補骨脂水提藥渣灌胃給藥4 周的大鼠亞慢性毒性實驗研究*

王昭昕，楊 莉，盧國彥，張 玥，2，于英莉，2，周 昆，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津 301617）

補骨脂是豆科植物補骨脂（Psoraleacorylifolia L.）的干燥成熟果實，主要含香豆素類、黃酮類和單帖酚類等成分[1]。始載于《雷公炮炙論》，藥性苦、辛、溫，歸腎、脾經(jīng)[2]，有補腎壯陽、補脾健胃的功能。補骨脂在臨床上多以水煎的方式入藥，在中成藥生產(chǎn)過程中也多采用水提。補骨脂水提后的藥渣即被廢棄，不僅造成資源浪費，而且容易由此引發(fā)環(huán)境污染問題[3]。本課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)補骨脂水提后藥渣仍具有藥效，對維甲酸誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)疏松有治療作用[4]，并且能夠顯著抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠外周白細胞減少，其效果甚至優(yōu)于等劑量補骨脂生藥及其水提物[5]。由此可見，補骨脂水提藥渣仍然具有一定的藥用價值。但是目前對補骨脂水提后藥渣的安全性研究相對匱乏。本研究對補骨脂水提后藥渣的毒性進行研究，通過比較補骨脂生藥和藥渣對大鼠的毒性作用，為補骨脂水提后藥渣的再利用提供研究基礎(chǔ)，為提高補骨脂藥材的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 受試樣品 補骨脂藥材、補骨脂生藥粉、補骨脂水提藥渣，均為天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院王躍飛研究員團隊制備提供，產(chǎn)品批號：20120920。

補骨脂生藥粉：補骨脂藥材直接粉碎，制得棕色補骨脂生藥粉；經(jīng)含量測定，內(nèi)含補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂酚、補骨脂甲素、補骨脂乙素，分別為：5.007 4、4.140 9、14.225 4、10.109 9、62.515 7、2.264 1、4.369 7mg/g 生藥。

補骨脂水提藥渣：補骨脂藥材經(jīng)水沸提取后，濾布過濾得到的濾渣再用水提取，浸提液60 ℃減壓烘干，制得水提藥渣（折合1.33 g 生藥/g 藥渣）。經(jīng)含量測定，內(nèi)含補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂苷、異補骨脂苷、補骨脂酚、補骨脂甲素、補骨脂乙素，分別為：4.156 3、3.552 7、0.753 0、0.399 1、67.954 5、1.786 7、3.696 4mg/g 生藥。

1.2 動物及飼養(yǎng) SD 大鼠，SPF 級，雌雄各半，共70 只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2009-0015。動物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。所用飼料為全價顆粒飼料，由天津市華榮實驗動物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試劑與儀器 白蛋白（ALB）、堿性磷酸酶（ALP）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（CREA）、總膽固醇（TC）、總蛋白（TP）、總甘油三酯（TG）和總膽汁酸（TBA）試劑盒均為中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)。

總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

離心機（賽默飛，Legend Micro17 型），恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海世平實驗設(shè)備有限公司，SPH-103B型），全自動封閉脫水機（Leica，ASP300S 型），切片機（Leica，RM2135 型），顯微鏡（OLYMPUS，BX51型），包埋機（天津航空機電公司，BMJ-1）型，多功能酶標儀（Tecan，InfiniteM200 型），全自動生化分析儀（日立，7020 型）。

2 方法

2.1 分組與給藥 雌、雄SD 大鼠按體質(zhì)量隨機分為5 組，每組7 只，共70 只。對照組灌胃給予等體積的溶劑，補骨脂生藥高劑量6 g/kg（生藥量）和補骨脂生藥低劑量3 g/kg（生藥量）劑量組，補骨脂藥渣高劑量6 g/kg（生藥量）和補骨脂藥渣低劑量3 g/kg（生藥量）劑量組，每日給藥1 次，連續(xù)灌胃給藥4 周。

2.2 一般狀況觀察 給藥期間每周稱質(zhì)量一次，根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量，每日給藥前觀察動物的毛色、進食、活動等情況。

