補骨脂不同炮制飲片炮制前后化學成分定性定量分析

陳一龍，郭延壘，勵 娜，李勝容，王賢英

重慶市中藥研究院，重慶 400065

補骨脂，又名破故紙，來源于豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉的功效[1]?，F(xiàn)代研究表明，補骨脂的活性成分主要包括香豆素類、黃酮類、單萜、酚類等[2,3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和免疫調節(jié)的藥理活性[4]，作為大宗藥材，補骨脂已有一千多年的藥用歷史，由于其生品“性本大燥毒[5,6]”，故千年來臨床上多以其炮制品入藥。

補骨脂炮制始載于《雷公炮制論》[5]，根據(jù)歷代炮制沿革，千年來其主要炮制方法有鹽炙、鹽蒸、酒浸炒、清炒等[7]。在眾多的炮制方法中，鹽水炒制，因鹽可引藥入腎，可增強其補腎納氣的作用，加之工藝成本低廉，是補骨脂藥材炮制最為常用的方法之一[8]，鹽補骨脂飲片也是《中國藥典》補骨脂項下所收錄的炮制品種。同時，清炒法，即用清水悶潤炒制，也是補骨脂常用炮制方法之一，炒炙可通過加熱使果實類藥物爆裂，易于有效成分的煎出或成分之間的化學轉化，從而增強療效[9]。目前，補骨脂炮制研究多集中在鹽炙法上；對于在不同炮制方法下，補骨脂藥材炮制前后化學成分變化的報道不多[10- 14]，清炒法炮制前后的成分變化更是未見報道。

本實驗首次將補骨脂清炒品進行化學成分分析，并以補骨脂藥材生品、相同條件下炮制的鹽炙品和清炒品為研究對象，炮制前后高分辨質譜(UHPLC- Q- TOF /MS)定性分析、成分鑒定，并對9個化學成分UHPLC定量分析，結合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS- DA)和Heatmap等統(tǒng)計學方法，探討不同炮制方法對補骨脂化學成分的影響，從化學成分轉化的角度為補骨脂炮制機理研究提供數(shù)據(jù)支撐，以期更好地保障補骨脂飲片臨床用藥安全性。

1 儀器與材料

Triple TOF 4600高分辨質譜系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)，LC- 30A超高效液相系統(tǒng)(日本SHIMADZH公司)，AEG- 45SM電子天平(十萬分之一，日本島津公司)，BP121S(萬分之一)(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。KQ250DB型數(shù)控超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz，鞏義市予華儀器有限公司)，BJ- 100多功能粉碎機(德清拜杰電器有限公司)，補骨脂素(psoralen)(批號110739- 200512，中國食品藥品檢定研究院)，異補骨脂素(isopsoralen)(批號110738- 200309，中國食品藥品檢定研究院)；新補骨脂異黃酮(neobavaisoflavone)(No.B0012)，補骨脂甲素(bavachin)(No.B0013)，補骨脂乙素(corylifolinin)(No.B0010)對照品均由上海融禾醫(yī)藥科技有限公司提供；補骨脂酚(bakuchiol)(No.B0011)由上海盛中醫(yī)藥化工有限公司提供；補骨脂定(psoralidin)(No.1208/7- 2)，補骨脂寧(corylin)(No.D41004/6- 2)，補骨脂查耳酮(bavachalcone)(No.Z5143/4- 1)對照品均由課題組前期對補骨脂進行成分分離得到；乙腈、甲醇均為色譜純(美國Fisher公司)，水為超純水(杭州娃哈哈公司)，其他試劑均為分析純(重慶川東化學品公司提供)。

補骨脂藥材來源見表1，由重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL．的干燥成熟果實，樣品保存在重慶市中藥研究院(見表1)。

表1 補骨脂藥材樣品來源表

2 方法

2.1 補骨脂不同炮制飲片的制備

鹽炙飲片：基于課題組前期對補骨脂鹽炙工藝的優(yōu)化[15]，將2.10 g鹽加入適量水中溶解后，加入100 g補骨脂藥材中，混勻后悶潤12 h，在80 ℃下炒制30 min，取出，冷卻至室溫，即得鹽炙補骨脂飲片。

