麥積山野生刺五加多酚與黃酮的超聲輔助提取與體外抗氧化活性的研究

王彥博，石 燕，袁毅君

天水師范學(xué)院化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天水 741000

刺五加Acanthopanaxsenticocus(Rupr.rt Maxim.) Harms為五加科植物，野生資源豐富，全株均可入藥。因刺五加富含多種活性成分[1]，主要含有刺五加苷類(lèi)、多糖、黃酮、木脂素、酚酸等[1,2]，Chen等[3]利用電噴霧質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)刺五加葉中存在槲皮苷、金絲桃苷、槲皮素和蘆丁4種黃酮類(lèi)化合物；Chen等[2]通過(guò)UPLC- Q- TOF- MS/MS法從刺五加葉中鑒定出30個(gè)化合物，其中黃酮類(lèi)化合物9個(gè)，有機(jī)酸類(lèi)化合物8個(gè)，三萜及皂苷類(lèi)化合物2個(gè)，木脂素類(lèi)化合物2個(gè)，香豆素類(lèi)化合物3個(gè)，氨基酸類(lèi)化合物3個(gè)和其他類(lèi)化合3個(gè)，因此其被廣泛應(yīng)用于臨床。大量藥理研究表明：刺五加具有保護(hù)心腦血管[4]、抗腫瘤[5]、治療糖尿病[6]、抗疲勞[7]、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[8]等作用。

天水市麥積山山區(qū)，野生刺五加資源豐富，每年4～6月，漫山遍野的野生刺五加就是人們的美味佳肴，當(dāng)?shù)厝怂追Q(chēng)它為“五撮典”，經(jīng)天水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院老師鑒定為野生刺五加。由于刺五加的嫩莖葉可以制做多種美味佳肴，故秦嶺山脈一帶居民將其作為一種功能性“藥食同源”食品，很受歡迎。因此提取其中的天然活性物質(zhì)并對(duì)它的抗氧化活性進(jìn)行研究很有必要。

多酚與黃酮是植物特有的活性物質(zhì)，已有研究表明多酚與黃酮類(lèi)物質(zhì)具有清除活性過(guò)氧自由基、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎等生理功能[9,10]，所以含有多酚與黃酮的植物作為一種天然抗氧化劑，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛關(guān)注和研究。

麥積山野生刺五加莖葉中多酚與黃酮的提取和抗氧化活性研究目前尚未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道。為充分利用資源，進(jìn)一步提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，本次實(shí)驗(yàn)原料來(lái)源于麥積山野生刺五加，選取莖葉為研究對(duì)象，利用超聲輔助提取酚類(lèi)與黃酮類(lèi)物質(zhì)，獲取最佳提取工藝條件，在此基礎(chǔ)上，測(cè)定其含量，并對(duì)最佳條件下的提取物做體外抗氧化活性研究。通過(guò)研究為麥積山野生刺五加的綜合利用，生產(chǎn)天然抗氧化劑以及功能性食品的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生刺五加(Acanthopanax),5月份采自天水市麥積山自然保護(hù)區(qū)。濃鹽酸、硫酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、碳酸鈉、磷酸鈉、鉬酸銨、氫氧化鈉、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇、石油醚、鄰苯三酚、水楊酸、抗壞血酸(Vc)、Tris- HCl萃取液,以上均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品AR；1,1- 二苯基- 2- 三硝基苯肼(DPPH)標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma- Aldrich公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，北京化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ- 500VDB型、KQ- 700VDE型三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；PTY- 224/323型電子天平，美國(guó)康州HZ電子科技有限公司；UV- 2550型，紫外- 可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；DHG- 9076A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KL04A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH- S4型數(shù)顯恒溫水浴，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；RE- 201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海鈮歐儀器有限公司；FD- A10N- 50 冷凍干燥機(jī)，上海勝衛(wèi)電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

野生刺五加于2018年5月采自天水市麥積山區(qū)，只取莖和葉，40 °C烘干、粉碎、過(guò)60目篩，于60 °C恒溫干燥箱中干燥直到恒重，冷藏(4 °C)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 提取工藝

1.3.2.1 取上述備用原料，用石油醚脫脂后，以70%乙醇為溶劑，按實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)工藝條件進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾，濾液用5 000 rpm離心15 min，將上層清液，測(cè)定總多酚和總黃酮的含量。