2.3 血清生化檢測 大鼠灌胃給藥4 周結(jié)束后，禁食不禁水12 h，實驗前大鼠用10%水合氯醛麻醉，經(jīng)腹主動脈取血5 mL，3 000 r/min 離心10 min，分離得到血清，通過自動生化儀檢測指標ALB、ALP、ALT、AST、BUN、CRE、TC、TP、TG 以及TBA。

2.4 MDA 和T-AOC 的含量測定 取動物肝臟，制備成10%的肝臟勻漿，用比色法檢測大鼠肝臟中MDA 和硫代巴比妥酸（TBA）法檢測T-AOC 水平，具體操作按試劑盒說明書進行。

2.5 肝臟臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查 剖腹摘取大鼠心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺，稱質(zhì)量，計算臟器系數(shù)（臟器質(zhì)量/體質(zhì)量）。切取大鼠一葉肝臟和左腎于10%中性甲醛溶液中固定，固定液為組織體積的5～10 倍，固定48 h，石蠟切片，常規(guī)HE 染色，光鏡下觀察組織病變。

3 結(jié)果

3.1 補骨脂生藥和藥渣對大鼠一般情況的影響 在整個灌胃給藥期間，各給藥組大鼠進食、活動情況正常，毛色無異常變化，雌雄各組動物均無死亡。

3.2 補骨脂生藥和藥渣對大鼠體質(zhì)量的影響 補骨脂生藥和藥渣灌胃給藥4 周對雌雄大鼠體重變化的影響如表1 所示：與對照組相比，灌胃給藥4 周后，生藥高劑量組雄性大鼠體質(zhì)量顯著降低，雌性大鼠體質(zhì)量亦呈現(xiàn)下降趨勢。其他組大鼠體質(zhì)量無明顯變化。

3.3 補骨脂生藥和藥渣對大鼠血清生化的影響 與對照組比較，生藥高劑量組雄性大鼠ALB 顯著升高；生藥低劑量組雄性大鼠TBA、T-CHO 均顯著降低，雌性大鼠各參數(shù)無顯著差異（P＞0．05）；藥渣高劑量組雄性大鼠TBA、TC、ALB 均顯著降低，雌性大鼠ALP 顯著升高；藥渣低劑量組雄性大鼠TC 和ALB顯著降低，雌性大鼠BUN 顯著升高。與生藥低劑量組相比，藥渣低劑量組雄性大鼠ALB 顯著升高，見表2。

3.4 補骨脂生藥和藥渣對大鼠MDA 和T-AOC 的影響 與對照組比較，生藥高、低劑量組雄性大鼠MDA 均顯著升高，且低劑量組MDA 值較對照組升高188．54%；生藥高劑量組，藥渣高、低劑量組雄性大鼠T-AOC 均顯著升高，且較對照組T-AOC 值分別升高72．73%、127．27%、163．64%。雌性大鼠生藥高、低劑量組MDA 顯著升高；生藥高劑量組和藥渣高、低劑量組T-AOC 均顯著升高。與生藥組相比，雌雄大鼠的藥渣組MDA 均顯著降低；雄性藥渣低劑量組T-AOC 顯著升高。見圖1。

3.5 補骨脂生藥和藥渣對大鼠臟器系數(shù)及組織病理學(xué)的影響 與對照組相比，雄性大鼠生藥高、低劑量組，藥渣高、低劑量組的肝、腎系數(shù)均有顯著升高，且生藥組高、低劑量組肝、腎臟器系數(shù)分別較對照組升高136．47%和34．59%；藥渣高、低劑量組肝、腎臟器系數(shù)分別較對照組的升高69．02%、33．05%；藥渣高、低劑量組，生藥高、低劑量組胸腺系數(shù)顯著降低。與生藥低劑量組相比，藥渣低劑量組肝臟系數(shù)顯著降低。雌性大鼠生藥高、低劑量組，藥渣高、低劑量組的肝系數(shù)顯著升高；藥渣高、低劑量組腎系數(shù)顯著升高；藥渣低劑量組胸腺系數(shù)顯著降低，其他各組無顯著差異；與生藥組相比，藥渣組肝系數(shù)顯著降低。見表3。

