活血解毒降糖方對(duì)糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究

糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是慢性炎癥相關(guān)的代謝性疾病，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是代謝異常與炎癥反應(yīng)之間的橋梁，2004年Ozcan 等[1]在Science發(fā)表文章指出，ERS是多種應(yīng)激源的共同通路，是糖尿病胰島素抵抗及其并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，因此，ERS可望成為治療糖尿病的一個(gè)新靶點(diǎn)。盡管糖尿病AS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但高糖、高脂、氧化應(yīng)激狀態(tài)、炎癥反應(yīng)等糖尿病的病理狀態(tài)均與ERS有關(guān)，連接代謝異常和糖尿病發(fā)生發(fā)展的過程，可引起巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡，參與糖尿病AS的發(fā)生與發(fā)展[2]。糖尿病和冠心病分別屬于中醫(yī)學(xué)消渴和胸痹范疇，消渴并胸痹在病機(jī)上存在氣陰兩虛、燥熱內(nèi)蘊(yùn)，遷延日久，煉液成痰，陰損及陽，血凝為瘀，痰瘀內(nèi)蘊(yùn)久而成毒，因此氣陰兩虛、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)是消渴并胸痹的主要病機(jī)[3]。本課題的前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，具有滋陰益氣、活血解毒作用的活血解毒降糖方(Huoxue Jiedu Jiangtang Formulation，HJJF)，能明顯降低促炎因子，調(diào)節(jié)抗炎/促炎平衡，能有效抑制糖尿病急性冠脈綜合征(冠心病危重形式)非血運(yùn)重建病人炎癥反應(yīng)，改善病人臨床療效[4]。本研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)機(jī)制，進(jìn)一步探討HJJF干預(yù)糖尿病AS發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 建立模型 體重220～250 g雄性SD大鼠120只，在室溫 22～25 ℃，相對(duì)濕度40%～50%的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，每籠4只。大鼠由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(桂)2014-002。適應(yīng)性普通飼料(江蘇省協(xié)同生物工程有限公司)喂養(yǎng)7 d后，空腹10 h后， 腹腔內(nèi)單次注射鏈脲佐菌素(北京華越洋生物科技有限公司)50 mg/kg，72 h后尾靜脈采血，采用血糖試紙(武漢博士德生物工程有限公司)檢測(cè)空腹血糖(FBG)，以連續(xù)2次FBG≥16.7 mmol/L 的大鼠作為糖尿病模型，隨后進(jìn)行高脂飼料(普通飼料78.2%，豬油10%，膽固醇1.5%，蛋黃粉10%，豬膽鹽0.3%。江蘇省協(xié)同生物工程有限公司供給)喂養(yǎng)3個(gè)月，每天記錄進(jìn)食量及飲水量。另設(shè)正常組(25只)，予腹腔內(nèi)注射等量生理鹽水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 大鼠分組與給藥 大鼠最后造模成功102只，隨機(jī)進(jìn)行分組，模型組25只，格列喹酮+貝那普利組(西藥組)26只，HJJF低劑量組26只，HJJF高劑量組25只，并開始給藥?；钛舛窘堤欠浇M方：人參、黃芪、麥冬、山茱萸、地黃、大黃、鱉甲、桃仁、丹皮、黃連、丹參、山藥、五味子。購自右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，制成浸膏，1 g相當(dāng)于原生藥10 g。低劑量組按1.0 g/(kg·d)、高劑量組按1.5 g/(kg·d)灌服活血解毒降糖方混懸液；西藥組用格列喹酮(北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)7.50 mg/kg和貝那普利(北京諾華制藥有限公司)2.50 mg/kg，配成等體積溶液灌胃，共給藥8周，并繼續(xù)高脂飲料喂養(yǎng)；模型組僅給高脂喂養(yǎng)，正常組一直普通飼料喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)操作均在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

