微粒在動靜脈血栓中作用的研究進展

路文禹，續(xù) 薇

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130021；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院 檢驗科)

人體細胞激活或凋亡時會釋放一些亞微米級的囊狀小泡，微粒是代表這些囊狀小泡的一個異質(zhì)性群體。微粒攜帶大量細胞表面受體、mRNA 以及生物活性物質(zhì)，標(biāo)志著其母細胞的特異性生物功能。其所攜帶的 miRNAs 和組織因子等穿梭于細胞/組織之間，參與調(diào)控血小板活化、止血以及血栓形成等多種病理生理過程。本綜述將重點討論微粒促進或抑制凝血的同時也具有調(diào)控纖溶功能的作用，并探討微粒可能作為新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志在血栓性疾病中的作用。

1 微粒概念

微粒Microparticles(MPS)是一種直徑為100-1000 nm的囊泡狀結(jié)構(gòu)，最早在1967年由wolf首次發(fā)現(xiàn)，稱其為血小板尖埃[1]。人類血液中的MPS大多來源于血小板，但也會從白細胞、紅細胞、內(nèi)皮細胞以及腫瘤細胞中釋放，所以在血液中可檢測到血小板源性微粒(PDMP)、內(nèi)皮細胞源性微粒(EDMP)、單核細胞源性微粒(MDMP)等[2]。MPS形成可被細胞活化或細胞凋亡調(diào)控，當(dāng)細胞活化或凋亡被觸發(fā)后，細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，隨后細胞骨架發(fā)生變化，正常脂質(zhì)雙分子層發(fā)生改變，富含負電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)由內(nèi)向外出現(xiàn)翻轉(zhuǎn)，在暴露PS表面同時，MPS可能會從細胞中釋放出來[3]。許多研究表明，在變化過程中，鈣蛋白酶激活起到重要作用，機制可能是鈣蛋白酶有助于限制血小板活化后(PIP)2的形成，而(PIP)2是影響PDMP形成的重要決定因素[3，4]。細胞來源的MP首次被提出的功能就是促凝活性，主要基于其PS暴露和組織因子(tissue factor，TF)的表達[5,6]。另外，MP也可調(diào)控炎癥、血管生成、腫瘤或免疫反應(yīng)，并與靶細胞有動態(tài)的聯(lián)系。因此，MP被認(rèn)為是細胞交流的重要因子[4]。而近來針對MP的研究發(fā)現(xiàn)，MP有抗凝功能并參與纖溶反應(yīng)，進一步補充了MP在血栓中的作用[7]。

2 MP在凝血、血栓、纖溶中的作用

2.1 MP促凝功能

MP的促凝功能主要源于其表達的陰性磷脂，尤其是PS，以及主要的凝血系統(tǒng)細胞激活劑組織因子(TF)。在MP形成時，細胞膜磷脂不對稱分布的消失導(dǎo)致PS外翻到膜磷脂雙分子層外側(cè)[8，9]。由于帶負電荷，PS通過促進MP表面鈣依賴凝血因子的組裝提高凝血活性，從而促進Xa和凝血酶原酶復(fù)合物的形成以及凝血酶的生成[10]。同時攜帶PS和TF的MP促凝活性最高，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，攜帶vWF的EDMP亞群似乎能夠誘導(dǎo)血小板聚集。

組織因子(TF)是VII和VIIa的受體，是凝血啟動所必需的。組織因子由263個氨基酸殘基組成，包括219個氨基酸的N端胞外結(jié)構(gòu)域、23個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域和21個殘基c端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，其中包含與半胱氨酸結(jié)合的棕櫚酸酯和硬脂酸酯[11，12]。細胞外結(jié)構(gòu)域與細胞因子受體超家族的其他成員是同源的。組織因子結(jié)合VIIa因子在細胞表面形成組織因子/VIIa復(fù)合物，可激活I(lǐng)X因子和X因子。Jeffrey等科學(xué)家通過小鼠動物實驗表明，從造血細胞中提取的組織因子在體內(nèi)血栓形成的初始階段由微粒傳遞[13]。