清炒飲片：在100 g補骨脂藥材中，加入適量水，混勻后悶潤12 h，在80 ℃下炒制30 min，取出，冷卻至室溫，即得清炒補骨脂飲片。

2.2 對照品溶液的制備

精密吸取9種對照品儲備液適量，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得含補骨脂素0.326 mg/mL、異補骨脂素0.165 mg/mL、新補骨脂異黃酮0.371 mg/mL、補骨脂甲素0.168 mg/mL、補骨脂乙素0.390 mg/mL、補骨脂酚5.055 mg/mL、補骨脂定0.213 mg/mL、補骨脂寧0.743 mg/mL、補骨脂查耳酮0.032 mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取補骨脂生品藥材、清炒及鹽炙飲片粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流提取2 h，放冷，轉移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.4 定性分析質譜條件

UHPLC色譜條件：選用Kinetex XB- C18柱(100 mm×2.1 mm,2.6 μm)，流動相為含0.1%甲酸水(A)/乙腈(B)，采用梯度程序：0～1.0 min,10% B；1.0～8.0 min；10% B～80% B；8.0～12.0 min,80% B；12.0～12.1 min，80% B～10% B；12.1～15.0 min，10% B。流速300 μL/min，柱溫為30 ℃，進樣量3 μL。

質譜條件：Triple TOF 4600高分辨質譜系統(tǒng)采用ESI離子源，采用Positive離子化方式；質量掃描范圍m/z100～1 000；鞘氣為55 Psi，輔助氣為55 Psi，氣簾氣為25 Psi，霧化溫度600 ℃，采用TOF- MS- Product Ion- IDA掃描模式，TOF/MS一級預掃描和觸發(fā)的二級掃描Product Ion- IDA離子累計時間分別為250和100 ms，采用多重質量虧損(MMDF)和動態(tài)背景扣除(DBS)作為二級觸發(fā)條件，解簇電壓40 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為35±15 eV。

圖1 補骨脂正離子模式下總離子流色譜圖Fig.1 UHPLC- Q- TOF/MS total ion chromatogram of P.corylifolia in positive ion mode注：a生品，b鹽炙品，c清炒品。Note:a:crude product,b:stir- fried product with salt,c:stir- fried product.

2.5 定性測定與數(shù)據(jù)分析

采用2.4中色譜質譜條件，分別對2.2中對照品溶液和2.3中樣品溶液進行正離子模式采集(見圖1)，所得數(shù)據(jù)采用PeakView進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)各色譜峰的二級碎片裂解規(guī)律，通過Formula Finder，結合文獻報道、數(shù)據(jù)庫和對照品比對，對補骨脂不同炮制飲片進行化學成分鑒定。

2.6 定量分析液相色譜條件

在課題組前期研究基礎上[15]，得到補骨脂UHPLC色譜條件：色譜柱為Shim- pack XR- ODS III色譜柱(50 mm×2.0 mm，1.6 μm；S/N 11122273)；檢測波長246 nm；柱溫45 ℃；進樣量4 μL；以乙腈- 0.2%冰醋酸水溶液為流動相，0.4 mL/min體積流量，梯度洗脫，見表2。分別對2.2中對照品溶液與2.3中樣品溶液進行測定，得到UHPLC數(shù)據(jù)，見圖2。通過MeV4.9.0將得到數(shù)據(jù)繪制Heatmap圖，進行含量變化的直觀分析；在通過SIMCA13.0進行無監(jiān)督模式的主成分分析(PCA)和監(jiān)督模式下正交偏最小二乘映射(OPLS- DA)分析。

表2 梯度洗脫表

圖2 補骨脂液相色譜圖Fig.2 UHPLC Chromatograms of P.corylifolia 注：A：混合對照品，B：生品，C：鹽炙品，D：清炒品。1補骨脂素，2異補骨脂素，3新補骨脂異黃酮，4補骨脂甲素，5補骨脂定，6補骨脂乙素，7補骨脂寧，8補骨脂查爾酮，9補骨脂酚。Note:A:mixed reference standard,B:crude products,C:stir- fried products with salt,D:stir- fried products.1 Psoralen,2 Isopsoralen,3 Neobavaisoflavone,4 Bavachin,5 Psoralidin,6 Corylifolinin,7 Corylin,8 Bavachalcone,9 Bakuchiol.