1.3 取材 動(dòng)物給藥60 d后，禁食12 h，可飲水，再次對(duì)各組大鼠FBG檢測(cè)后，用8%戊巴比妥鈉，按2 mL/kg劑量腹腔注射麻醉，腹正中開腹，下腔靜脈采血7～10 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，用以指標(biāo)檢測(cè)；剝離主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗，取胸主動(dòng)脈，-80 ℃冷藏，用于RT-PCR 實(shí)驗(yàn)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 血脂、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化儀測(cè)定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG )、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定IL-6、TNF-α、GSH-Px水平，試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。具體實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.2 Rea1-time PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈GRP78、JNKmRNA的轉(zhuǎn)錄水平 從-80 ℃冰箱取出主動(dòng)脈，放入研缽中進(jìn)行研磨，提取總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)其完整性；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，先42 ℃ 50min再95℃ 5min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將獲得的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因(按照Rea1-time PCR試劑盒說明書操作)，內(nèi)參基因和目的基因引物由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)合成，內(nèi)參GAPDH上游引物為5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，下游引物為5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度114 bp；GRP78上游引物為5′-CTTGGTATTGAAACTGTGGG-3′，下游引物為5′-TGTTACGGTGGGCTGATTAT-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度117 bp；JNK上游5′-GGATTTGGAGGAGCGAACTAA-3′，下游5′-ACTGCTGTCTGTATCCGAGGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為163 bp。PCR循環(huán)參數(shù)為96 ℃4 min，然后94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s三步反應(yīng)，40個(gè)循環(huán)。記錄達(dá)到所設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即CT值，利用溶解曲線檢測(cè)引物的特異性，表達(dá)量的計(jì)算方法采用2-△△Ct法，△Ct=Ct目的基因-CtGAPDH，△△Ct= 實(shí)驗(yàn)組(Ct目的基因-CtGAPDH)-對(duì)照組(Ct目的基因-CtGAPDH)，2-△△Ct=2-△Ct實(shí)驗(yàn)組/2-△Ct對(duì)照組，具體計(jì)算時(shí)以對(duì)照組表達(dá)量為1，則比值即為實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 TUNEL法檢測(cè)主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡 用TUNEL法檢測(cè)主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡，試劑盒購自北京華越洋生物科技有限公司，把石蠟包埋的主動(dòng)脈切成4 μm的薄片，行脫蠟，漂洗，加蛋白酶，室溫15 min，加3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫1 min，加TUNEL液，37 ℃反應(yīng)1 h，加過氧化物酶，加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫10 min，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，最后樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈棕黃色，每張陽性切片選取5個(gè)陽性細(xì)胞最多的視野，計(jì)算陽性細(xì)胞所占的百分比，即細(xì)胞凋亡指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)過程中變化情況 大鼠造模成功后，飲水量多，尿量多，體重有所減輕，毛色枯黃，行動(dòng)遲緩，反應(yīng)遲鈍，但灌藥實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠死亡。

2.2 活血解毒降糖方對(duì)大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性的影響 與模型組相比，各給藥組FBG明顯降低(P<0.05)，抗氧化酶SOD、GSH-Px升高(P<0.05)，炎癥因子TNF-α、IL-6降低(P<0.05)；HJJF高低量組較西藥組療效好，并隨HJJF劑量增加效果更顯著(P<0.05)，但HJJF高低量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 活血解毒降糖方對(duì)大鼠FBG、SOD、GSH-Px、TNF-α和IL-6活性影響的比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.3 活血解毒降糖方對(duì)大鼠血脂的影響 與正常組相比，模型組大鼠TC、TG、LDL-C含量均顯著升高(P<0.01)，HDL-C明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，給藥后各組大鼠的TC、TG、LDL-C含量均降低，HDL-C含量均升高(P<0.05)，HJJF組療效隨劑量增加更顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HJJF高、低劑量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 活血解毒降糖方對(duì)大鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C的影響(±s) mmol/L

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

2.4 活血解毒降糖方對(duì)大鼠主動(dòng)脈GRP78、JNK mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響 與正常組相比，模型組大鼠的GRP78、JNK mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.01)；給藥后，與模型組相比，各給藥組的GRP78、JNK mRNA轉(zhuǎn)錄均降低(P<0.05)；與西藥組比較，HJJF組降低效果更顯著(P<0.05)；HJJF隨劑量增加療效更好，但HJJF高低劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖1。

