銅綠假單胞菌及其耐藥基因PCR檢測與耐藥機(jī)制

馮禮尚

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471023）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱綠膿桿菌，專性需氧，是一種常見的條件致病菌，易引起免疫力低下的人群以及燒傷、外傷、眼角膜和外耳道等部位的感染，甚至引起敗血癥，是醫(yī)院感染常見的病原菌，也是各種動物的致病菌。該菌分布廣泛、抗性強(qiáng)、耐營養(yǎng)貧乏，能在純凈水中長期存活，易形成生物膜（Biofilms，BF），產(chǎn)生多藥耐藥性，是醫(yī)學(xué)難治性病原菌之一。因此，就銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制與耐藥基因轉(zhuǎn)移傳播的途徑以及擴(kuò)增DNA的多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)在PA菌株及其耐藥基因檢測研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 菌種檢測與菌株鑒定

1.1 菌種檢測

利用常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)法檢測環(huán)境中PA菌，較為耗時費(fèi)力，而用PCR方法可以在較短時間內(nèi)得出檢測結(jié)果。在病原菌感染性疾病的診斷中需要及時精準(zhǔn)地確定致病菌的種類和株型以便有針對性地用藥。PCR檢測方法具有特異、敏感、快速的優(yōu)點，用于菌種檢測和臨床診斷更具有實用價值。張偉等[1]采用直接PCR方法擴(kuò)增檢測PA菌的外毒素A（ETA）基因，在4 h內(nèi)得出結(jié)果。張淑紅等[2]應(yīng)用常規(guī)PCR法檢測PA外膜蛋白基因oprL用時少于24 h，優(yōu)于菌株的平板培養(yǎng)法。楊滴等[3]用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測PA的ETA基因，其特異性和靈敏性都很高，其方法可用于食品中PA的快速檢測和鑒定。吳炳坤等[4]應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄熒光PCR（RT-PCR）法檢測PA活菌，利用的是PA的DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrB基因序列。這4種PCR方法檢測的DNA序列都是PA特異的，其核心是設(shè)計合成特異性引物用于PA菌獨特DNA序列的擴(kuò)增，然后用凝膠電泳檢測擴(kuò)增的DNA。環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是常規(guī)PCR的改進(jìn)，用于DNA檢測具有很大的優(yōu)勢。劉偉等[5]采用LAMP法檢測PA菌ETA基因獲得了很好的檢測效果。李羽翡[6]等用LAMP法檢測PA，從基因組提取到檢測報告只用了100 min，達(dá)到快速檢測目的。由常規(guī)PCR技術(shù)衍生的常用于菌種分類、菌株檢測和鑒定的PCR方法有巢式PCR、菌落PCR、隨機(jī)引物PCR、通用PCR和多重PCR等，這些方法都需要根據(jù)菌種或菌株特有的已知基因DNA序列設(shè)計適宜的引物并對PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化才能有效擴(kuò)增目的基因，達(dá)到檢測目的。

1.2 基因分型與菌株鑒定

按照生化和遺傳性質(zhì)的不同標(biāo)準(zhǔn)，PA可分成許多不同的株型，每一種株型具有其特定的基因型。不同的耐藥菌株所含的耐藥基因及其耐藥機(jī)制不同，臨床需要根據(jù)耐藥分型選擇有效的抗菌藥，菌株耐藥基因型與耐藥機(jī)制的檢測分析是其用藥的前提。PCR技術(shù)是當(dāng)前檢測PA耐藥基因并分析基因表達(dá)活性與耐藥機(jī)制的有效方法[7-8]。不同菌株的傳染性、致病性與流行特點不同，需要區(qū)別對待。PCR技術(shù)適用于PA菌株分子流行病學(xué)特點的調(diào)查研究，評價感染的治療效果[9]。檢測耐藥基因表達(dá)的PCR方法有反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、qPCR、原位PCR等；檢測基因變異的PCR方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)PCR（SSCP-PCR）、限制性片段長度多態(tài)性PCR（RFLP-PCR）、隨機(jī)引物多態(tài)PCR（也稱任意引物PCR，AP-PCR）[10-11]、mRNA差異顯示PCR（DD-PCR）等。

2 耐藥基因檢測與耐藥機(jī)制分析

銅綠假單胞菌（PA）包含細(xì)菌所有的6種類型的耐藥機(jī)制，包括抗菌藥滅活酶的產(chǎn)生、藥物作用靶點結(jié)構(gòu)變異、細(xì)胞壁外膜通透性降低、細(xì)胞膜表面形成主動外排泵系統(tǒng)、形成生物膜屏障、不良環(huán)境導(dǎo)致的適應(yīng)性耐藥等。