3 結果與分析

3.1 補骨脂不同炮制方法前后成分UPLC- Q- TOF/MS定性分析

補骨脂生品、清炒品和補骨脂鹽炙品中的化學成分在ESI正離子模式條件下均具有較好的響應，采用PeakView1.2從一級質譜圖擬合元素組成可獲知該化合物的分子式信息，再結合網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫HMDB和MassBanK等網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，分析質譜裂解規(guī)律[16、17]，可推測出各化合物的結構，本實驗共鑒定出38個化學成分(見表3)。比較補骨脂生品、清炒和鹽炙三種炮制品的總離子流圖輪廓，清炒品和鹽炙品較相似，而補骨脂生品與炮制品(清炒品、鹽炙品)比較變化較大，化合物[M + H]+233.117 7m/z，[M + H]+235.094 7m/z，[M + H]+399.143 3m/z(補骨脂新異黃酮)，[M + H]+352.094 3m/z，[M + H]+177.127 5m/z在生品和清炒品均有檢測到，而鹽制品中則沒有，5個成分中鑒定出其中一個為補骨脂新異黃酮。以補骨脂酚為例，補骨脂酚的裂解主要在烴基支鏈上，分子離子為[M + H]+257.188 4m/z(見圖3)。

表3 補骨脂不同炮制飲片中化合物的鑒定

續(xù)表3(Continued Tab.3)

編號No.化合物Compound分子式Formula加合離子Adduct誤差Error(ppm)保留時間tR(min)分子離子MS二級碎片MS210Corylifol BC20H20O5+H0.47.17341.138 5269.079 9,203.069 8,149.023 111PsoralenolC20H18O5+H0.47.17339.122 8321.111 2,267.065 6,239.070 4,137.023 312PsoralenC11H6O3+H1.97.56187.039 3131.048 513Corylifol CC20H18O5+H0.47.61339.122 8283.059 6,211.038 814Psoracorylifol DC18H24O2+H0.27.65273.185 0255.173 8,147.079 6,107.049015IsopsoralenC11H6O3+H1.97.72187.039 3131.049 516Isoaromadendrene epoxideC15H24O+H1.47.91221.190 3203.179 8,147.116 6,119.084 2,105.069 317BavachinC20H20O4+H0.68.09325.143 7269.080 3,149.022 818BakuchalconeC20H20O4+H0.48.25341.138 5269.080 2,203.070 1,149.023 519Neobavaisoflavone(B8)C20H18O4+H0.18.41323.127 8267.064 8,255.064 7,239.070 4,199.075 520IsobavacninC20H20O4+H0.68.65325.143 7269.080 3,205.085 8,149.023 221PsoralidinC20H16O5+H0.48.85337.107 2319.095 1,203.069 322Erythrinin AC20H16O4+H0.99.19321.112 4279.064 9,263.069 5,137.022 7238-PrenyldaidzeinC20H18O4+H0.19.27323.127 8267.065 8,203.07 1,147.044 324Biochanin AC16H12O5+H-0.29.39285.075 7165.018 22512-OxoisobakuchiolC18H22O2+H1.49.42271.169 6107.048 626CorylifolininC20H20O4+H0.69.72325.143 7269.080 3,149.023 0272,3-EpoxybakuchiolC18H24O2+H0.29.86273.185 0185.094 7,107.048 428Linoleic acidC18H32O2+H0.49.95281.247 6263.237 3,175.147 6,147.115 3,119.084 329Sophoracoumestan AC20H14O5+H010.10335.091 4292.072 2,248.082 230BavachalconeC21H22O4+H0.410.14339.159 2271.096 3,219.101 3,147.044 231Corylifol AC25H26O4+H-0.310.19391.190 3267.064 1,239.069 5,137.023 132PsorachromeneC20H18O4+H0.110.55323.127 8203.070 1,147.043 8 33Psoracorylifol EC18H24O2+H0.210.55273.185 0121.064 7,107.048 434Alpha-linolenic acidC18H30O2+H0.510.63279.232 0201.046 5,149.022 7354′-O-MethylbavachalconeC21H22O4+H0.411.30339.159 2271.096 3,219.101 3,147.044 236NeocorylinC25H24O4+H0.211.98389.174 8321.111 4,267.064 7,137.023 037CalameneneC15H22+H2.513.17203.179 9147.115 8,133.100 2,119.084 7,105.069 138BakuchiolC18H24O+H0.913.68257.190 2173.095 9,121.064 2,107.048 9