血小板MP是健康人體內(nèi)最主要的MP，此時表達TF和PS的MP數(shù)量很低[14]。血小板MP是否表達TF有爭議性，因為血小板MP上TF依賴的促凝活性似乎有限，因此血小板MP對于健康人和患者體內(nèi)TF+MP的貢獻似乎很小[15]。紅細胞MP也可能以FXI依賴的方式在鐮刀狀細胞貧血病或血液制品中促進凝血。體外培養(yǎng)條件下，不同的刺激物，如細胞因子、補體和脂多糖(LPS)可刺激內(nèi)皮釋放攜帶PS和TF依賴的促凝活性的MP。

2.2 MP抗凝功能

在一定條件下，MPS也具有抗凝血的特性，這與MPS的來源和釋放刺激有關(guān)。因此，MPS可能有助于調(diào)節(jié)抗血栓或血栓形成前血管系統(tǒng)之間的平衡。TF:FVIIa復(fù)合物受TF途徑抑制物(TFPI)的調(diào)節(jié)[16]。TFPI最初由內(nèi)皮細胞合成釋放到血液中阻止不合理的凝血激活。TFPI本身也被發(fā)現(xiàn)存在于不同細胞來源的MP上，如內(nèi)皮、單核細胞以及急性心?；颊呋颊唧w內(nèi)的循環(huán)MP[17，18]。因此，MP表面的TF和TFPI間的平衡影響著它們的促血栓活性，并因不同的疾病而異。另一個調(diào)節(jié)MP的抗凝機制是其表達的抗凝血受體血栓調(diào)節(jié)素(TM)和內(nèi)皮細胞蛋白C受體(EPCR)。血小板MP還發(fā)現(xiàn)能通過激活的蛋白C促進Va的滅活。

2.3 MP纖溶功能

在不同類型MPS中發(fā)現(xiàn)與纖溶相關(guān)物質(zhì)，這些證據(jù)表明MPS是纖維溶解蛋白生成的有效支持物，此發(fā)現(xiàn)進一步增強了MPS在調(diào)控凝血平衡中的作用[19]。兩種絲氨酸蛋白酶，尿激酶(u-PA)和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)可激活纖溶酶原生成纖溶酶[20]。u-PA綁定到細胞表面的特定受體(u-PAR)，如單核細胞、T細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞；t-PA主要綁定到神經(jīng)元、突觸細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞。MP依賴的纖溶酶生成機制包括經(jīng)典的機制，即纖溶酶原結(jié)合MP表面的纖溶酶原激活劑，以及新發(fā)現(xiàn)的機制，即MP錨定的u-PA直接激活綁定在血小板、纖維蛋白或細胞外基質(zhì)蛋白上的纖溶酶原[21]。這些發(fā)現(xiàn)表明，MP可作為纖溶酶生成的有效表面。纖溶酶生成受到纖溶酶原激活劑和抑制劑的高度調(diào)控。內(nèi)皮MP上可檢測到t-PA和它的抑制物PAI-1形成的復(fù)合物，這在純化的內(nèi)皮MP和血栓性血小板減少性紫癜患者體內(nèi)純化的MP上均可發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)表明MP作為載體可攜帶多種纖溶酶或其抑制物，從而發(fā)揮調(diào)控凝血平衡的作用。

3 MP在血栓性疾病中的標(biāo)志物作用

研究發(fā)現(xiàn)在多種動靜脈血栓性疾病中循環(huán)MP水平均升高，且與疾病的病理生理發(fā)生發(fā)展過程有關(guān)[22]。循環(huán)MP檢測的臨床意義可看作是MP產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡[23]。盡管MP因高度促凝參與疾病的惡化過程，但至今仍不清楚MP是心血管疾病的原因還是病理過程的結(jié)果，或僅僅只是患心血管病危險因素增大的標(biāo)志。因此，本部分將著重闡述近期研究成果，并從中發(fā)現(xiàn)一些證據(jù)證實MP可能作為血栓性疾病標(biāo)志物的相關(guān)研究成果。

