清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠抗腫瘤作用與MARK 信號(hào)通路的關(guān)系*

溫利娟，薛曉鷗，米 鑫，謝 偉

（1．北京市順義區(qū)婦幼保健院，北京 101300；2．北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，在女性惡性腫瘤中排名第三，且85%以上新發(fā)及死亡病例出現(xiàn)在發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)是世界上宮頸癌高發(fā)國(guó)家，患病和死亡人數(shù)占全世界1/4[1]。目前，宮頸癌常用的西醫(yī)治療方法為手術(shù)治療和放療，輔助方法有化療[2]。在宮頸癌治療中，中醫(yī)藥治療尚不能替代手術(shù)、放療及化療等治療方法。但是在手術(shù)、放療、化療過(guò)程中，根據(jù)患者個(gè)體差異，采用望、聞、問(wèn)、切四診合參，辨證論治后用內(nèi)服外用的中醫(yī)治療方法以扶正祛邪，能夠穩(wěn)定瘤體，有利于術(shù)后患者恢復(fù)，提升患者自身免疫力，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，減輕患者在放化療過(guò)程中的毒副作用，以利于治療的順利進(jìn)行，有減毒增效之優(yōu)勢(shì)[3]。中醫(yī)學(xué)中并無(wú)宮頸癌病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)“癥瘕病”、“崩漏”、“帶下”等病范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的主要病機(jī)是正氣虛弱，邪毒客于子門，瘀結(jié)胞中?！扒鍩崂麧裢庵畏ā鼻捌谂R床及實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明：能改善陰道局部免疫微環(huán)境，上調(diào)HLA-I 和CD8 分子的表達(dá)而增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒免疫殺傷功能而起到抑制HR-HPV 作用[4-9]。

ERK 及P38 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員之一，ERK 家族有5 個(gè)亞族，包括ERK1-ERK5。其中ERK1 及ERK2 通路中的兩個(gè)重要成員之一；主要參與并調(diào)節(jié)了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂及死亡等多種生理過(guò)程，并且在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。ERK 及P38 在腫瘤發(fā)生發(fā)展和防治中起著重要的作用，是目前腫瘤研究的重要熱點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)研究清熱利濕法體外抗腫瘤作用及機(jī)制，測(cè)量腫瘤體積及體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率，HE 染色法觀察腫瘤的形態(tài)學(xué)變化，并運(yùn)用免疫組化方法，檢測(cè)瘤體中p-ERK 及p-p38 蛋白表達(dá)水平，研究清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用，進(jìn)一步揭示其抗腫瘤作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/c（nu/nu）裸小鼠35 只，雌性，5～6 周齡，體質(zhì)量SPF 級(jí)BALB/cnu/nu，購(gòu)于維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件：SPF 級(jí)BALB/c（nu/nu）裸小鼠均由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內(nèi)，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SCXK（京）2012-0001。實(shí)驗(yàn)室相對(duì)濕度為50%～70%，動(dòng)物室溫為（24±2）℃，采用12 h 晝夜間斷照明，水料自由飲用。

1.2 受試藥物 外用中藥方由百川飛虹技術(shù)有限公司生產(chǎn)，注射用順鉑購(gòu)自齊魯制藥有限公司，Anti-Human Papillomavirus 16（E7）antibody、Anti-ERK1+ERK2 antibody、Goat Anti-Rabbit IgG、Goat Anti-Mouse IgG、Anti-Human Papillomavirus 16（E6）+18（E6）antibody、Anti-Rb antibody、Anti-P53 antibody均購(gòu)自abcam，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中衫生物科技有限公司。

1.3 宮頸癌細(xì)胞株 宮頸癌Siha 細(xì)胞株，購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.4 主要儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司）；酶標(biāo)儀（Thermo 公司）；倒置顯微鏡（Nikon）；生物潔凈使用超凈臺(tái)（Opti MAIR）；低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；游標(biāo)卡尺（SYNTEK）；高精度電子稱重天平（Ei）。

2 方法

2.1 宮頸癌Siha 細(xì)胞懸液制備 宮頸癌Siha 細(xì)胞株復(fù)蘇后行細(xì)胞培養(yǎng)。培養(yǎng)條件是含10%胎牛血清、100mg/mL 鏈霉素和100 IU/m 青霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用2．5%胰酶消化，離心，棄上清。培養(yǎng)基懸浮沉淀細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度2×107/mL。

