正交實驗法優(yōu)選酒洗紅花的炮制工藝*

劉彩鳳，梁 軍，鐘琳瑛，張 琦，田灣灣，劉冬涵，白 潔，杜守穎，何樞衡

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029；2.億帆醫(yī)藥股份有限公司，臨安 311300）

紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花。夏季花由黃變紅時采摘，陰干或曬干；性味辛溫，歸心、肝經(jīng)，用于經(jīng)閉，痛經(jīng)，惡露不行，癥瘕痞塊，胸痹心痛[1]；其入藥歷史悠久，文獻(xiàn)記載豐富，是中國的傳統(tǒng)及臨床常用藥材，其炮制品酒紅花在歷史上也有沿用。最早東漢張仲景的《金匱要略》中記載紅花為“紅藍(lán)花酒方”，將紅藍(lán)花與白酒一起放入鍋中，煎減至半，紅藍(lán)花即紅花[2]。明代《明醫(yī)》里記載紅花為酒洗紅花[3]。清代吳儀洛所編寫的《本草從新》記載紅花為酒紅花：“酒噴微焙”[4]。清代柴得華《婦科冰鑒》里“桃紅四物湯”這一處方又沿用酒洗紅花[5]。紅花的酒制品各代不一，且酒洗紅花的炮制方法無詳細(xì)記載，在各版藥典及地方炮制規(guī)范中也無收錄，因此，酒洗紅花的研究目前較欠缺。

酒洗這一炮制方法是歷代所沿用的一種中藥酒制法，一般認(rèn)為藥物經(jīng)酒洗后，部分可滲入其組織內(nèi)部，發(fā)揮緩性、增效等作用，大黃經(jīng)酒洗后，可借酒之熱，調(diào)和大黃之寒[6]，地黃經(jīng)酒洗后，防治寒涼傷胃氣[3]，也有部分藥物經(jīng)酒洗后可治婦人血氣走作疼痛、月水不調(diào)及破血通經(jīng)，如當(dāng)歸、紅花，但是對紅花來說，目前并沒有文獻(xiàn)對其酒炮制品的藥效和成分進(jìn)行研究。酒洗最早見于漢代張仲景《傷寒論》大黃“去皮，清酒洗”，用于調(diào)胃承氣湯中，并且認(rèn)為“酒洗入陽明經(jīng)”[7]，后來酒洗炮制方法一直沿用，如從唐代、宋代、元代、明代及清代均出現(xiàn)酒洗當(dāng)歸，且現(xiàn)行《上海市中藥炮制規(guī)范》記載當(dāng)歸酒洗方法為“取當(dāng)歸，噴灑黃酒，拌勻，使之吸盡，曬或低溫干燥”。因此，綜合地方炮制當(dāng)歸的酒洗方法及《本草從新》中酒紅花的炮制方法，作為酒洗紅花的炮制依據(jù)，文章就對酒洗紅花炮制工藝、其酒洗前后含量差異和水煎液指紋圖譜進(jìn)行了一些實驗研究，以期對關(guān)于酒洗紅花研究提供一些科學(xué)借鑒。

1 儀器與試藥

Thermo Fisher U3000 高效液相色譜儀[DAD 檢測器，CM 7.2 色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；屹立QE-200 高速萬能粉碎機；BSA 224S 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；JM-B10002 電子天平（余姚市及紀(jì)銘稱重校驗設(shè)備有限公司）；BT 125D 電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

羥基紅花黃色素A（hydroxysafflor yellow A，HSYA，批號11637-201810，購自中國食品藥品檢定研究院）；山奈素（批號110861-201611，購自中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水，乙腈、甲醇為色譜純（美國Thermo Fisher Scientific 公司），其余試劑均為分析純；黃酒（塔牌紹興花雕酒，浙江省糧油食品進(jìn)出口股份有限公司）。

紅花購于北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 HSYA：色譜柱Shim-pack GIST C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0．02%磷酸（5∶20∶75）；檢測波長403 nm；流速1 mL/min 柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

山奈素：Shim-pack GIST C18（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0．1%磷酸（65∶35）；檢測波長367 nm；流速1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備方法 HSYA：精密稱取HSYA 對照品適量，加25%甲醇制成質(zhì)量濃度為0．626 g/L 的對照品母液。見圖1。

圖1 供試品和HSYA 對照品高效液相色譜（HPLC）圖

圖2 供試品和山奈素對照品高效液相色譜（HPLC）圖

山奈素：精密稱取山奈素對照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0．545 g/L 的對照品母液。見圖2。

