姜黃素通過NF- κB/miR33a通路對(duì)ox- LDL刺激THP- 1巨噬細(xì)胞分泌的影響及機(jī)制

鐘 毅，謝發(fā)江，馮 健，查克嵐，鄭舒展，李家富，范忠才

1西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，瀘州646000；2達(dá)州市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，達(dá)州 635000

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是血管系統(tǒng)的一種炎癥性疾病，在動(dòng)脈壁內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集有助于炎癥性AS斑塊的進(jìn)展[1]。巨噬細(xì)胞膜表面的凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體- 1(lectin- like oxidized low- density lipoprotein receptor- 1，LOX- 1)與ox- LDL結(jié)合并活化促發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)及促炎因子，包括IL- 6、TNF- α、MCP- 1等，這一系列過程形成惡性循環(huán)，加速AS的進(jìn)展，以阻斷炎癥反應(yīng)為靶點(diǎn)的治療顯示了良好抗AS效果[2]。

姜黃素是一種具有抗心律失常、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、抗纖維化、抗病毒、抗腫瘤等多種藥效的多酚類化合物，被廣泛用于體內(nèi)外研究[3- 7]。研究顯示姜黃素通過調(diào)控靶向激活蛋白- 1(activator protein 1，AP- 1)和 NF- κB抑制單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)[8，9]。在活化的巨噬細(xì)胞中姜黃素能夠下調(diào)一氧化氮(nitric oxide，NO),環(huán)氧合酶- 2(cyclooxygenase- 2，COX- 2)以及多種白介素家族分子(IL- 1,IL- 2,IL- 5,IL- 8,IL- 12,IL- 18)等[10- 14]。姜黃素能夠阻斷炎癥誘導(dǎo)下人肺泡巨噬細(xì)胞TNF- α、IL- 6、IL- 8、MCP- 1等多種炎癥因子表達(dá)[9]。盡管越來越多的證據(jù)顯示姜黃素可能通過阻斷IκBα激酶而減少NF- κB轉(zhuǎn)錄進(jìn)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[3，4，6，9]，但是姜黃素并非NF- κB特異性阻滯劑，其抗炎效應(yīng)主要通過影響多條途徑實(shí)現(xiàn)，目前尚未完全清楚。本研究以THP- 1巨噬細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,于細(xì)胞水平探討姜黃素影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、藥品與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

THP- 1細(xì)胞來源于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

姜黃素、PDTC、佛波酯(Phorbol- 12- myristate- 13- acetate，PMA)購自美國Sigma 公司；RPMI- 1640 培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司；人ox- LDL購自廣州奕源生物科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK- 8購自日本DOJINDO 公司；BCA蛋白濃度測(cè)試試劑盒購自武漢阿斯本公司；抗GAPDH抗體購自英國 Abcam 公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)計(jì)量PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TOYOBO公司；兔源抗NF- κB p65、IκBα、p- IκBα抗體購自美國CST公司；miR33a inhibitor和control sequence購自上海吉瑪公司；IL- 6、TNF- α ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Cytomat 10 C細(xì)胞培養(yǎng)箱、TSE400D 超低溫冰箱、Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀、Multifuge X3臺(tái)式超速離心機(jī)、Micro CL 冷凍離心機(jī)、9700PCR儀均為美國 Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；HH- 4 型恒溫水浴鍋、江南儀器廠均為蘇州凈化公司產(chǎn)品；倒置生物顯微鏡、TS100- F 倒置顯微鏡均為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；DYCP- 36 型電泳儀為北京六一儀器廠公司產(chǎn)品；微量移液器為法國Gilson公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 THP- 1細(xì)胞的培養(yǎng)及THP- 1巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

以10%FBS、1%青、鏈霉素的RPIM- 1640培養(yǎng)液，37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以濃度為160 nmol/L PMA的完全培養(yǎng)基孵育48 h，誘導(dǎo)其分化為THP- 1巨噬細(xì)胞。

1.2.2 姜黃素的配制及毒性檢測(cè)

取適量姜黃素粉末融于DMSO溶劑中，配制成濃度為50 mmol/L保存液，- 20 ℃條件下保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋配制成所需濃度，并且保證DMSO最終在培養(yǎng)基中濃度不超過0.1%。