2.2 動(dòng)物與分組 35 只裸小鼠隨機(jī)分為清熱利濕外治法高劑量組、中劑量、低劑量、順鉑組、空白對(duì)照組。裸鼠購(gòu)買后，預(yù)先在室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)，觀察3 天。每只裸鼠用0．5 mL 注射器將0．2 mL 濃度為2×107/mL 的細(xì)胞懸液在無(wú)菌條件下皮下注射于裸鼠右前肢腋窩處皮下。在無(wú)特定病原體（SPF）環(huán)境飼養(yǎng)裸鼠，并觀察裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及腫瘤生長(zhǎng)情況，以皮下結(jié)節(jié)直徑＞0．5 cm 為成瘤標(biāo)準(zhǔn)。裸鼠成瘤后，將裸鼠稱重，用隨機(jī)數(shù)字表法分成5 組，每組7 只，進(jìn)行給藥。

2.3 各組給藥方法 ①外用中藥方高劑量組：0．942 8mg/kg；②中劑量組：0．471 4mg/kg；③低劑量組：0．235 7 g/kg；④順鉑組：濃度為5mg/kg，用量為0．5 mL，腹腔內(nèi)注射，每4 天1 次；⑤空白對(duì)照組：不用藥物觀察。清熱利濕外治法各組均使用無(wú)菌棉簽將藥物涂抹在裸鼠瘤體表面，每日一次。各組用藥和觀察時(shí)間均為4 周。

2.4 觀察指標(biāo) 每日觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、飲食、排便情況、皮下種植區(qū)外觀及觸感，每日用藥前測(cè)量裸鼠瘤體的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），測(cè)量裸鼠體質(zhì)量。治療過(guò)程中死亡裸鼠，均行解剖以明確死因。停藥24 小時(shí)后，用裸鼠頸椎脫臼法處死裸鼠，剝?nèi)×鼋M織，并瘤組織稱重、進(jìn)行體積測(cè)量，計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積（V）=ab2/2，抑瘤率=[（對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重）÷對(duì)照組平均瘤重]×100%。

2.5 HE 染色 1）二甲苯2 次去蠟處理，每次15 min。2）將切片進(jìn)行清洗：100%乙醇5 min 共2 次，80%乙醇5 min 1 次，蒸餾水5 min 1 次。3）蘇木精液染色5 min。4）流水沖洗5 min，1%鹽酸乙醇30 sec，水洗30 sec，蒸餾水過(guò)洗5 次。5）0．5%伊紅液染色3 min，蒸餾水稍洗30 sec，80%乙醇稍洗30 sec，95%乙醇1 min 2 次，無(wú)水乙醇3 min 2 次，二甲苯3 min 2 次。6）中性樹膠封固。

2.6 免疫組化SP 法 第一天：將切片放入37 ℃烘培箱內(nèi)30 min，取出后室溫放置10 min；脫蠟：將切片放入純二甲苯中脫蠟3 次，每次15 min；將切片放入100%酒精2 次，每次10 min；將切片放入90%酒精2 次，每次10 min；將切片放入80%酒精1 次，每次10 min；將切片放入70%酒精1 次，每次10 min；將切片放入蒸餾水中3 min；將切片放入PBS 中3 次，每次3 min；滅活：雙氧水直接滴加，室溫內(nèi)放置10 min；PBS 洗3 次，每次3 min；熱修復(fù)抗原：將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液中，大火煮沸3 min；室溫內(nèi)靜置2 h 直至完全冷卻，PBS 洗3 次，每次3 min；滴加5%BSA 封閉液，室溫放置20 min；滴加一抗，將切片放入濕盒中，4 ℃冷藏冰箱內(nèi)過(guò)夜。第二天：將濕盒從冰箱內(nèi)取出，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加二抗，室溫放置20 min，PBS 洗3 次，每次2 min；滴加SABC，室溫放置20min，PBS 洗4 次，每次5 min；DAB 室溫顯色，蒸餾水洗滌中止反應(yīng)，自來(lái)水沖洗30 min；⑤蘇木素輕度復(fù)染，40～45 s，自來(lái)水流水沖洗30 min 中止反應(yīng)；將切片放入70%酒精1 次10 min；80%酒精1 次10 min；將切片放入90%酒精2 次，每次10 min；將切片放入100%酒精2 次，每次10 min；封片：中性樹膠封片，要求膠少，無(wú)氣泡。