光鏡下觀察，與對照組相比，給藥組大鼠的肝臟和腎臟在光鏡下未見明顯的組織病變。

4 討論

補骨脂作為中國傳統(tǒng)中醫(yī)臨床常用藥，多以水煎的方式入藥，在中成藥生產(chǎn)過程中也多采用水提，而其水提后的藥渣即被廢棄。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，補骨脂生藥和水提后藥渣均使大鼠體重降低，在不同程度上提高肝、腎臟器系數(shù)、升高MDA 水平，降低胸腺系數(shù)，存在相似的毒性作用。特別是生藥高劑量組和藥渣高劑量組，顯著提高了大鼠TBA、TC、ALB 等參數(shù)，提高了MDA 水平，并降低了T-AOC 水平，使肝臟系數(shù)顯著升高，毒性作用明顯，且對雌雄大鼠毒性差異不明顯。但是從與生藥組比較的情況看，藥渣組的肝臟系數(shù)、MDA 水平有所降低，而且藥渣低劑量組較生藥低劑量組TAOC 含量也顯著升高。這些結(jié)果提示補骨脂水提后藥渣毒性較補骨脂生藥有所降低。

表1 補骨脂生藥和藥渣給藥1 個月對雌雄大鼠體質(zhì)量的影響（）

表1 補骨脂生藥和藥渣給藥1 個月對雌雄大鼠體質(zhì)量的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0．05。

組別 例數(shù) 給藥前 給藥后1 周 給藥后2 周 給藥后3 周 給藥后4 周雌性 對照組7153．2± 4．9171．1±12．7184．3±18．1192．2±15．4203．7±19．6生藥高7143．4±15．8157．4±11．7163．5±26．2*183．2±20．1194．5±23．0生藥低7154．1±12．4171．9± 9．9193．7± 7．8204．8± 6．9214．0± 8．3藥渣高7149．8± 5．6163．0± 7．9181．1±12．5193．2±15．4208．3±16．1藥渣低7147．5±13．8159．3± 9．5171．2± 7．8185．3± 7．3196．5± 7．6雄性 對照組7159．5±21．7198．9±27．4224．7±29．8252．5±34．0273．3±34．5生藥高7161．5± 9．8184．6±16．8204．8±11．7239．2± 9．9228．0±11．8*生藥低7154．1±19．8201．8±23．9232．3±28．1243．0±31．7274．3±41．6藥渣高7148．6±10．4175．0±21．4201．7±30．2220．6±32．3246．6±35．3藥渣低7155．3±32．3205．7±20．2237．2±27．2264．3±26．1288．3±25．2

表2 補骨脂生藥和藥渣給藥一個月對雌雄性大鼠血清生化指標的影響（）

表2 補骨脂生藥和藥渣給藥一個月對雌雄性大鼠血清生化指標的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01，***P＜0．001；與生藥組相比，##P＜0．01，###P＜0．001。

組別 動物數(shù)ALT（U/L）AST（U/L）ALP（U/L）TBA（μmol/L）TG（mmol/L）T-CHO（mmol/L）BUN（μmol/L）CRE（μmol/L）TP（g/L）ALB（g/L）雌性 對照組731．83± 3．76 95．50±10．80 88．67±24．20 13．83± 5．780．42±0．16 1．71±0．219．03±0．6530．83± 1．72 63．52± 2．5434．45±0．91生藥高731．33±15．82 87．83±37．49 136．67±23．25 11．67± 7．940．26±0．15 1．89±0．46 12．06±4．5925．33±10．60 62．65±17．8633．37±4．03生藥低728．83± 6．59 87．50±15．23 143．67±55．65 14．00±11．400．40±0．18 1．33±0．708．41±1．3528．00± 4．43 65．20± 4．0533．78±1．37藥渣高727．17± 6．31 98．33± 7．20 98．00±25．06* 8．83± 2．640．40±0．11 1．19±0．28 11．07±1．1334．33± 4．93 66．72± 1．6333．68±1．25藥渣低739．67±13．25 105．17±18．54 117．50±36．25 10．83± 5．150．28±0．09 1．50±0．308．55±1．1227．33± 2．73 64．77± 2．5832．47±1．13雄性 對照組735．00± 7．3892．4±18．10 178．80±37．00 30．00±21．130．57±0．31 1．76±0．279．12±1．4026．60± 3．71 60．96± 2．7333．62±0．93生藥高729．00± 6．96 96．00±16．10 166．67±35．61 11．33± 8．710．31±0．19 1．18±0．22 14．17±2．3729．00± 6．87 68．95± 3．4534．45±1．63*生藥低727．86± 4．26 88．00±13．64 122．43±27．23 4．00± 2．45** 0．33±0．12 1．26±0．21** 8．69±1．8928．57± 3．95 62．51± 3．4031．46±0．95藥渣高728．57± 5．97 100．57±23．02 181．57±33．83 5．29± 4．11** 0．32±0．02 1．29±0．32** 8．72±0．7124．86± 3．02 62．34± 1．9332．31±0．64**藥渣低729．17± 2．48 85．50±15．06 169．83±22．44 13．50± 8．260．38±0．10 1．40±0．15** 9．66±1．37***### 27．00± 3．52 60．87± 1．66***## 31．62±0．70##