2.1 PA產(chǎn)生抗菌藥滅活酶

抗菌藥滅活酶有兩種：（1）水解酶，如β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase，BLA），水解β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致青霉素類、頭霉素類、碳青霉烯類失活；（2）鈍化酶，即修飾酶，通過化學(xué)修飾使抗菌藥失活。氨基糖苷類抗生素的修飾酶包括乙酰轉(zhuǎn)移酶（acetylase，AAC）、核苷化酶（nucleotidylase，ANT）、腺苷化酶（adenylase，AAD）和磷酸化酶（phosphorylase，APH）。PA菌的修飾酶基因、頭孢菌素酶基因在染色體上，而廣譜和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因由質(zhì)粒攜帶。β-內(nèi)酰胺酶類有多種。（1）AmpC類：由染色體基因編碼，屬于誘導(dǎo)酶，在菌體不接觸β-內(nèi)酰胺類抗生素時只產(chǎn)生少量的酶，反之酶產(chǎn)量會增加[12]。（2）超廣譜類：根據(jù)分子結(jié)構(gòu)及來源，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum β-lactamases，ESBLs） 分 為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他類型5類，PA菌主要攜帶SHV型、OXA型及其他類型中的PER型和VEB1型酶[13-15]。（3）金屬β-內(nèi)酰胺酶：簡稱金屬酶，廣泛水解各類β-內(nèi)酰胺類抗生素，結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制多樣化，其介導(dǎo)的耐藥性難以對付。PA的主要金屬酶種類有IMP型、VIM型和NDM-1型等。每一型的酶又由于基因突變導(dǎo)致其活性和底物不同[16-17]。（4）碳青霉烯類酶：不僅水解碳青霉烯類抗菌藥，還水解其他種類的β-內(nèi)酰胺類抗生素[18-19]。

PA也通過滅活酶對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進(jìn)行修飾和水解，但事實是PA對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素天然耐藥。

2.2 抗菌藥作用靶點發(fā)生變異

藥物作用靶點的變異有多種形式。（1）結(jié)構(gòu)基因突變導(dǎo)致抗菌藥的作用靶點變異，影響與抗菌藥的結(jié)合作用。例如青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）、拓?fù)洚悩?gòu)酶、核糖體蛋白、16S rRNA等生物大分子的抗菌藥靶點發(fā)生變異將導(dǎo)致抗菌藥失效[20]。DNA旋轉(zhuǎn)酶的GyrA亞基氨基酸序列變異會引起喹諾酮類耐藥[21]；核糖體50s亞基蛋白的變異將導(dǎo)致對大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性。青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）結(jié)構(gòu)變異使β-內(nèi)酰胺類抗生素被耐藥。（2）可移動遺傳因子使外源的與藥靶蛋白同源同型的基因轉(zhuǎn)移到菌細(xì)胞內(nèi)并發(fā)生基因重組產(chǎn)生嵌合基因，表達(dá)的嵌合蛋白功能正常但失去了與抗菌藥的結(jié)合作用。（3）抗菌藥作用靶蛋白的過度表達(dá)補(bǔ)償了被藥物抑制的靶蛋白而表現(xiàn)耐藥性。（4）抗菌藥作用靶點被酶修飾而阻止抗菌藥作用。PA產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶，使16S rRNA的不同位點甲基化，阻礙氨基糖苷類抗生素的抗菌作用。（5）細(xì)菌攝入外源抗藥基因并取代本有的非耐藥基因。PBP2a是PBP2的突變體，失去與青霉素類的結(jié)合作用，但仍具有肽聚糖合成的轉(zhuǎn)肽酶活性。（6）靶位保護(hù)作用，即細(xì)菌產(chǎn)生與抗菌藥靶點相結(jié)合的保護(hù)蛋白，屏蔽抗菌藥作用。

2.3 細(xì)菌細(xì)胞壁外膜通透性降低而阻止抗菌藥滲入

很多抗菌藥難以透過PA細(xì)胞壁外膜而形成固有耐藥性。四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、多肽類、托達(dá)霉素、利福霉素類、磺胺類、硝基呋喃類和硝基咪唑類對PA沒有抗菌作用，表現(xiàn)出天然耐藥[22]。外膜孔蛋白（Outer membrane porin，Omp）是大部分內(nèi)酰胺類抗生素和喹諾酮類進(jìn)入細(xì)胞的唯一通道，Omp蛋白發(fā)生變異將阻塞通道而耐多藥。且很多β-內(nèi)酰胺類廣譜抗菌藥不能透過PA外膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而形成固有耐藥性。外膜孔蛋白OprD是氨基酸進(jìn)入細(xì)胞的通道，其中OprD2是亞胺培南進(jìn)入細(xì)胞的唯一通道[23-24]，其變異常引起亞胺培南耐藥菌株。氨基糖苷類抗生素通過細(xì)菌細(xì)胞膜寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)，如果寡肽結(jié)合蛋白（oligopeptide binding protein，OBP）發(fā)生變異或減少，細(xì)菌就產(chǎn)生耐藥性。總之，對于PA有效的抗菌藥只有部分β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素。