3.1 動脈血栓

多種危險因素與心腦血管事件相關(guān)，Nicolas Amabile通過對844名沒有心血管疾病(心肌梗死史、冠狀動脈供血不足、中風(fēng)和心力衰竭)的參考者進行分組(以性別、年齡、體重指數(shù)等)分析，通過Guava EasyCyte8 HT進行分析表明，CD144陽性單核細胞微粒血漿水平與幾個心血管危險因素有關(guān)，包括較高的甘油三酯水平、高血壓和代謝綜合征，可能原因是高代謝危險因素導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化或損傷增加[24]，也可能是病理情況下這些增多的MP未被及時清理。進一步發(fā)現(xiàn)，MP可促進單核細胞黏附于血管內(nèi)皮細胞[25]，這是后續(xù)多種炎癥細胞浸潤以及粥樣斑塊形成的關(guān)鍵步驟。Felix Jansen 等科學(xué)家通過對人冠狀動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)和小鼠模型進一步研究了相關(guān)機制：循環(huán)MP促使血管內(nèi)皮細胞表達粘附分子ICAM-1，并刺激單核細胞表達CD11a等粘附分子受體，MP亦可通過攜帶的miR-222調(diào)控ICAM-1的表達[26]。更重要的是，研究發(fā)現(xiàn)從患者粥樣斑塊分離出來的MP可直接將有功能的ICAM-1轉(zhuǎn)移至靶細胞。并且血小板MP可將促斑塊形成的趨化因子CCL5攜帶至血管內(nèi)皮細胞，從而促進白細胞在血管內(nèi)皮的粘附[27]，Stephen 等使用HL-60細胞，轉(zhuǎn)染表達人P選擇素，發(fā)現(xiàn)在湍流的血液中血小板MP攜帶的P-selectin則可通過促進白細胞-白細胞相互作用助力單核細胞穿透內(nèi)皮屏障進入內(nèi)皮下[28]。這些基礎(chǔ)研究表明，病理情況下釋放的MP可影響內(nèi)皮下空間中白細胞功能及其分布，促進斑塊形成和發(fā)展，從而促進血栓的形成。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，短暫性缺血性中風(fēng)和冠心病患者循環(huán)血小板MP的水平增高，并且增高的血小板MP與健康男性冠心病的高風(fēng)險相關(guān)[29]。Voukalis等[30]取200例經(jīng)血管造影證實為CAD患者，排除了惡性疾病、炎癥性疾病和除心肌缺血外的嚴(yán)重急性缺血患者，取血漿標(biāo)本使用FACSCalibur流式細胞儀染色后進行分析，證實循環(huán)CD31+/Annexin V+MPs水平是穩(wěn)定型冠心病患者心血管事件的獨立預(yù)測因子。Neves等[31],招募了42名腫瘤患者，應(yīng)用VEGFi進行治療(VEGFi是一種抗血管生成藥物，用于治療實體腫瘤)比較用藥前后的MPs變化情況，從最終取得的39例數(shù)據(jù)中得出，應(yīng)用VEGFi會導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，而由此釋放出來的MPs，是內(nèi)皮細胞損傷的潛在標(biāo)志物。M?rtberg等[32]也證明，在晚期腎衰患者中，內(nèi)皮MP顯著增高，其水平是一個預(yù)測嚴(yán)重心血管結(jié)局的有效標(biāo)志物。此外，MP依賴的TF活性在急性冠脈綜合癥患者中升高，血管成形術(shù)后更高，并在溶栓失敗時依然增高。這表明溶栓失敗可能會導(dǎo)致循環(huán)TF+MP整合到血栓中。盡管多項研究表明眾多血栓性疾病中血小板或白細胞MP水平增高，進一步研究需要測定出血小板和白細胞MP在預(yù)測未來血栓性事件的閾值。

