基于差示濃度法的遠(yuǎn)志及其炮制品中三種成分的分析*

朱美娟，李靈云，楊君君，楊 靜，柴欣，王躍飛

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

遠(yuǎn)志（Polygalae Radix） 為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd. 或卵葉遠(yuǎn)志 Polygala sibirica L.的干燥根。中國植物志記載遠(yuǎn)志多產(chǎn)東北、華北、西北和華中以及四川，現(xiàn)主產(chǎn)于山西、陜西[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是臨床常用中藥，性溫,味辛、苦,歸心、腎、脾經(jīng)，具有安神益智[2-3]、祛痰[1]、消腫[4]等功效。文獻(xiàn)報(bào)道遠(yuǎn)志生用有"戟人咽喉"的副作用，古籍有"若不去心，服之令人悶"的記載[5-6]，口服易引起惡心、嘔吐、眩暈等，因此遠(yuǎn)志多以炮制品入藥，遠(yuǎn)志炮制后可減緩其毒副作用，增強(qiáng)安神益智之功效[7]，臨床常用制遠(yuǎn)志（甘草制）、蜜（炙）遠(yuǎn)志[8-10]。

遠(yuǎn)志及其炮制品中，蜜遠(yuǎn)志較生遠(yuǎn)志色澤深，表皮有光澤，略沾手，生、蜜遠(yuǎn)志性狀差異較大易于區(qū)分。但制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志性狀差異較小，外形上不易判別，易于混淆，所以構(gòu)建制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志的鑒別方法對(duì)于臨床用藥的安全性和有效性意義重大[11-15]。遠(yuǎn)志主要化學(xué)成分為酮、寡糖、皂苷類等[16]，文獻(xiàn)多報(bào)道遠(yuǎn)志及其炮制品中遠(yuǎn)志酮Ⅲ（PXⅢ）[17-18]、3,6′-二芥子?；崽牵―ISS）[17,19]、細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷[17，20]、遠(yuǎn)志皂苷B[21-22]等含量測(cè)定方法。王丹丹[23]等構(gòu)建了遠(yuǎn)志指紋圖譜，共鑒定了37 個(gè)共有峰。但是，這些方法無法有效區(qū)分制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志。因此，有必要構(gòu)建一種能夠有效區(qū)分制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志的分析方法。

中藥中化學(xué)成分復(fù)雜，多個(gè)成分協(xié)同發(fā)揮疾病治療作用，單一成分無法有效、準(zhǔn)確的全面評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量。但是，中藥化學(xué)成分含量懸殊給中藥多成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)帶來困難，因此一般對(duì)中藥中的微量、痕量成分進(jìn)行富集以滿足定量分析的要求。文獻(xiàn)報(bào)道常采用柱切換程序進(jìn)樣技術(shù)解決含量懸殊成分的檢測(cè)問題，通過控制進(jìn)樣量，在線富集含量較低的成分，選擇性地將目標(biāo)分析物通過富集后定量引入分析系統(tǒng)中,盡可能去除中藥中其他共存化合物的干擾，達(dá)到檢測(cè)痕量、微量成分的目的[24]。但前處理凈化富集操作復(fù)雜，柱切換技術(shù)對(duì)設(shè)備、流動(dòng)相等提出更高要求，不利于推廣應(yīng)用。因此，需進(jìn)一步開發(fā)更加簡(jiǎn)單、高效的含量懸殊成分同時(shí)測(cè)定方法，為中藥多成分，特別是含量懸殊成分的測(cè)定提供方法支持。

本研究以PXⅢ、DISS、甘草酸（GA）為指標(biāo)成分，針對(duì)制遠(yuǎn)志中的PXⅢ、DISS 與甘草中的GA 含量差別較大的特點(diǎn)，為提高檢測(cè)準(zhǔn)確性，構(gòu)建了差示濃度分析法，制備高濃度供試品溶液以檢測(cè)低含量成分（GA），高濃度樣品稀釋后獲得低濃度供試品溶液以檢測(cè)高含量成分（PXⅢ、DISS），通過“一樣多測(cè)”有效解決了含量差別較大成分的同時(shí)檢測(cè)問題。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀：Waters ACQUITYTMUPLC 系統(tǒng)（美國沃特世公司）；XS 205 型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司），AL 204 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SCIENTZ SB25-12DTN 型超聲波清洗器（寧波新芝生物有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；TGL-16C 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q 型超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）。