2.7 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化采用半定量法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，是根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例：隨機(jī)選擇5 個(gè)高倍視野，計(jì)算其中的陽(yáng)性細(xì)胞比例，然后評(píng)分，＜5%為0 分，5%～25%為1 分，25%-50%為2 分；50%～75%為3 分；＞75%為4 分。染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0 分，淺黃色或黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。蛋白表達(dá)水平=陽(yáng)性細(xì)胞比例×染色強(qiáng)度。光鏡下p-ERK 和p-p38 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜呈棕黃色，而細(xì)胞核不著色。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS 19．0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，瘤體生長(zhǎng)曲線采用重復(fù)測(cè)量方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，不同組間比較采用One-way ANOVA 分析，取P＜0．05 作為顯著性差異水平。

3 結(jié)果

3.1 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況 雌性裸鼠接種Siha細(xì)胞后，2 d 種植區(qū)皮膚呈白色改變，3～4 d 白色皮膚改變消失，5～6 d 種植區(qū)皮下可觸及2～3 mm 瘤樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地韌，7～8 d 種植區(qū)皮下可觸及直徑5 mm瘤樣結(jié)節(jié)，質(zhì)地稍硬。本實(shí)驗(yàn)35 只裸鼠成瘤率為100%。按裸鼠腫瘤體積大小隨機(jī)分5 組，每組7 只，治療前各組裸鼠平均體重?zé)o明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0．05）。

圖1 成瘤裸鼠

3.2 荷瘤裸鼠治療前后體質(zhì)量的變化 順鉑組裸鼠在用藥后一周均出現(xiàn)活動(dòng)量減少，厭食水，消瘦，皮膚干澀，其中2 只裸鼠分別在用藥第17、18 天死亡，死亡裸鼠解剖其肝、肺、腎臟后未見明顯異常，考慮為死亡為化療后毒副作用所致。其余各組一般狀況良好，未見藥物不良反應(yīng)。經(jīng)過(guò)4 周治療后，各組裸鼠平均體重：清熱利濕外治法高劑量組（18．83±0．76）g，清熱利濕外治法中劑量組（18．45±0．65）g，清熱利濕外治法低劑量組（18．72±0．82）g，順鉑組（13．51±0．31）g，對(duì)照組（19．26±0．82）g，順鉑組與其余各組相比，裸鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0．05），清熱利濕外治法3 個(gè)劑量組與空白對(duì)照組體質(zhì)量無(wú)明顯變化（P＞0．05），見表1。

3.3 各處理組裸鼠腫瘤體積變化 接種宮頸癌Siha 細(xì)胞后各組腫瘤體積均逐漸增大，對(duì)照組腫瘤體積增長(zhǎng)較快，各治療組移植瘤體積均小于對(duì)照組，其中清熱利濕外治法高、中劑量組及順鉑組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。清熱利濕外治法低劑量組腫瘤體積與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

3.4 各治療組裸鼠瘤重及腫瘤生長(zhǎng)抑制率的比較 順鉑組腫瘤生長(zhǎng)抑制率為75．82 3%，清熱利濕外治法低、中、高劑量組抑制裸鼠Siha 皮下移植瘤的抑制率分別為14．94%、31．24%、36．23%，見表1。在治療終點(diǎn)，順鉑組及紫柏凝膠高、中劑量組瘤重與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而清熱利濕外治法低劑量組瘤重與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），見表1。

表1 各組裸鼠質(zhì)量、瘤體積、瘤重、抑制率變化（）

表1 各組裸鼠質(zhì)量、瘤體積、瘤重、抑制率變化（）

組別 裸鼠質(zhì)量（g）瘤體積（cm3）瘤重（g）抑制率（%）外治法高劑量組 18．83±0．76 1．918±0．82# 1．727 5±0．63# 36．23外治法中劑量組 18．45±0．65 1．935±0．83# 1．813 1±0．74# 31．24外治法低劑量組 18．72±0．82 2．280±0．85 2．304 2±0．81 14．94順鉑組13．51±0．31 1．040±0．41# 0．655 0±0．14# 75．82空白對(duì)照組19．26±0．82 2．640±0．95 2．709 0±0．63