3.2 補骨脂不同炮制飲片中9種化學成分定量分析

3.2.1 9種成分UHPLC- DAD測定結果

9個對照品、補骨脂生品和鹽炙品色譜圖與含量測定數(shù)據(jù)來源于課題組前期補骨脂研究論文[15]，清炒品數(shù)據(jù)為首次報道，補骨脂不同炮制飲片9種成分含量(%)見表4。

3.2.2 炮制前后9種成分變化分析

3.2.2.1 Heatmap圖分析

將表3中數(shù)據(jù)用MeV4.9.0制圖，得到Heatmap圖，通過顏色區(qū)域的變化，可以非常直觀的呈現(xiàn)復雜數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)變化的特點。從圖4可見，9種成分中大多在炮制以后(清炒和鹽炙)，含量均呈現(xiàn)出上升趨勢，可見炮制品區(qū)域顏色較生品區(qū)域顏色明顯不同。

3.2.2.2 清炒組、鹽炙組與生品組Dunnett’s multiple comparisons test分析

通過GraphPad Prism 6 進行數(shù)據(jù)分析，將清炒組、鹽炙組分別與生品組的總體樣本、和各成分樣本進行Dunnett’s multiple comparisons test比較。結果PCrude vs Stir- frying=0.028 4，PCrude vs Salt=0.009 1，說明清炒組與生品組、鹽炙組與生品組存在顯著性差異，且鹽炙組與生品組對比顯差更明顯(見圖5圖例)。

圖3 補骨脂酚二級質譜圖Fig.3 MS2 of bakuchiol

表4 補骨脂中9種成分的含量百分數(shù)(n = 3)

續(xù)表4

編號No.補骨脂素Psoralen異補骨脂素Isopsoralen新補骨脂異黃酮Neobavaisoflavone補骨脂甲素Bavachin補骨脂乙素Corylifolinin補骨脂酚Bakuchiol補骨脂定Psoralidin補骨脂寧Corylin補骨脂查爾酮Bavachalcone清炒AF(Stir-fry AF)2.1140.4940.6580.1500.3584.9730.3350.3840.150清炒AX(Stir-fry AX)3.4700.6610.4390.0980.2554.0200.3550.2340.109清炒YJ(Stir-fry YJ)1.9270.4290.8100.2310.4235.3180.4150.4860.143清炒AB(Stir-fry AB)2.8590.6530.3990.1140.2983.6490.3700.3770.109清炒YQ(Stir-fry YQ)0.4080.0910.2650.0600.1362.1280.0910.2440.047清炒SA(Stir-fry SA)1.9180.4741.0840.3440.5727.2090.5520.8060.211鹽制ZB(Salt-ZB)1.7650.3930.7220.2250.4125.0860.3920.4840.122鹽制YZ(Salt-YZ)4.4271.0010.6210.1800.3606.1140.4440.6040.179鹽制YT(Salt-YT)4.4601.0140.5820.1730.3495.6710.4470.5980.154鹽制SY(Salt-SY)2.3350.4720.7000.2040.4315.0640.4170.5310.160鹽制AZ(Salt-AZ)3.4250.6460.4070.0980.2593.8480.3520.2290.106鹽制YA(Salt-YA)1.8240.3671.2310.3630.5787.1760.4240.6610.190鹽制AF(Salt-AF)2.0420.4520.6660.1640.3725.1910.3520.3980.150鹽制AX(Salt-AX)3.6400.6770.4590.1120.2824.4280.3820.2580.107鹽制YJ(Salt-YJ)1.7790.3750.5940.1750.3203.9870.3340.3940.102鹽制AB(Salt-AB)2.8250.6380.3550.0960.2733.4430.3830.3430.113鹽制YQ(Salt-YQ)1.4790.3200.9850.2310.5268.0440.3370.9700.153鹽制SA(Salt-SA)1.4250.3280.7940.2670.4285.1630.4430.6570.131