1.2 藥品與試劑 甘草酸銨（110731-201619，購自中國食品藥品檢定研究院，純度為98%），DISS（P04A7F18932，購自上海源葉生物科技有限公司，純度為98%），PXⅢ（R02A8F41025，購自上海源葉生物科技有限公司，純度92．0%）；甲醇、甲酸均為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水；遠(yuǎn)志生品（S1～S5）、制遠(yuǎn)志（Z1～Z10）、蜜遠(yuǎn)志（M1～M3）均購自亳州市藥材市場(chǎng)。含量測(cè)定方法學(xué)研究用制遠(yuǎn)志（Z0）是參照2015 年版《中華人民共和國藥典》制遠(yuǎn)志炮制方法炮制，所用遠(yuǎn)志（S0）產(chǎn)地山西，經(jīng)鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd．的干燥根，炮制所用的甘草、生遠(yuǎn)志均購自河北春開制藥股份有限公司。

制遠(yuǎn)志的炮制：參照2015 版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的制遠(yuǎn)志炮制方法。取生遠(yuǎn)志，按照遠(yuǎn)志∶甘草（100∶6）加入適量甘草水煎液，文火煮至吸盡湯汁，取出平鋪，置烘箱干燥，放涼，即得。制遠(yuǎn)志中水分應(yīng)＜12%[17]。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（2．1 mm×100 mm，1．7 μm）；進(jìn)樣量2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)320、237 nm；柱溫60 ℃；以甲醇（A）-0．1%甲酸水（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～6 min，5%～33%A；6～7 min，33%～33%A；7 ～7．5 min，33%～41%A；7．5 ～10 min，41%～46．7%A；10～11 min，46．7%～55%A；11～16 min，55%～70%A；16～20 min，70%～95%A），流速0．3 mL/min。

取混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇逐級(jí)稀釋成2、4、8、16、32、64 倍的一系列混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取遠(yuǎn)志粉末0．5 g，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加75%甲醇適量，密塞，超聲處理30 min，放冷，75%甲醇定容至刻度，搖勻，14000 rpm 離心10 min，取上清液，備用，供檢測(cè)GA用（高濃度）。

取上述供試品溶液1 mL 于5 mL 容量瓶中，加30%甲醇水溶液定容，搖勻，備用，供測(cè)定PXⅢ、DISS 用（低濃度）。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系考察 按“2．1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定“2．2”項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液（PXⅢ濃度為73．35、36．68、18．34、9．17、4．58、2．29、1．15μg/mL；DISS 濃 度 為 258．02、129．01、64．51、32．25、16．13、8．06、4．03 μg/mL；GA 濃 度 為157．07、78．53、39．27、19．63、9．82、4．91、2．45 μg/mL），平行進(jìn)樣2 次，以對(duì)照品濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比S/N=3 為檢測(cè)限（LOD）、S/N=10 為定量限（LOQ），結(jié)果如表1。遠(yuǎn)志中PXⅢ、DISS、GA 在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)r 均大于0．999。

表1 制遠(yuǎn)志各指標(biāo)成分線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限

2.4.2 精密度試驗(yàn) 按“2．3”項(xiàng)下方法制備制遠(yuǎn)志供試品溶液，以“2．1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，連續(xù)測(cè)定三天，計(jì)算其RSD 值，考察該方法日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明，該方法的日內(nèi)精密度RSD 值均小于1．9%，日間精密度RSD 均小于1．4%，該方法精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2．3”項(xiàng)下方法制備制遠(yuǎn)志供試品溶液，平行制備6 份，采用“2．1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，制遠(yuǎn)志中PXⅢ、DISS、GA 含量分別為2．183 7、7．737 8、0．600 8mg/g（RSD 值均小于2．1%）。結(jié)果表明，該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2．3”項(xiàng)下方法制備制遠(yuǎn)志供試品溶液，采用“2．1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進(jìn)樣測(cè)定，指標(biāo)成分RSD 值均小于0．66%。結(jié)果表明，供試品溶液中PXⅢ、DISS、GA 在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取制遠(yuǎn)志粉末0．25 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入與樣品中各成分質(zhì)量相當(dāng)?shù)闹笜?biāo)成分的對(duì)照品溶液，按“2．3”項(xiàng)下方法制備制遠(yuǎn)志供試品溶液，平行6 份，以“2．1”項(xiàng)下方法平行測(cè)定2 次，PXⅢ、DISS、GA 的加樣回收率均值分別為103．2%、102．7%、97．5%，RSD 均小于2．2%，結(jié)果如表2 所示，表明各化合物加樣回收率良好，方法準(zhǔn)確可行。