1.3.2.2 按本實(shí)驗(yàn)所得到的最優(yōu)條件進(jìn)行提取，獲得上層清液后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后真空凍干36 h，轉(zhuǎn)入棕色瓶低溫(- 20 °C)避光保存，用于抗氧化實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 多酚和黃酮的提取工藝優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

以總多酚與總黃酮提取量為考察指標(biāo)，工藝參數(shù)選取如表1所示,每個(gè)因素水平均進(jìn)行3次提取，平均值即為總多酚和總黃酮提取量。

表1 單因素試驗(yàn)

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)用以確定提取野生刺五加總多酚和總黃酮的最佳工藝條件，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2所示。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 總多酚含量的測(cè)定

采用福林- 酚比色法[11]測(cè)定。用70%乙醇配制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為0.250 0 mg/mL溶液。由表3可知，定容后60 °C水浴加熱0.5 h，冷卻后暗處放置。取上層清液于760 nm處測(cè)定Y吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=3.990 1X+0.051 3，R2=0.998 2，結(jié)果以沒(méi)食子酸當(dāng)量(mg GAE/g，以干質(zhì)量計(jì)，下同)表示。線(xiàn)性范圍為 5.86～36.32 mg GAE/g。

表3 繪制福林- 酚比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)

取1 mL刺五加樣品液,按沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作的方法測(cè)定總多酚Y吸光度,得總多酚濃度X1，按下式(1)計(jì)算：

(1)

式中：X1—總多酚濃度 (mg/mL)，V—提取液體積(mL)，N—稀釋倍數(shù)，M—樣品質(zhì)量(g)

1.3.5 總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2- Al(NO3)3- NaOH比色法[12]基礎(chǔ)上改進(jìn)。配制過(guò)程按表4依次加入，每步均需靜置15 min,然后在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)Y吸光度, 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.477 1X+0.042 6，R2=0.998 8。結(jié)果以蘆丁當(dāng)量(mg RE/g)表示,線(xiàn)性范圍為4.73～49.82 mg RE/g 。

表4 繪制NaNO2- Al(NO3)3- NaOH比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的相關(guān)數(shù)據(jù)

取1 mL刺五加樣品液,按蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作的方法測(cè)定總黃酮Y吸光度,得總黃酮濃度X2，按下式(2)計(jì)算：

(2)

式中：X2- 刺五加總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)；N- 稀釋倍數(shù)；V- 提取液體積(mL)；M- 樣品質(zhì)量(g)

1.3.6 野生刺五加體外抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 總抗氧化能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)配制磷鉬試劑[13]。所有實(shí)驗(yàn)用蒸餾水作空白參比溶液，相同質(zhì)量濃度梯度的人工合成的Vc作為對(duì)照。用相同的方法按表5測(cè)定A吸光度。對(duì)照品Vc不需加熱。

表5 總抗氧化能力試驗(yàn)

1.3.6.2 1，1- 二苯基- 2- 三硝基苯肼(DPPH)法自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]配制DPPH溶液(0.2 mmol/L，無(wú)水乙醇溶液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配)，避光于室溫條件下貯存。所有實(shí)驗(yàn)以蒸餾水作空白參比液。相同質(zhì)量濃度梯度的人工合成的VC作為對(duì)照，用相同的方法測(cè)定(如表6所示)，并按公式(3)計(jì)算其DPPH自由基清除率。

(3)

表6 DPPH自由基清除能力的試驗(yàn)

(4)

表7 超氧陰離子自由基清除能力的試驗(yàn)

1.3.6.4 羥自由基(·OH)清除率測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16]的方法改進(jìn),，實(shí)驗(yàn)過(guò)程如表8所示。所有實(shí)驗(yàn)用蒸餾水作空白參比溶液，相同質(zhì)量濃度梯度的人工合成的Vc作為對(duì)照。用相同的方法測(cè)定，按公式(5)計(jì)算羥自由基(·OH)清除率。

(5)

表8 羥基自由基清除能力的試驗(yàn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖1 超聲時(shí)間對(duì)總多酚與總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由圖1可知，總多酚與總黃酮提取量在超聲提取時(shí)間為10～40 min之間時(shí)，顯著上升，40 min以后總多酚與總黃酮提取量趨于平穩(wěn)。這可能是由于超聲提取初期，細(xì)胞破碎程度迅速增加，使得提取液中總多酚與總黃酮含量不斷增加。當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)40 min后，刺五加總多酚與總黃酮已基本溶出，因此提取量并未發(fā)生顯著變化[17]。故選擇超聲時(shí)間為40 min，此條件下總多酚提取量為22.50±0.15 mg GAE/g，總黃酮提取量為25.61±0.16 mg RE/g。