圖4 補骨脂不同飲片9種成分含量熱圖Fig.4 Heatmap of 9 constituents contents in Psoralea corylifolia

3.2.2.3 9種成分Dunnett’s multiple comparisons test分析

9種成分炮制前后柱狀圖可見，除清炒品中補骨脂寧和補骨脂酚在炮制以后含量有所下降外，補骨脂炮制品(清炒品和鹽炙品)中其他成分含量均有所上升；其中增幅最大的為補骨脂素，炮制后含量增漲了近4倍，新補骨脂異黃酮在炮制后也增長了1倍多(見圖5A)。Dunnett’s multiple comparisons test比較發(fā)現(xiàn)，從含量方面，補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂查耳酮在兩種不同方法炮制后的含量均與生品組有顯著性差異，而補骨脂定含量僅在鹽炙后與生品組比較有顯著性差異。

3.2.2.4 3大類成分Dunnett’s multiple comparisons test分析

將上述定量的9種成分按香豆素類(補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂定)、黃酮類(新補骨脂異黃酮、補骨脂甲素、補骨脂乙素、補骨脂寧、補骨脂查爾酮)、和萜類(補骨脂酚)比較(圖5B)，除清炒飲片中萜類成分，即補骨脂酚在炮制以后含量有所下降外，不同炮制法制成的補骨脂飲片香豆素類和黃酮類成分含量均有所上升；其中香豆素類成分炮制后含量增幅最大，其含量增長了近1倍。Dunnett’s multiple comparisons test比較發(fā)現(xiàn)，兩種不同方法炮制后的香豆素類含量均與生品組有顯著性差異。

圖5 補骨脂不同飲片成分含量分析Fig.5 Contents of constituents in P.corylifolia注：A 不同飲片中9種成分含量，B 不同飲片大類成分含量。*表示有差異， **表示有顯著性差異。Note:A:contents of 9 constituents in P.corylifolia,B:contents of categories of chemical constituents in P.corylifolia.* Difference,** significant difference.

3.2.3 化學模式識別法分析

通過模式識別對補骨脂3個炮制組別、9種化學成分含量進行分析，前3個主成分貢獻率為91%(PC1 = 56.9%，PC2 = 26.1%，PC3 = 7.9%)。PCA得分圖顯示(圖6A)，從空間投影距離和重疊程度了可見，所有樣本可分為兩簇：經(jīng)過炮制的飲片，鹽炙與清炒混合在一起，聚成一簇，表明經(jīng)過炮制的飲片化學成分的構成結構比較相近；而未經(jīng)炮制的生品則與炮制過的飲片相距較遠，能單獨聚成一簇，表明炮制前后補骨脂的化學成分組成結構存在較為顯著的差異。

無監(jiān)督的PCA模式分析后，將生品分為一組，炮制品(鹽炙和清炒)分為一組，去掉偏離較大的點Crude- YQ、Salt- YJ、Stiring- fry YQ，進行OPLS- DA分析(圖6B)，以等方差法(UV,unit variance)為權重，參數(shù)為R2X= 0.98，R2Y=0.97%，Q2=0.94。補骨脂生品、清炒品和鹽炙品明顯聚成兩簇，未經(jīng)炮制的生品聚為一簇，炮制后的聚成一簇。VIP值(圖6D)顯示成分補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂定和補骨脂查耳酮的含量對補骨脂生品與炮制品(鹽炙與清炒)的區(qū)分影響最大。