2.1.3 供試品溶液的制備方法 HSYA：取紅花粉末（過3 號篩）約0．4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHZ）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用25%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

山奈素：取紅花粉末（過3 號篩）約0．5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加人甲醇25 mL 稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，置平底燒瓶中，加鹽酸溶液（15—37）5 mL，搖勻，置水浴中加熱水解30 min，立即冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

HSYA：精密吸取HSYA 對照品母液適量，將母液逐級稀釋為0．250，0．125，0．063，0．031，0．006 g/L的對照品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=0．519 8X+1．726 7，R2=0．999 6；結(jié)果表明，HSYA 在0．006～0．626 g/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

山奈素：精密吸取山奈素對照品母液適量，將母液逐級稀釋為0．218，0．109，0．054，0．027，0．005 g/L對照品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=0．719 1X+1．242 6，R2=0．999 9；結(jié)果表明，山奈素在0．005～0．545 g/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度實驗 分別精密吸取對照品溶液，連續(xù)進(jìn)6 次，進(jìn)樣10 μL，測定對照品溶液中的峰面積值，HSYA 的RSD=0．23%，山奈素RSD=0．32%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 測定，根據(jù)峰面積計算HSYA RSD=0．56%，山奈素RSD=1．53%，結(jié)果表明供試品溶液中HSYA 和山奈素在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批樣品6 份，按照“2．1．3”項下方法制得6 份供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計算含量，HSYA 的RSD=0．32%，山奈素RSD=1．88%，表明這兩種方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批樣品6 份，分別精密加入一定量的對照品溶液，按照“2．1．3”項下方法操作得到加樣供試品溶液，按上述條件測定，HSYA 方法的平均回收率為97．70%，RSD=0．67%，結(jié)果見表1。山奈素方法的平均回收率為97．14%，RSD=2．29%，結(jié)果見表2。

3 正交設(shè)計優(yōu)選酒洗紅花炮制工藝

3.1 因素水平設(shè)計和酒洗方法 本實驗以HSYA、山奈素為考察指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計法對影響紅花酒洗工藝的加酒量、浸吸時間、烘干溫度3 因素進(jìn)行考察，選用了L9（34）正交表安排實驗，因素與水平表見表3。

酒洗方法：取凈紅花，加黃酒噴勻后，浸吸一定時間，以相應(yīng)的溫度烘干至干燥為度。

表1 HSYA 加樣回收實驗結(jié)果

表2 山奈素加樣回收實驗結(jié)果

3.2 樣品測定及結(jié)果分析 樣品測定：精密吸取1～9 號供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定HSYA、山奈素的含量，以HSYA 和山奈素的綜合評分為評價指標(biāo)。綜合評分[8]=（HSYA 含量/最高含量）×60+（山奈素/最高含量）×40。結(jié)果見表4 和表5。

結(jié)果分析：由直觀分析可知，各因素對酒洗紅花炮制工藝的影響順序為A＞C＞B，方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)因素A、C 有顯著性差異，B 無顯著性差異，其中A1＞A2＞A3，C3＞C2＞C1，綜合直觀分析及方差分析，選取酒洗紅花炮制工藝A1B1C1和A1B1C3，即加酒量為50%，浸吸時間30 min，烘干溫度40 ℃和加酒量為50%，浸吸時間30min，烘干溫度80 ℃進(jìn)行驗證，A1B1C1與A1B1C3中HSYA 和山奈素的含量見表6。

對A1B1C1和A1B1C3中HSYA、山奈素的含量進(jìn)行統(tǒng)計分析，HSYA P＞0．05，山奈素P＞0．05，表明HSYA 和山奈素在上述兩種工藝條件下，并無顯著性差異。依據(jù)藥典對藥材炮制的規(guī)定及節(jié)約節(jié)能的前提下，選取酒洗紅花最佳炮制工藝為A1B1C1，即加酒量為50%，浸吸時間30 min，烘干溫度40 ℃。

表4 正交實驗結(jié)果（n=2）

表5 綜合評分的方差分析表

表6 驗證實驗（n=2）%

4 紅花酒洗前后的比較研究

4.1 紅花酒洗前后的含量比較 將3 批紅花按照最優(yōu)酒洗工藝進(jìn)行炮制，按“2．1．3”項下供試品溶液方法制備供試品溶液，并分別按“2．1．1”項下色譜條件測定，計算含量，結(jié)果見表7。