3.2 靜脈血栓

大部分有關(guān)MP和靜脈血栓(VTE)的研究集中于癌癥患者和癌癥模型小鼠，因為腫瘤細胞在體外釋放大量的TF+MP。鑒于這些MP表達大量的TF，Anubha等研究117名患有包括胰腺疾病、肺栓塞、深靜脈血栓和其它動、靜脈疾病的患者，對這些患者進行MP-TF的連續(xù)監(jiān)測，平均隨訪時間為421天，所有患者MP-TF平均和中位活性分別為2.15±3.8和1.2 pg/ml，在胰腺癌中MP-TF>2.5 pg/ml的中位生存期為98.5天，得知MP-TF活性升高與胰膽管癌和血栓栓塞患者生存率下降有關(guān)[33]。Christensen等研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者癌組織中TF表達增加提示預(yù)后差[34,35]。Lacroix等[36]在小鼠原位癌模型中測定了腫瘤來源的TF在血栓形成中的作用。研究者將攜帶有活化人源性TF的人胰腺癌細胞種植于裸鼠，發(fā)現(xiàn)凝血瀑布的激活是由于小鼠體內(nèi)人源的TF導(dǎo)致的。然而只有不到5%的TF活性與循環(huán)MP有關(guān)。這些結(jié)果表明凝血瀑布的系統(tǒng)性激活所涉及的TF主要是腫瘤本身。這項研究反應(yīng)了癌癥相關(guān)的動靜脈血栓形成的復(fù)雜性。研究中涉及的癌癥細胞系、MP的檢測和定義方法、腫瘤的定位，以及在野生型或裸鼠體內(nèi)用到的人源或鼠源細胞系均會影響疾病的病理生理。然而，重要的是癌細胞MP可能并不是導(dǎo)致促凝狀態(tài)發(fā)展到癌癥相關(guān)血栓形成的唯一因素。

事實上，單核MP或癌細胞MP似乎通過攜帶的活化TF直接參與血栓形成，但增多的血小板MP或內(nèi)皮MP可能也反映出體內(nèi)高凝狀態(tài)。進一步的研究需要證實不同亞群的MP在動靜脈血栓中的作用。

4 應(yīng)用和展望

盡管心血管疾病的診治已得到一系列的進展，血栓性疾病仍然是發(fā)展中國家致死率和致殘率的主要原因[37，38]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，隨著危險因素在全球范圍內(nèi)的不斷升高，針對危險因素的治療并不能消除心血管疾病的風(fēng)險[39]。因此，發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物和潛在治療方法至關(guān)重要。

在2型糖尿病合并代謝綜合癥和微血管并發(fā)癥患者中，血小板源性MPS增加以及在與血栓栓塞并發(fā)癥相關(guān)的疾病中，包括DIC、肝素誘導(dǎo)的血小板減少、動脈粥樣硬化性血管疾病會出現(xiàn)MP數(shù)量增加。體個動物試驗也證明，造血細胞來源的組織因子在血栓形成過程中的積累與微粒有關(guān)，微粒在血栓形成的初始階段起到傳遞作用。目前對微粒進行檢測最常用的是基本光散射的流式細胞術(shù)，可以確定微粒大小和數(shù)目，但針對MP的研究仍然處于初級階段并受到諸多方面的限制。首先，MP和其他類型的囊泡結(jié)構(gòu)大小接近，且在磷脂含量和抗原成分方面的異質(zhì)性不是很明顯，如何以可重復(fù)性的方法去定義和檢測MP成為比較棘手的問題。其次，對于定義稀有MP亞群，迄今并沒有最佳的一致性標(biāo)志物。最后，我們必須意識到MP僅反應(yīng)患者血管狀態(tài)的一個方面，并不能除外MP母細胞所做的貢獻。對于未來MP的研究，最好使用更具兼容性的檢測系統(tǒng)，這將為評估血栓事件的發(fā)生風(fēng)險以及提高檢測治療手段的有效性提供更好的前景。