4 討論

4.1 補骨脂炮制后化學成分變化

本實驗在定量分析中，結合主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS- DA)模型和Heatmap等統(tǒng)計學方法進一步分析炮制前后含量變化，發(fā)現(xiàn)PCA和Heatmap的結果一致，補骨脂生品與炮制品(鹽炙和清炒)在化學成分輪廓上存在明顯差異；OPLS- DA篩選出的影響分組的差異標志物為補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂定和補骨脂查耳酮。這與統(tǒng)計分析Dunnett’s multiple comparisons test檢驗結果一致，補骨脂生品與炮制品有顯著性差異，其中各成分中，有顯著性差異的也是補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂定和補骨脂查耳酮。

本實驗定量分析的9個成分均在補骨脂藥材中含量較高，且被報道具有生物活性[18，19]。從定量數(shù)據(jù)上面看，除清炒品中少量成分(補骨脂寧、補骨脂酚)在炮制后含量有所下降外，不同炮制法制成的炮制品，在炮制后含量均有所上升，含量最大增幅為生品的4倍(補骨脂素)，新補骨脂異黃酮含量增長1倍，補骨脂酚和補骨脂寧則不同程度的減少。推測原因為在炮制過程中，上述成分的化學結構發(fā)生相互轉化造成。補骨脂素增加的原因，推測為補骨脂酚可以環(huán)合轉化為補骨脂素[14]，見圖7A。新補骨脂異黃酮含量增加可能是由補骨脂寧轉化而成，見圖7B。上述推測可闡釋炮制(“悶潤”和加熱“炙”)工藝，使一些成分的化學結構發(fā)生轉化[20]，導致藥材中具有生物活性的成分含量增高，或生成了某些具有活性的功效成份。上述推測還需通過示蹤法，進行進一步的炮制、藥理、藥效等實驗來進行驗證。

圖6 補骨脂3個樣品化學成分化學模式識別法分析Fig.6 Analysis of chemical constituents in P.corylifolia by chemical pattern recognition 注：A：PCA分析得分圖，B：OPLS- DA分析得分圖，C：OPLS- DA分析載荷圖，D：OPLS- DA分析VIP值。Note:A:score Scatter Plot of PCA,B:score Scatter Plot of OPLS- DA,C:loading Scatter Plot of OPLS- DA,D:VIP plot of OPLS- DA.

圖7 補骨脂素、新補骨脂異黃酮、補骨脂酚和補骨脂寧的轉化途徑Fig.7 Transformation pathway of psoralen,neobavaisoflavone,psoralidin,corylin注：A：補骨脂酚轉化補骨脂素途徑，B：補骨脂寧轉化新補骨脂異黃酮途徑。Note:A:pathway of psoralen turn into psoralenol,B:pathway of corylin turn into neobavaisoflavone.

4.2 補骨脂鹽炙與清炒分析

從本實驗結果來看，補骨脂生品與炮制品(鹽炙和清炒)在化學成分輪廓上存在差異，可用化學識別模式將生品與炮制品區(qū)分開，說明不同“炙”法炮制對其化學成分輪廓影響的關鍵可能在于加熱。從化學成分角度，一定程度上佐證了補骨脂“性本大燥毒”，臨床沿用歷史上均以炮制品入藥為主。

同樣是炙法，清炒與鹽炙的區(qū)別在于是否加鹽，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為“五味中鹽欲咸，下行入腎”，經(jīng)鹽炙后能使藥性下行入腎。根據(jù)質譜檢測結果，在清炒品中能檢測到的5個成分，在鹽制品中未能檢測出，推測“加鹽”在炮制過程中對成分結構組成變化影響更大。若要全面揭示其鹽炙機理，上述數(shù)據(jù)還需結合藥理藥效進行進一步研究探索。