由圖2可得，超聲功率從200～500 W時(shí)，總多酚提取量逐步增加，當(dāng)超聲功率超過(guò)500 W時(shí)，總多酚提取量逐漸下降，這可能與超聲波引起的“機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)”有關(guān)。導(dǎo)致酚類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)滲透速率加快[17]。當(dāng)超聲功率超過(guò)500 W后，過(guò)高的“空化效應(yīng)”會(huì)破壞刺五加多酚和黃酮的結(jié)構(gòu)，同時(shí)雜質(zhì)溶出增加，導(dǎo)致總多酚和總黃酮提取量的有所下降。所以適宜超聲功率選擇500 W，此條件下總多酚提取量為 23.51±0.15 mg GAE/，總黃酮提取量為26.12±0.18 mg RE/g。

圖2 超聲功率對(duì)總多酚與總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由圖3可知，當(dāng)提取溫度在 20 ～50 °C時(shí)，刺五加總多酚與總黃酮提取量顯著上升，但隨著溫度的進(jìn)一步升高，提取量逐步降低。這是由于溫度在一定范圍內(nèi)升高時(shí)，有利于多酚與黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶解，降低分子之間的粘滯度，增加多酚與黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出量。但溫度過(guò)高，多酚與黃酮類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性會(huì)遭到破壞[18]。反而使提取量有所下降，故選擇適宜溫度為50 °C，此條件下總多酚提取量為24.31 ± 0.21 mg GAE/g，總黃酮提取量為27.60 ± 0.23 mg RE/g 。

圖3 提取溫度對(duì)總多酚與總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction amount of total polyphenols and flavonoids

圖4 料液比對(duì)總多酚與總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio on the extraction efficiency of total polyphenols and total flavonoids

由圖4可知，料液比在1∶20～1∶35(mL∶g)時(shí)，多酚與黃酮類(lèi)物質(zhì)提取量隨著溶劑量的增加而增大，當(dāng)液料比達(dá)到1∶35(mL∶g)時(shí)，提取量達(dá)到最大(總多酚24.51±0.17 mg GAE/g；總黃酮27.42 ±0.21 mg RE/g)；此后若繼續(xù)增加溶劑的用量，總多酚與總黃酮提取量反而呈緩慢下降趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定。這可能是由于溶劑在一定條件下有一定的溶解度，故隨著溶劑量的增加提取量增加，液料比為1∶35(mL∶g)時(shí)已達(dá)到溶出極限，繼續(xù)增加溶劑的量則會(huì)溶解大量的色素、非多酚和非黃酮等醇溶性雜質(zhì)，這可能降低了溶劑的溶出能力，而溶解的雜質(zhì)也可能與溶解的多酚和黃酮在溶液中重新結(jié)合，從而降低了提取量。所以考慮提取成本和后續(xù)的回收操作，故選取液料比1∶35(mL∶g)，此條件下總多酚的提取量為24.51 ± 0.17 mg GAE/g ；總黃酮的提取量27.42 ± 0.21 mg RE/g 。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)，可知刺五加總多酚與總黃酮提取量受以上4個(gè)因素的影響較大，故設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，來(lái)考察總多酚與總黃酮提取量，得到優(yōu)組合條件，并對(duì)其進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由表9可知A2B3C3D2為提取最佳工藝條件，即超聲時(shí)間40 min、超聲功率600 W、提取溫度60 °C、料液比1∶35(g∶mL)。

表9 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表9(Continued Tab.9)

試驗(yàn)騙號(hào)No.A 超聲時(shí)間Ultrasonic time(min)B 超聲功率Ultrasonic power(W)C 提取溫度Ultrasonic temperature(°C)D 料液比solid-liquid ratio(g∶mL)總多酚提取量Total polyphenol leach(mg GAE/g)總黃酮提取量Total flavonoids extraction amount(mg RE/g)優(yōu)水平Optimal levelA2B3C3D2優(yōu)組合Optimal combinationA2 B3 C3 D2

由表10可知，總多酚與總黃酮提取效果受超聲溫度影響顯著,影響因素主次順序?yàn)椋篊>D>B>A。

表10 正交試驗(yàn)方差分析

注：F0.10(2.2)=9.0；F0.05(2.2)=19.0；F0.01(2.2)=99.0。

2.3 提取最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

由表11可知，按照最佳工藝條件A2B3C3D2進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，此條件下總多酚與總黃酮提取量均高于以上9個(gè)試驗(yàn)組合，平均提取量為總多酚25.21 ± 0.17 mg GAE/g，總黃酮28.11 ± 0.19 mg RE/g。結(jié)果證明，在此工藝條件下提取，穩(wěn)定可行。