表3 補骨脂生藥和藥渣給藥一個月對雌雄性大鼠臟器系數(shù)的影響（）

表3 補骨脂生藥和藥渣給藥一個月對雌雄性大鼠臟器系數(shù)的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0．05，**P＜0．01，***P＜0．001；與生藥組相比，###P＜0．001。

組別 動物數(shù) 臟器系數(shù)（%）心肝脾腎胸腺雌性 對照組70．366±0．0343．073±0．1130．234±0．0310．698±0．0310．200±0．038生藥高70．383±0．0436．653±0．240***###0．247±0．0120．818±0．0540．143±0．020生藥低70．385±0．0245．093±0．214***###0．237±0．0210．822±0．0510．192±0．025藥渣高70．371±0．0304．370±0．152***###0．214±0．0180．768±0．066**0．172±0．042藥渣低70．368±0．0253．690±0．360***###0．200±0．0280．741±0．045**0．177±0．042*雄性 對照組70．290±0．0352．550±0．5090．184±0．0330．584±0．0850．152±0．038生藥高70．319±0．0166．031±0．313**0．193±0．0290．768±0．031*0．118±0．018*生藥低70．318±0．0244．239±0．380***0．172±0．0220．764±0．080**0．111±0．022*藥渣高70．336±0．0154．310±0．314***0．209±0．0510．777±0．051*0．114±0．016**藥渣低70．320±0．0193．798±0．290***###0．179±0．0350．770±0．078*0．117±0．008*

圖1 補骨脂生藥和藥渣給藥1 個月對雌雄性大鼠MDA 和T-AOC 的影響

對補骨脂水提物和水提后藥渣的成分進行分析，發(fā)現(xiàn)補骨脂水煎劑中的成分主要是補骨脂素、異補骨脂素、補骨脂苷、異補骨脂苷和極少量補骨脂酚[7]，其中補骨脂素和異補骨脂素是水煎劑中吸收入血的主要有效成分[8]；而補骨脂藥渣中則含有較多的補骨脂酚，補骨脂素、異補骨脂素的含量比生藥略少，幾乎沒有補骨脂苷和異補骨脂苷。我們課題組前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂水提后藥渣具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用，并且能夠顯著抑制環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠外周白細胞減少[4，5]。已有研究證實補骨脂酚有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、消炎、降糖降血脂、祛斑等多種藥理作用[9-15]，這提示補骨脂酚可能是補骨脂水提后藥渣中的主要有效成分。本研究結(jié)果顯示，補骨脂藥渣的體內(nèi)毒性較生藥有顯著降低，這提示我們補骨脂在工業(yè)大生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量水提藥渣有一定藥用價值，在治療骨質(zhì)疏松等疾病的中藥方劑中，可以考慮將補骨脂水提藥渣作為一個新的可用部位。另外，目前已有大量研究對補骨脂酚廣泛而有效的藥理作用有所認識，從補骨脂水提藥渣中提取補骨脂酚，也許是另一個資源利用的思路。