3.5 裸鼠移植瘤組織的病理學(xué)觀察 肉眼觀察各組裸鼠移植瘤組織呈結(jié)節(jié)狀，腫瘤組織血供明顯、豐富，組織切面呈魚肉樣，可見局灶性壞死，以順鉑組及外用中藥方高劑量治療組明顯。鏡下見各組腫瘤細(xì)胞呈圓形或卵圓形，腫瘤細(xì)胞核大且清晰，可見病理性核分裂，腫瘤細(xì)胞呈漩渦、簇團(tuán)狀生長(zhǎng)，瘤團(tuán)間可見壞死病灶形成，呈均質(zhì)紅染色樣，細(xì)胞變大，細(xì)胞核染色加深，見核固縮、溶解、碎裂。各治療組的腫瘤組織壞死區(qū)域均有增大，其中順鉑組壞死區(qū)域增大較為明顯。外用中藥方用藥組隨著治療劑量的增高，腫瘤組織壞死區(qū)域呈逐漸增大趨勢(shì)。

3.6 清熱利濕外治法對(duì)p-ERK 蛋白表達(dá)的影響 從表2 可見，各用藥治療組與空白對(duì)照組相比較，p-ERK 蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，其中外用中藥方高劑量組、中劑量組及順鉑組與空白對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。提示外用中藥方有下調(diào)p-ERK 蛋白表達(dá)的作用。

3.7 清熱利濕外治法對(duì)p-p38 蛋白表達(dá)的影響 從表2 可見，各用藥治療組與空白對(duì)照組相比較，p-p38 蛋白表達(dá)水平均有不同程度下降，其中外用中藥方高劑量組、中劑量組及順鉑組與空白對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。提示外用中藥方有下調(diào)p-p38 蛋白表達(dá)的作用。

圖2 各組裸鼠大體情況

圖3 各組裸鼠移植瘤組織病理學(xué)觀察（×200）

圖4 各組裸鼠移植瘤組織p-ERK 蛋白表達(dá)情況（×200）

圖5 各組裸鼠移植瘤組織p-p38 蛋白表達(dá)情況（×200）

表2 清熱利濕外治法對(duì)p-ERK、p-p38 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

清熱利濕外治法全方由紫草、金銀花、苦參、黃柏、百部、莪術(shù)、白芨等藥物組成，以上中藥采用水提、醇提法提取后，加用卡波姆等基質(zhì)制作而成，全方具有清熱祛濕、解毒活血、斂瘡生肌、殺蟲止癢之功效。該方由東直門醫(yī)院名老中醫(yī)郭志強(qiáng)教授創(chuàng)立，該方經(jīng)過(guò)前期部分臨床觀察，用于治療宮頸高危型HPV 感染，療效甚佳。前期清熱利濕體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果亦證實(shí)此法能抑制宮頸癌Siha 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其凋亡[10]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)人宮頸Siha 細(xì)胞癌的動(dòng)物研究，發(fā)現(xiàn)清熱利濕外治法降低了人宮頸Siha 細(xì)胞腫瘤的生長(zhǎng)。我們通過(guò)建立人宮頸癌Siha 細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型，研究高、中、低劑量的清熱利濕外治法治療腫瘤效果，實(shí)驗(yàn)中采用模型組作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞毒性藥物順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照比較，結(jié)果顯示清熱利濕外治法對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有抑制作用。高、中、低濃度組的清熱利濕外治法的腫瘤抑制率分別為36.23%、31.24%、14.94%，抑瘤效果呈劑量依賴性，隨之外治法治療劑量的增加，抑瘤效果增強(qiáng)。治療期間荷瘤裸鼠無(wú)進(jìn)食水量減少、消瘦、行動(dòng)遲緩等副反應(yīng)表現(xiàn)，顯示外治方藥物安全性高并無(wú)毒副作用。HE 染色病理檢查發(fā)現(xiàn)，隨著外治方治療劑量增加，瘤團(tuán)間的壞死灶比例增大。本研究結(jié)果顯示，外治法對(duì)宮頸癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。

ERK 及P38 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，參與并調(diào)節(jié)了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、分裂及死亡等多種生理過(guò)程，并且在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起著重要的作用。目前，ERK 及P38 是腫瘤發(fā)展和防治研究的重要熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清熱利濕外治法在一定劑量范圍內(nèi)可以下調(diào)p-ERK 及p-P38 蛋白表達(dá)水平，說(shuō)明清熱利濕外治法可以通過(guò)下調(diào)ERK/P38 MAPK 信號(hào)通路引起細(xì)胞周期阻滯進(jìn)而阻滯宮頸癌細(xì)胞增殖，且清熱利濕外治法對(duì)ERK/P38 MAPK 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)點(diǎn)應(yīng)該在上游，具體調(diào)節(jié)點(diǎn)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。