2.4 主動外排泵系統(tǒng)導(dǎo)致細(xì)菌的多重耐藥性

細(xì)菌細(xì)胞膜表面的外排泵系統(tǒng)能夠主動排出細(xì)胞內(nèi)的有害物質(zhì)，包括抗菌藥、消毒劑、重金屬離子等[25-26]。PA的主動外排泵系統(tǒng)（Active efflux pump system，AEPS）是其多重耐藥的主要機(jī)制，能外排細(xì)胞內(nèi)的多種抗菌藥。PA有4種外排泵系統(tǒng)：（1）MexAB-OprM（或?qū)懽鱉exA-MexB-OprM）介導(dǎo)對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥[27]；（2）MexCD-OprJ介導(dǎo)對四環(huán)素、氯霉素、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、結(jié)晶紫及第4代頭孢菌素的多重耐藥；（3）MexEF-OprN系統(tǒng)能夠外排碳青霉烯類抗生素；（4）MexXY-OprM系統(tǒng)介導(dǎo)對氨基糖苷類、喹諾酮類及氯霉素的耐藥。外排泵系統(tǒng)結(jié)構(gòu)特點：MexA、MexC、MexE、MexX是膜融合蛋白，位于周質(zhì)間隙，連結(jié)外膜蛋白（OMP）與轉(zhuǎn)運(yùn)子；MexB、MexD、MexF、MexY是轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白，鑲嵌在細(xì)菌細(xì)胞膜中，利用跨膜質(zhì)子電化學(xué)勢向外排出抗菌藥等有害物質(zhì)；OprM、OprJ、OprN是外膜通道蛋白[28]。

2.5 生物膜的屏障作用

PA極易形成BF，使之產(chǎn)生泛耐藥性[29]。生物膜耐藥機(jī)制為：（1）BF成為滲透屏障，阻止抗菌藥進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；（2）BF微環(huán)境變化，如營養(yǎng)和氧缺乏、代謝廢物堆積、pH值、滲透壓等不良影響，使細(xì)菌處于休眠或非生長狀態(tài)，對抗菌藥失敏而耐藥[30-31]。

2.6 適應(yīng)性耐藥

適應(yīng)不良環(huán)境變化的細(xì)菌處于非生長的休眠狀態(tài)，這時細(xì)菌的各種生理生化過程停滯，生物大分子的功能關(guān)閉，不易受到有害因子的影響和損傷，這時細(xì)菌產(chǎn)生的耐藥性就屬于適應(yīng)性耐藥。在臨床上一些頑固性致病菌潛伏在體內(nèi)，難以根治，在適宜的條件下恢復(fù)活性而又致病[32-33]。

3 耐藥性基因的轉(zhuǎn)移與傳播檢測

細(xì)菌耐藥性（Bacterial Resistance）是指細(xì)菌產(chǎn)生的對抗菌藥物不敏感的現(xiàn)象，也稱抗藥性。耐藥性分為固有耐藥性（Intrinsic resistance）和獲得性耐藥性（Acquired resistance）。前者又稱天然耐藥性，是細(xì)菌本有的抗藥性，由細(xì)菌染色體遺傳，PA對多種抗菌藥產(chǎn)生的耐藥性屬于固有耐藥性，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素由于其脂溶性和大分子結(jié)構(gòu)而不能通過細(xì)胞壁外膜而滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。獲得性耐藥是由可移動的遺傳因子質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子和整合子等介導(dǎo)的在不同菌株或種屬間傳播的耐藥性[34]。

