，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)，TFCOPP越短或TSOPQ越長小鼠記憶能力越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，TEN干預(yù)組較SD模型組IP、TFCOPP明顯縮短，而TSOPQ明顯延長，與吳桓宇等[9，11-13]的研究結(jié)果一致。提示TEN具有改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用。

膽堿能神經(jīng)元分布在海馬、基底前腦等多個腦區(qū)，通過其廣泛的軸突纖維投射釋放乙酰膽堿(ACh)，調(diào)控或參與學(xué)習(xí)、記憶等多種生理活動，其功能異常與認(rèn)知障礙、癡呆發(fā)生等密切相關(guān)。ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，在神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，隨軸質(zhì)流動至軸突末梢，可將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到膽堿上形成ACh。而AchE在膽堿能突觸內(nèi)可降解ACh，終止ACh對突觸后膜的興奮作用，維持正常的神經(jīng)信號傳遞。本研究結(jié)果顯示，SD模型組AchE活性升高，而ChAT活性降低；而TEN干預(yù)組則相反，AchE活性降低，ChAT活性升高。這說明TEN干預(yù)可抑制AchE活性，增強(qiáng)ChAT活性，提高突觸內(nèi)ACh濃度，從而提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[9，11-14]。

在機(jī)體正常代謝過程中，氧自由基的產(chǎn)生與抗氧化酶對其的清除二者處于動態(tài)平衡。GSH-Px、SOD是機(jī)體主要抗氧化酶，而MDA表達(dá)水平是過氧化狀態(tài)的直接反映。從本研究結(jié)果可以看出，SD模型組小鼠腦組織中GSH-Px、SOD活力降低，MDA濃度升高；而TEN干預(yù)組小鼠腦組織中GSH-Px、SOD活力增強(qiáng)、MDA濃度降低；支持周陽等[2-4]的研究結(jié)果。這表明TEN可清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，降低MDA濃度，同時(shí)減少腦神經(jīng)元的凋亡，具有明顯的抗氧化作用。

Aβ是β淀粉樣前體蛋白(APP)的水解產(chǎn)物。APP經(jīng)過α、β、γ3種分泌酶、2條裂解途徑分解代謝。其一為非Aβ源途徑，在α分泌酶作用下，APP產(chǎn)生可溶性sAPPα和C83片段，后者進(jìn)一步被γ分泌酶水解生成P3片段和羧基末端；可溶性sAPPα對神經(jīng)元具有營養(yǎng)、保護(hù)作用。其二為Aβ源途徑，在β分泌酶作用下，APP產(chǎn)生sAPPβ和C99片段，后者進(jìn)一步被γ分泌酶水解生成Aβ40和Aβ42兩種異構(gòu)體；Aβ40溶解性較高，而Aβ42溶解性極低，迅速積聚在神經(jīng)元周圍，形成纖維狀物質(zhì)即SP；SP可引發(fā)一系列的神經(jīng)毒性反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、功能失調(diào)及腦認(rèn)知障礙等病理現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，TEN干預(yù)組sAPPα表達(dá)水平升高而Aβ42表達(dá)水平降低，與Aβ級聯(lián)假說相吻合[10，15-17]。

本研究以安理申作為陽性對照，安理申通過抑制AchE來提高癡呆小鼠認(rèn)知功能。但本研究使用的是氧化損傷SD模型，癡呆小鼠大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)元數(shù)量丟失、結(jié)構(gòu)損傷明顯；因此，安理申的作用有限，明顯低于TEN干預(yù)效果，另對腦組織中Aβ42、sAPPα表達(dá)水平無明顯影響。

TEN對癡呆小鼠認(rèn)知功能有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與TEN提高海馬膽堿能系統(tǒng)功能、對抗自由基氧化損傷、減少腦組織Aβ42表達(dá)及上調(diào)sAPPα濃度有關(guān)。