由上表可知酒洗后，炮制品HSYA 與山奈素的含量較生品稍有偏低，但差異不大。

4.2 紅花酒洗前后指紋圖譜比較

4.2.1 色譜條件 色譜柱：InertSustainSwiftTMC185 μm（4．6 mm×250 mm）；流動相：乙腈-0．1%磷酸溶液；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；流速：1．0 mL/min；進(jìn)樣量：15 μL。

4.2.2 供試品溶液制備 分別取紅花生品和炮制品4 g，依照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》煎煮，分兩次煎煮，第1 次加水350 mL 煎煮45 min，第2 次加水300 mL 煎煮35 min，用300 目尼龍紗網(wǎng)布過濾，合并兩次濾液，定容至500 mL，吸取適量水煎液離心（10 000 r/min，10 min），取上清液，過0．45 μm濾膜，即得。

4.2.3 指紋圖譜比較結(jié)果 對比紅花酒洗前后的HPLC 指紋圖譜，見圖3。結(jié)果顯示，炮制后指紋圖譜中特征峰數(shù)目并無明顯變化。為了更直觀比較酒洗前后各成分含量的變化，篩選出峰面積≥2 的17 個峰，以5 號HSYA 峰為參照，取其峰面積為1，計算紅花炮制前后共有峰的相對峰面積，并將其以柱形圖的形式表示，結(jié)果見圖4。由圖看出，在230 nm 的波長下，1～6 號峰在酒洗前后峰面積變化不大；7 號峰在酒洗后峰面積反而明顯增加，8～17 號峰在酒洗后峰面積下降，其中以11、13、15 和16 號峰降低明顯。

5 討論

圖3 紅花酒洗前后水煎液指紋圖譜

圖4 生品和制品共有峰相對色譜峰面積比較

表7 3 批不同產(chǎn)地紅花藥材炮制品含量測定結(jié)果 %

酒洗紅花系古文獻(xiàn)記載的一種炮制方法，且酒制法在中藥炮制中為一種常用方法。紅花中含有黃酮類化合物、揮發(fā)油、紅花多糖、脂肪酸等化學(xué)成分，其中紅色素和黃色素是查爾酮類化合物，是紅花中含有的最主要的化學(xué)成分之一，具有改善心肌供血、擴張血管、抗凝血和抗血栓等功效[9-11]。本實驗遵循于此，按照酒洗炮制方法，篩選出紅花的最佳酒洗工藝為輔料黃酒50%，浸吸時間30min，烘干溫度40℃，其中溫度符合2015 版《中國藥典》對于藥材炮制烘干溫度的規(guī)定。

紅花在上述最佳條件酒洗之后，進(jìn)行多批次含量測定研究，結(jié)果顯示，HSYA 和山奈素含量較生品低，但含量差異均不大。查閱文獻(xiàn)得知[12-17]，這種變化可能與兩種成分的熱穩(wěn)定性有關(guān)，HSYA 是熱不穩(wěn)定性性成分，遇熱易分解，山奈素?zé)岵环€(wěn)定性相對HSYA 較好，但在40℃的烘干溫度下，兩者的變化均不明顯。同時，對紅花的生品和炮制品進(jìn)行水煎液指紋圖譜比較研究，其水煎液的制備依照《醫(yī)療機構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》煎煮，該工藝經(jīng)前期摸索，煎煮參數(shù)穩(wěn)定可行，且由于水煎液體積大，即使在煎煮中有微小誤差，不足以對其水煎液成分的含量產(chǎn)生影響，同時，通過多波長篩選，在230 nm下，紅花水煎液的指紋圖譜整體峰多、響應(yīng)值高，尤其小極性成分的響應(yīng)值整體高于其它波長下，因此，基于此對其進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)紅花在酒洗之后，大部分色譜峰峰面積有不同程度的降低，以小極性成分較明顯，可能在酒洗的過程中，小極性成分更易溶解在酒中，造成含量損失。雖然紅花經(jīng)酒洗后成分發(fā)生變化，但對其藥效問題，如可治療婦人月水不調(diào)等，還需進(jìn)一步深入研究。藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是成分，對于指標(biāo)性成分而言，酒洗炮制后HSYA 和山奈素的含量略有不同程度的降低，這兩種成分是藥典對紅花的指控指標(biāo)，酒洗炮制后，藥效是否有改變還需藥理實驗驗證，應(yīng)根據(jù)藥效結(jié)果合理的選擇酒洗炮制品的指標(biāo)，從而證明酒洗紅花臨床應(yīng)用的合理性。