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL的懸液，按每孔10 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，置于上述培養(yǎng)箱中48 h以貼壁。加入含不同終濃度的姜黃素(0、5、10、20、40、80 μmol/L)RPIM- 1640培養(yǎng)液處理24 h，每孔加入10 μL CCK- 8溶液培養(yǎng)4 h，按照CCK- 8試劑盒說明書步驟，檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選出下一步實(shí)驗(yàn)所需姜黃素合適的濃度以排除其毒性作用而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差。

1.2.3 姜黃素對(duì)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞miR33a 的表達(dá)及IL- 6、TNF- α的分泌影響

將前述含PMA細(xì)胞培養(yǎng)基更換為終濃度50 μg/mL的ox- LDL無血清RPMI- 1640培養(yǎng)液，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)48 h后，再進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)。

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、ox- LDL組、ox- LDL+姜黃素組，加入相應(yīng)處理后繼續(xù)在上述條件中培養(yǎng)48 h[15]。其中姜黃素濃度以1.2.2檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及檢測(cè)

將提前設(shè)計(jì)的miR33a inhibitor以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將其轉(zhuǎn)染入THP- 1巨噬細(xì)胞，阻斷miR33a的表達(dá)，另外使用control sequence與之對(duì)照，排除非序列特異性對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、ox- LDL組；ox- LDL+miR33a inhibitor組、ox- LDL+control sequence組；按照LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

1.2.5 姜黃素介導(dǎo)miR33a的表達(dá)影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、ox- LDL組、ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+control sequence組、ox- LDL+control sequence+姜黃素組、ox- LDL+miR33a inhibitor組、ox- LDL+miR33a inhibitor+姜黃素組。

1.2.6 姜黃素對(duì)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞NF- κB/miR33a信號(hào)通路的影響

采用50 μm·mL- 1NF- κB信號(hào)通路阻斷劑PDTC預(yù)處理細(xì)胞，阻斷NF- κB的活化。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、ox- LDL組、ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+姜黃素組+PDTC組。

1.2.7 姜黃素介導(dǎo)NF- κB/miR33a信號(hào)通路影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌

實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、ox- LDL組、ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+miR33a inhibitor組、ox- LDL+PDTC組、ox- LDL+miR33a inhibitor+姜黃素組、ox- LDL+姜黃素組+PDTC組、ox- LDL+control sequence組。

1.2.8 RT- qPCR檢測(cè)miR33a的表達(dá)

按照Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作獲取cDNA；使用 RT- qPCR 試劑盒測(cè)定mRNA 量。miR- 33a- 5p引物序列：上游5`- GGTGCATTGTAGTTGCATTGC- 3′，下游5′- GCGAC GAGCAAAAAGCTTGT- 3′。內(nèi)參照 U6引物序列上游5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′，下游5′- AACGCTTCAC- GAATTTGCGT- 3′。反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 1 min，變性 95 ℃ 15 s，退火 58 ℃ 20 s，延展 72 ℃ 20 s，共 40 個(gè)循環(huán)。用 ΔΔCt 來計(jì)算基因的表達(dá)水平，具體公式如下：ΔCt= 目的基因 Ct 值-GAPDH 基因 Ct 值；ΔΔCt= 實(shí)驗(yàn)組 ΔCt-對(duì)照組 ΔCt；實(shí)驗(yàn)組基因相對(duì)表達(dá)量 =2- ΔΔCt。Stem- loop技術(shù)提前處理樣本miRNA，此后再按照傳統(tǒng)RT- qPCR檢測(cè)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)NF- κB p65、IκBα、p- IκBα 的表達(dá)

收集細(xì)胞，加入 RIPA 裂解液提取總蛋白，按BCA蛋白濃度定量試劑盒說明測(cè)定樣品蛋白濃度。SDS- PAGE 凝膠電泳分離蛋白，每孔上樣量 40 μg，按濃縮膠 80 V、分離膠 120 V 進(jìn)行恒壓電泳，切去相應(yīng)膠帶，300 mA恒流轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜；置于 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，除去封閉液后加入抗NF- κB p65(1∶2 000)、IκBα(1∶1 000)、p- IκBα (1∶1 000)、GAPDH(1∶10 000)一抗4 ℃過夜，TBST 洗膜10 min(3次；加入 HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(1∶10 000)室溫孵育1.5 h，TBST洗膜 10 min(3次，化學(xué)發(fā)光法定影顯色，用 Image Lab 軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.10 ELISA測(cè)定IL- 6、TNF- α的濃度

收集細(xì)胞懸液，以2 000 rpm離心20 min，收集的上清液- 20 ℃保存?zhèn)溆谩０碋LISA試劑盒說明檢測(cè)IL- 6、TNF- α的濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素毒性檢測(cè)

與空白對(duì)照組相比，姜黃素的濃度在5- 40 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活性影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)，而當(dāng)姜黃素濃度達(dá)80 μmol/L時(shí)，THP- 1巨噬細(xì)胞活性下降(P<0.05)(見圖1)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們選擇以姜黃素濃度20 μmol/L作為下一步姜黃素干預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。

圖1 姜黃素對(duì)細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of curcumin on cell 注：與對(duì)照組比較，aP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group.