2.4 總抗氧化能力

由圖5可知，麥積山野生刺五加提取物的總抗氧化能力隨其質(zhì)量濃度增加逐步上升，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在25.00～150.00 mg/L之間時(shí)，吸光度逐漸增大，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度大于150 mg/L時(shí)，總抗氧化能力增加逐漸趨于平緩；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大。整體來(lái)看，野生刺五加提取物的總抗氧化能力略強(qiáng)于人工合成的VC(P<0.05)。

2.5 DPPH自由基清除能力

由圖6可知，麥積山野生刺五加提取物和人工合成VC都有清除DPPH自由基的作用。對(duì)于刺五加來(lái)說(shuō)，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在60.00～140.00 mg/L之間時(shí)，清除DPPH自由基的能力增強(qiáng)很快，清除率從65.12%±1.27% 增加到90.29%±1.29%；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在140.00 mg/L 后清除率增加變平緩，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在440.00 mg/L時(shí)，清除率最大，達(dá)到94.52%±1.30%。整體來(lái)看，野生刺五加提取物對(duì)DPPH自由基清除能力顯著強(qiáng)于人工合成的VC(P<0.05)。

表11 驗(yàn)證性試驗(yàn)

圖5 刺五加提取物總抗氧化能力 Fig.5 Total antioxidant capacity of extractive from Acanthopanax

圖6 刺五加提取物對(duì)DPPH自由基清除能力Fig.6 DPPH free radical scavenging ability of extractive from Acanthopanax

2.6 超氧陰離子自由基清除能力

圖7 刺五加提取物溶液對(duì)清除效果Fig.7 Superoxide anion free radical scavenging effect of extract from Acanthopanax

圖8 刺五加提取物溶液對(duì)·OH清除效果Fig.8 Hydroxyl free radical scavenging effect of extract from Acanthopanax

2.7 羥自由基(·OH)清除能力

由圖8可知，麥積山野生刺五加提取物和人工合成VC都有清除羥基自由基(·OH)的作用。當(dāng)刺五加提取物質(zhì)量濃度小于14.00 mg/L時(shí)，清除能力弱于人工合成VC；當(dāng)質(zhì)量濃度等于14.00 mg/L時(shí)，刺五加 提取物和人工合成VC清除能力相同,此時(shí)清除率達(dá)到20.0%；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度大于14.00 mg/L時(shí)，刺五加提取物清除能力顯著強(qiáng)于人工合成VC(P<0.05)；當(dāng)刺五加提取物質(zhì)量濃度在 10.00～60.00 mg/L之間時(shí),清除羥自由基(·OH)能力增強(qiáng)很快，清除率從12.12%±2.09%增加到85.52%±2.11% ；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在60.00 mg/L后清除率增加變平緩；當(dāng)提取物質(zhì)量濃度在100.00 mg/L時(shí)，清除率最大，達(dá)到94.23%±1.53%。整體來(lái)看，野生刺五加提取物對(duì)羥自由基(·OH)清除能力顯著強(qiáng)于人工合成的VC(P<0.05)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)是以麥積山自然保護(hù)區(qū)野生刺五加為原料，研究對(duì)象為刺五加中有效成分總多酚和總黃酮，采用方法是用70%乙醇超聲輔助提取。單因素實(shí)驗(yàn)做基礎(chǔ)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)所選的四個(gè)參數(shù)進(jìn)行四因素三水平的工藝優(yōu)化，得出最優(yōu)組合為A2B3C3D2，即超聲時(shí)間40 min、超聲功率600 W、提取溫度60 °C、料液比 1∶35(g∶mL)，并對(duì)此條件進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，平均提取量為總多酚25.21 ± 0.17 mg GAE/g ；總黃酮28.11 ± 0.19 mg RE/g 。此方法原料為野生刺五加莖葉粉末，成本較低，提取效果良好，適合工業(yè)生產(chǎn)。

植物中多酚和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的高低除與它種類(lèi)、結(jié)構(gòu)有關(guān)外，還與采摘、保存、提取方法等因素有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)只對(duì)麥積山野生刺五加的提取，抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，后續(xù)還需做很多研究工作，如活性成分的分離、各有效成分間的協(xié)同作用、活性關(guān)系等。