2.5 遠(yuǎn)志及其炮制品中PXⅢ、DISS、GA 的含量測(cè)定 取不同批次的遠(yuǎn)志（S1～S5）、制遠(yuǎn)志（Z1～Z10）、蜜遠(yuǎn)志（M1～M3）飲片，粉碎，按“2．3”項(xiàng)下方法制備制遠(yuǎn)志供試品溶液，以“2．1”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，生遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志的高低濃度供試品溶液色譜圖如圖1 所示。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

圖1 制遠(yuǎn)志（A1 低濃度，A2 高濃度）、生遠(yuǎn)志（B1 低濃度，B2 高濃度）、蜜遠(yuǎn)志（C1 低濃度，C2 高濃度）、甘草汁（D）、混合對(duì)照品（E）色譜圖

采用差示濃度法測(cè)定了不同批次的遠(yuǎn)志、制遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志中PXⅢ、DISS、GA 的含量，結(jié)果如圖2所示。生遠(yuǎn)志中PXⅢ和DISS 含量分別為0．8131～1．7168、4．7333～6．4498mg/g；生 遠(yuǎn) 志 中未 檢 測(cè) 到GA。制遠(yuǎn)志中PXⅢ、DISS、GA 含量分別為0．8122～1．9539、2．1834～6．5732、0．1210～0．4313mg/g。蜜遠(yuǎn)志中PXⅢ、DISS 含量分別為0．8104～0．8535、2．6710～6．5144mg/g，未檢測(cè)到GA。因此，GA 可以作為標(biāo)志物區(qū)分制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志。

3 討論

圖2 不同批次遠(yuǎn)志及其炮制品中PXⅢ、DISS、GA 的含量

制遠(yuǎn)志供試品溶液制備方法的優(yōu)化：以PXⅢ、DISS、GA 含量為指標(biāo)，系統(tǒng)考察了提取溶劑（50%甲醇水、75%甲醇水、甲醇）、提取時(shí)間（20 min、30 min、40 min）和料液比（1∶25、1∶50、1∶100）對(duì)指標(biāo)成分提取效率的影響，結(jié)果如圖3 所示，超聲提取30 min、40 min 結(jié)果無明顯差別，優(yōu)于20 min 的提取結(jié)果，為節(jié)約時(shí)間成本，選擇超聲處理30 min；料液比對(duì)制遠(yuǎn)志指標(biāo)成分提取效率影響較小；75%甲醇水作為提取溶劑優(yōu)于50%甲醇水和100%甲醇，提取效率略高。最終確定供試品溶液制備方法（如“2．3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法所示）。

圖3 制遠(yuǎn)志供試品制備方法的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)“2．5”項(xiàng)下各批次指標(biāo)成分含量測(cè)定的結(jié)果，10 批制遠(yuǎn)志中，制遠(yuǎn)志DISS 含量約為GA 含量的14．81～32．30 倍，指標(biāo)成分含量懸殊，難以同時(shí)測(cè)定，本研究構(gòu)建的差示濃度法通過供試品溶液的梯度稀釋，從而實(shí)現(xiàn)含量懸殊成分的同時(shí)檢測(cè)，既可節(jié)省對(duì)照品，又能減少測(cè)定誤差，驗(yàn)證了建立的“差示濃度法”的必要性、實(shí)用性。該方法具有操作簡(jiǎn)單、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可以根據(jù)樣品含量的分布情況自主決定稀釋倍數(shù)和稀釋次數(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可以有效解決指標(biāo)成分DISS、GA 含量懸殊成分同時(shí)檢測(cè)的問題。同時(shí)，GA 作為標(biāo)志物實(shí)現(xiàn)了制遠(yuǎn)志與生遠(yuǎn)志、蜜遠(yuǎn)志的區(qū)分。