表3 各組大鼠主動(dòng)脈GRP78、JNK mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平比較(2-△△Ct，±s)

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

圖1 主動(dòng)脈GRP78、JNK mRNA的擴(kuò)增曲線和溶解曲線

2.5 活血解毒降糖方對(duì)主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡的影響 正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，TUNEL陽性染色定位于細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色，體積等于或小于正常細(xì)胞核。原位主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組可見大量的細(xì)胞凋亡(P<0.01)；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)；與西藥組相比，HJJF高劑量組凋亡指數(shù)降低明顯(P<0.05)；HJJF隨增加劑量效果更明顯，但HJJF高低劑量組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 各組主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡切片圖(×200)

表4 各組大鼠主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較(±s)

與正常組比較，1)P<0.01；與模型組比較，2)P<0.05；與西藥組比較，3)P<0.05

3 討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)和類固醇合成的細(xì)胞器，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤及脂質(zhì)合成紊亂而堆積時(shí)，將引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的應(yīng)激反應(yīng)，稱為ERS[5]。糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose-regulated protein 78，GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的感受分子，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處于穩(wěn)態(tài)時(shí)分別與暴露于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中活化轉(zhuǎn)錄因子-6(ATF6)、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)和肌醇需求酶1(IRE-l)的結(jié)構(gòu)域結(jié)合；在持續(xù)而嚴(yán)重的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，由于GRP78與未折疊的蛋白質(zhì)具有更高的親和力，GRP78將與PERK、ATF6、IRE-1解離，解離后的PERK、ATF6和IRE則激活下游的CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(Caspase12)、c-JUN氨酸末端激酶(JNK)3個(gè)凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6]。在JNK途徑中，IRE-1被激活后，通過其胞漿內(nèi)結(jié)合域與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子 2(tumor necrosis fector receptor associated factor 2，TRAF2)相結(jié)合，形成IRE-1-TRAF2復(fù)合物，轉(zhuǎn)而激活下游的凋亡信號(hào)調(diào)控激酶-1( apoptosis signal regulating kinase 1，ASK1)，并與ASK1共同形成IRE-1-TRAF2-ASK1復(fù)合物，使JNK磷酸化而被激活，活化的JNK則抑制Bcl-2的抗凋亡活性，增強(qiáng)BIM的促凋亡功能，還參與Caspase-12的調(diào)節(jié)，磷酸化修飾CHOP，通過調(diào)節(jié)CHOP活性，增加彼此的促凋亡效果[6-7]?；罨腏NK，還可活化轉(zhuǎn)錄活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)，增加促炎因子基因的表達(dá)，IRE1α-TRAF2復(fù)合物還可使IκB磷酸化并降解，釋放核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)入核，激活炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄[8-9]，導(dǎo)致促炎因子(TNF-α、IL-6等)的增加，增進(jìn)粥樣斑塊的易損性[10]。對(duì)經(jīng)皮腔內(nèi)斑塊旋切術(shù)所取得的樣本中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶的大量表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)在不穩(wěn)定斑塊內(nèi)ERS凋亡途徑被激活[11]。糖尿病導(dǎo)致體內(nèi)糖代謝正常途徑受損，多元醇途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)途徑和己糖胺途徑等4條旁路代謝通路過度激活，增強(qiáng)了還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶的活性，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)[12]。ROS的蓄積影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，使得蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)折疊受阻致使未折疊蛋白蓄積誘發(fā)ERS[8]。另外，由于胰島素抵抗的作用使脂蛋白脂酶的作用受損，極低密度脂蛋白(VLDL)的清除率下降，高胰島素血癥又促進(jìn)肝臟合成VLDL，呈現(xiàn)TG和LDL-C增高，而HDL-C降低，脂質(zhì)代謝紊亂。增強(qiáng)的氧化應(yīng)激，使LDL-C氧化為氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，不能被LDL-C受體識(shí)別進(jìn)行正常的降解，且與巨噬細(xì)胞清道夫受體有高度的親和力，這一過程無負(fù)反饋機(jī)制，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞中膽固醇酯大量聚積[13]，引發(fā)ERS，ERS又可加劇炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激偶聯(lián)炎癥反應(yīng)在糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗可以使巨噬細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的凋亡更加敏感，引起炎癥反應(yīng)、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡等，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[14-15]。抗氧化酶系統(tǒng)是機(jī)體抗氧化損傷的重要屏障，該系統(tǒng)主要包括GSH-Px、SOD等。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，它能催化還原型谷胱甘肽(GSH)變?yōu)檠趸凸入赘孰?GSSG)，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，為生物體中清除過氧化氫和其他有機(jī)過氧化物的脫毒酶。SOD是體內(nèi)超氧陰離子的天然抗氧化酶，在對(duì)抗氧化損傷方面具有重要作用，GSH-Px和SOD二者的協(xié)同作用，均對(duì)抗糖尿病生成過多的ROS。