2.2 姜黃素對(duì)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞miR33a的表達(dá)及IL- 6、TNF- α的分泌影響

與空白對(duì)照組相比，ox- LDL組miR33a的表達(dá)及IL- 6、TNF- α的濃度增加(P<0.05)；與ox- LDL組相比，ox- LDL+姜黃素組miR33a的表達(dá)及IL- 6、TNF- α的濃度減少(P<0.05)(見圖2)。

2.3 姜黃素通過介導(dǎo)miR33a的表達(dá)影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌

2.3.1 miR33a inhibitor和control sequence的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染檢測(cè)

與空白對(duì)照組相比，ox- LDL組miR33a的表達(dá)增加(P<0.05)；與ox- LDL組相比，ox- LDL+miR33a inhibitor組miR33a的表達(dá)下降(P<0.05)，而ox- LDL+control sequence組miR33a的表達(dá)與ox- LDL組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；與ox- LDL+miR33a inhibitor組相比，ox- LDL+control sequence組miR33a的表達(dá)增加(P<0.05)(見圖3)。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式，miR33a inhibitor能夠有效抑制ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞miR33a的表達(dá)，為下一步探索姜黃素介導(dǎo)miR33a的表達(dá)影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖2 姜黃素對(duì)miR33a的表達(dá)及IL- 6、TNF- α分泌的影響Fig.2 Effect of curcumin on expression of miR33a and secretion of IL- 6,TNF- 注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與ox- LDL組相比，bP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group；bP<0.05 vs ox- LDL group.

圖3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染檢測(cè)Fig.3 detection of Liposome 注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與ox- LDL組相比，bP<0.05；與ox- LDL+miR33a inhibitor組相比，cP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group；bP<0.05 vs ox- LDL group；cP<0.05 vs ox- LDL+miR33a inhibitor group.

2.3.2 姜黃素通過介導(dǎo)miR33a的表達(dá)下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌

與空白對(duì)照組相比，ox- LDL組IL- 6、TNF- α的濃度增加(P<0.05)；與ox- LDL組相比，ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+miR33a inhibitor組、ox- LDL+姜黃素+miR33a inhibitor、ox- LDL+control sequence+姜黃素組IL- 6、TNF- α的濃度減少(P<0.05)，而ox- LDL+control sequence組IL- 6、TNF- α的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；與ox- LDL+姜黃素組相比，ox- LDL+姜黃素+miR33a inhibitor組IL- 6、TNF- α的濃度進(jìn)一步減少(P<0.05)，而ox- LDL+姜黃素+control sequence組IL- 6、TNF- α的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)(見圖4)。提示姜黃素通過介導(dǎo)miR33a的表達(dá)下調(diào)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌，為進(jìn)一步探索其上游信號(hào)分子奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖4 姜黃素通過介導(dǎo)miR33a的表達(dá)降低IL- 6、TNF- α的分泌Fig.4 Curcumin reduces the secretion of IL- 6 and TNF- 1 by mediating the expression of 注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與ox- LDL組相比，bP<0.05；與ox- LDL+姜黃素組相比，cP<0.05；與ox- LDL+control sequence組相比，dP<0.05；與ox- LDL+control sequence+ 姜黃素組相比，eP<0.05；與ox- LDL+miR33a inhibitor組相比，fP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group；bP<0.05 vs ox- LDL group；cP<0.05 vs ox- LDL+ curcumin group；dP<0.05 vs ox- LDL+control sequence group ；eP<0.05 vs ox- LDL+control sequence+ curcumin group；fP<0.05 vs ox- LDL+miR33a inhibitor group

2.4 姜黃素介導(dǎo)NF- κB/miR33a信號(hào)通路影響ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌

2.4.1 姜黃素抑制NF- κB/miR33a信號(hào)通路

與空白對(duì)照組相比，ox- LDL組miR33a、NF- κB p65、p- IκBα的表達(dá)及p- IκBα/IκBα的比值增加(P<0.05)，IκBα的表達(dá)減少(P<0.05)；與ox- LDL組相比，ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+PDTC組miR33a、NF- κB p65、p- IκBα的表達(dá)及p- IκBα/IκBα的比值減少(P<0.05)，IκBα的表達(dá)增加(P<0.05)(見圖5)。

圖5 姜黃素對(duì)NF- κB/miR33a信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of curcumin on NF- κ B/miR33a signaling 注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與ox- LDL組相比，bP<0.05；與ox- LDL+姜黃素組相比，cP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group；bP<0.05 vs ox- LDL group；cP<0.05 vs ox- LDL+curcumin group.

2.4.2 姜黃素通過調(diào)控NF- κB/miR33a信號(hào)通路下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌

與空白對(duì)照組相比，ox- LDL組IL- 6、TNF- α的濃度增加(P<0.05)；與ox- LDL組相比，ox- LDL+姜黃素組、ox- LDL+miR33a inhibitor組、ox- LDL+PDTC組IL- 6、TNF- α的濃度減少(P<0.05)，而ox- LDL+control sequence組IL- 6、TNF- α的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；與ox- LDL+姜黃素組相比或ox- LDL+PDTC組相比，ox- LDL+姜黃素+ PDTC組IL- 6、TNF- α的濃度進(jìn)一步減少(P<0.05)；與ox- LDL+姜黃素組或ox- LDL+miR33a inhibitor組相比，ox- LDL+姜黃素+miR33a inhibitor組IL- 6、TNF- α的濃度進(jìn)一步減少(P<0.05)(見圖6)。

圖6 姜黃素通過抑制NF- κB/miR33a信號(hào)通路下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌Fig.6 Curcumin reduces the secretion of IL- 6,TNF- 1 by inhibiting NF- κB/miR33a signaling 注：與對(duì)照組相比，aP<0.05；與ox- LDL組相比，bP<0.05；與ox- LDL+姜黃素組相比，cP<0.05；與ox- LDL+miR33a inhibitor組相比，dP<0.05；與ox- LDL+PDTC組相比，eP<0.05；與ox- LDL+miR33a inhibitor+姜黃素組相比，fP<0.05；與ox- LDL+PDTC+姜黃素組相比，gP<0.05。Note：aP<0.05 vs control group；bP<0.05 vs ox- LDL group；cP<0.05 vs ox- LDL+ curcumin group；dP<0.05 vs ox- LDL+miR33a inhibitor group；eP<0.05 vs ox- LDL+PDTC group；fP<0.05 vs ox- LDL+miR33a inhibitor+curcumin group；gP<0.05 vs ox- LDL+PDTC+curcumin group.

3 結(jié)論

姜黃素是存在于姜黃中的具有廣泛藥理學(xué)作用的天然多酚類活性物質(zhì)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能通過下調(diào)p38MAPK及NF- κB的表達(dá)抑制ox- LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSCMs)促炎因子的過表達(dá)[3，4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)[16]，每日口服20 mg/kg的姜黃素能延緩ApoE- /-小鼠AS的進(jìn)程，減輕全身炎癥反應(yīng)。這些結(jié)論都說明姜黃素具有抗炎及抗AS的作用，然而其具體的機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過體外ox- LDL刺激THP- 1巨噬細(xì)胞檢測(cè)IL- 6、TNF- α的分泌及NF- κB/miR33a信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子探討姜黃素抗炎及抗AS的分子機(jī)制。

為排除姜黃素對(duì)THP- 1巨噬細(xì)胞的毒性作用，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本研究采用不同終濃度的姜黃素與THP- 1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示，不同濃度的姜黃素對(duì)細(xì)胞的活性影響不完全相同。較低濃度(0～40 μmol/L)的姜黃素對(duì)細(xì)胞活性無影響，當(dāng)濃度達(dá)到80 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降。本研究中采用20 μmol/L的姜黃素進(jìn)行干預(yù)，該濃度在安全有效范圍內(nèi)，避免了其對(duì)THP- 1巨噬細(xì)胞的毒性作用。

miRNA inhibitor是經(jīng)人工克隆生產(chǎn)的miRNA特異性阻斷劑，能高效、穩(wěn)定的結(jié)合miRNA，抑制內(nèi)源性miRNA的活性。本研究中選用miR33a inhibitor轉(zhuǎn)染THP- 1巨噬細(xì)胞，與miR33a結(jié)合并阻斷其表達(dá)，并將miR33a control sequence以相同的方轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，與miR33a inhibitor形成對(duì)照，排除非序列特異性的干擾。結(jié)果顯示，ox- LDL顯著增加了THP- 1巨噬細(xì)胞miR33a的表達(dá)，而miR33a inhibitor減輕這種現(xiàn)象，提示miR33a inhibitor能有效抑制miR33a的表達(dá)，與之相似，姜黃素也能顯著抑制miR33a的表達(dá)，這為我們下一步研究奠定了基礎(chǔ)。

在本研究中，姜黃素或miR33a inhibitor能顯著下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌，當(dāng)姜黃素和miR33a inhibitor合用時(shí)較二者單獨(dú)使用更能顯著下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌，相反，當(dāng)姜黃素和control sequence合用與只使用姜黃素的效果無顯著差異，因此姜黃素通過抑制miR33a的表達(dá)參與調(diào)控IL- 6、TNF- α的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，miR33a扮演著促進(jìn)炎癥的角色。本研究結(jié)果與Rayner等[17]研究一致，在給予抗miR33a治療的小鼠中其體內(nèi)抗炎因子增多，而促炎因子減少，并且循環(huán)中炎性巨噬細(xì)胞的濃度也明顯降低，說明miR33a可能是一種促炎miRNA。有趣的是，Ho等[18]發(fā)現(xiàn)miR33a激活劑miR33 mimic能顯著降低NF- κB的共激活劑受體相互作用蛋白140(Receptor- interacting protein 140,RIP140)mRNA和蛋白含量，從而減少巨噬細(xì)胞TNF- α和IL- 1β的產(chǎn)生，說明巨噬細(xì)胞中miR33a又有可能是一種抗炎miRNA，與本研究結(jié)果相反。綜上所述，miR33a參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，miR33a可能存在多種不同的調(diào)節(jié)機(jī)制并且其作用效果可能與巨噬細(xì)胞所處的狀態(tài)相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究。

NF- κB與IκB在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合成復(fù)合體，一旦IκBα被激酶依賴性磷酸化而泛化和降解后，游離NF- κB轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合在一些促炎因子的DNA序列上，促進(jìn)其表達(dá)。姜黃素能抑制多種細(xì)胞由ox- LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，抑制活性可能與介導(dǎo)ox- LDL刺激的IκBα磷酸化和降解，P65的磷酸化、核轉(zhuǎn)位以及NF- κB靶向基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)[19]。本研究中，觀察到ox- LDL能顯著增加胞核內(nèi)的NF- κB p65和胞漿內(nèi)p- IκBα的含量，同時(shí)降低胞漿內(nèi)IκBα的含量，p- IκBα/IκBα比值增大，說明ox- LDL使IκBα降解以及p65核轉(zhuǎn)位，而姜黃素能逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，表明姜黃素能抑制ox- LDL刺激的IκB磷酸化，阻斷p65的核轉(zhuǎn)位，有效的抑制NF- κB信號(hào)通路被激活。

已有大量的研究證實(shí)NF- κB與炎癥相關(guān)，而本研究也證實(shí)了miR33a參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。Ho等[18]發(fā)現(xiàn)miR33a能識(shí)別NF- κB的共激活劑RIP140的3’UTR而影響炎癥因子表達(dá)，另外，Kim等[20]發(fā)現(xiàn)SIRT6是miR3a的靶向基因，而SIRT6又能與NF- κB相互作用并影響NF- κB的靶向基因。因此我們推測(cè)miR33a與NF- κB在炎癥反應(yīng)的調(diào)控方面可能存在相互關(guān)系。在本研究中，PDTC和miR33a inhibitor均能顯著下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌，并且姜黃素與PDTC或miR33a inhibitor合用時(shí)較單用下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌更為明顯，表明NF- κB/miR33a信號(hào)通路促進(jìn)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌，而姜黃素通過抑制該信號(hào)通路下調(diào)IL- 6、TNF- α的分泌。

綜上所述，姜黃素下調(diào)ox- LDL刺激的THP- 1巨噬細(xì)胞IL- 6、TNF- α的分泌，其機(jī)制可能與抑制NF- κB/miR33a信號(hào)通路有關(guān)。