根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，氣陰兩虛、燥熱內(nèi)蘊(yùn)是糖尿病AS的基本病機(jī)，氣虛致瘀，陰虛加劇內(nèi)熱，熱瘀內(nèi)蘊(yùn)可化毒，痰瘀互結(jié)日久可成“積”(動(dòng)脈粥樣硬化斑塊)[16]。同時(shí)，因?yàn)檠装Y反應(yīng)是AS發(fā)生、發(fā)展及造成斑塊不穩(wěn)定引發(fā)急性心血管事件的主要原因，炎性反應(yīng)引起炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性介質(zhì)的釋放，與熱毒的本性特點(diǎn)相似，提示清熱解毒藥物可通過抗炎起到潛在的穩(wěn)定斑塊作用。因此，“益氣養(yǎng)陰，活血解毒，軟堅(jiān)消積”是糖尿病AS的重要治法。活血解毒降糖方由人參、黃芪、麥冬、山茱萸、地黃、大黃、黃連、丹參、山藥、五味子、鱉甲、桃仁、丹皮所組成，其中人參、麥冬、五味子是金元醫(yī)家李杲名著《內(nèi)外傷辨惑論》的滋陰益氣名方生脈散成分；地黃、山茱萸、山藥是明朝醫(yī)家張景岳治療真陰不足的左歸丸成分；大黃、鱉甲、桃仁、丹皮是東漢張仲景《金匱要略》解毒軟堅(jiān)消積鱉甲煎丸的主要成分。再加丹參活血散瘀，黃連清熱燥濕解毒，黃芪益氣扶正解毒。從益氣、滋陰、活血化瘀、清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)中藥相配伍的方案尋求治療思路，這是治療糖尿病AS的創(chuàng)新。臨床研究發(fā)現(xiàn)，活血解毒降糖方能抑制胰島素抵抗，調(diào)節(jié)抗炎/促炎平衡，抑制糖尿病AS病人腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)，能有效抑制糖尿病AS血運(yùn)重建及非血運(yùn)重建病人炎癥反應(yīng)，發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)作用，提高臨床療效，改善心功能[4，17]。

本研究表明，糖尿病造模成功后GSH-Px受到一定程度的激活，代償增高，但仍不足以抵抗高糖引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。給予藥物干預(yù)后，均能明顯降低FBG，升高SOD、GSH-Px；均可糾正脂質(zhì)代謝紊亂(TC、TG、LDL-C含量降低，HDL-C含量升高)；均可降低促炎因子(TNF-α、IL-6)水平，下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡信號(hào)分子GRP78、JNK mRNA的轉(zhuǎn)錄水平和減少主動(dòng)脈細(xì)胞凋亡。且HJJF組治療效果較西藥組療效好，并隨增加HJJF劑量效果更顯著。

活血解毒降糖方的治療作用在于，糾正機(jī)體胰島素抵抗，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，提高抗氧化應(yīng)激能力，減輕炎癥反應(yīng)，抑制“氧化應(yīng)激-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-炎癥反應(yīng)-細(xì)胞凋亡”的偶聯(lián)反應(yīng)，減輕動(dòng)脈硬化斑塊炎癥反應(yīng)，從而減輕糖尿病合并動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，體現(xiàn)了中醫(yī)藥整體干預(yù)、動(dòng)態(tài)調(diào)整、多靶點(diǎn)治療的防治特色。