3.1 染色體介導(dǎo)的耐藥基因檢測

銅綠假單胞菌（PA）細(xì)胞內(nèi)含有一條閉合環(huán)狀的細(xì)菌染色體，上面攜帶有許多耐藥基因，這些基因原本是PA有關(guān)生理生化的必需基因，經(jīng)歷突變的演化后就表現(xiàn)出耐藥性。有些染色體耐藥基因是通過轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)運(yùn)與整合子的捕獲取得的，還有些是噬菌體整合的。PA主動外排泵系統(tǒng)基因、DNA促旋酶基因gyrA、gyrB都在染色體上[35]。PA的MexABOprM外排泵系統(tǒng)作用底物廣泛，如果泵蛋白基因表達(dá)增強(qiáng)，生成更多的外排泵，促進(jìn)藥物的排出，其耐藥性就增大。細(xì)菌外排泵排泄細(xì)胞內(nèi)的代謝廢物，同樣外排外來的藥物，是產(chǎn)生多藥耐藥的主要原因。DNA促旋酶的gyrA基因在第83位的絲氨酸和87位的天冬氨酸發(fā)生變異，就會使喹諾酮類抗菌藥與促旋酶GyrA的親和力降低而產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌染色體的各種基因突變都能使基因編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生變異，以致影響細(xì)菌對抗菌藥物的通透性、與藥靶結(jié)合的親合性、外排泵的開放度、修飾酶的活性等。PA細(xì)胞壁外膜的通透性很低，這是其泛耐藥（XDR）的又一個主要原因。PA的外膜有一種特殊的孔蛋白OprD2，是攝取氨基酸和其他營養(yǎng)成分的通道，只對亞胺培南有透過性，一旦OprD2變異，關(guān)閉了通道，就表現(xiàn)出對亞胺培南的耐藥性[36]。

3.2 質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因的轉(zhuǎn)移與傳播檢測

質(zhì)粒（Plasmid）是細(xì)菌染色體外遺傳物質(zhì)，環(huán)狀閉合的雙鏈DNA分子，具有自主復(fù)制功能，所攜帶的遺傳信息能賦予其宿主菌某些生物性狀。根據(jù)質(zhì)?；虻闹饕飳W(xué)功能，把質(zhì)粒分為致育質(zhì)粒（F質(zhì)粒，F(xiàn)ertility Plasmid）、耐藥質(zhì)粒（R質(zhì)粒，Resistance plasmid）、毒力質(zhì)粒（Vi質(zhì)粒，Virulance plasmid）、細(xì)菌素質(zhì)粒和代謝質(zhì)粒等。R質(zhì)粒存在于G+菌與G_菌，由耐藥傳遞因子（Resistance transfer factor，RTF）和耐藥決定因子（Resistance determinant factor，RDF）序列兩部分組成。前者編碼性菌毛，決定自主復(fù)制和接合轉(zhuǎn)移；后者賦予宿主抗藥性，含有多個轉(zhuǎn)座子（Tn）或耐藥基因盒（Resistance gene cassettes），構(gòu)成一個耐多藥基因復(fù)合體。整個自然界是一個耐藥基因的儲藏庫，含有豐富多樣的耐藥基因，而多重耐藥的沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌和陰溝腸桿菌等革蘭陰性桿菌大量存在于人的腸道中，構(gòu)成了一個耐藥基因庫。PA染色體耐藥基因的產(chǎn)生源于質(zhì)粒在細(xì)菌之間的轉(zhuǎn)移以及質(zhì)粒DNA與細(xì)菌染色體之間的交換重組。R質(zhì)粒能夠在同種屬或不同種屬的細(xì)菌間轉(zhuǎn)移，造成耐藥基因的廣泛傳播[37]。用PCR方法可以分析PA菌R質(zhì)粒耐藥基因的來源與傳播[38-39]。

3.3 噬菌體介導(dǎo)的耐藥基因的傳播與檢測

噬菌體（Bacteriophage或phage）是感染細(xì)菌、放線菌和螺旋體等原核生物的病毒，只能在活的宿主菌細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。噬菌體感染細(xì)菌后其基因組（一條雙鏈DNA分子）整合入細(xì)菌染色體并隨之復(fù)制擴(kuò)增（噬菌體的溶源化），在復(fù)制錯誤或環(huán)境影響下，溶源化的噬菌體會脫離細(xì)菌染色體并攜帶細(xì)菌染色體的一些基因組裝成新一代的噬菌體粒子，去感染其他的細(xì)菌，這個過程就叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction）。轉(zhuǎn)導(dǎo)就是噬菌體把一個細(xì)菌的DNA轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)菌染色體的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點是能夠轉(zhuǎn)移比轉(zhuǎn)化作用更大的DNA片段，轉(zhuǎn)移效率高，但轉(zhuǎn)導(dǎo)具有宿主菌的特異性，轉(zhuǎn)導(dǎo)的耐藥基因只能在同種細(xì)菌間轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)座子和整合子中的基因也可經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)移[40]。

轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)所介導(dǎo)的R質(zhì)粒耐藥基因的轉(zhuǎn)移利用的是DNA之間的同源重組，而轉(zhuǎn)座子和整合子則進(jìn)行非同源的基因插入或切除與重組。

3.4 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移與檢測

轉(zhuǎn)座子（Transposon，Tn）是一類基因組中可獨立移動的DNA片段，能夠在細(xì)菌染色體、質(zhì)?；蚴删w之間自行插入或切離，又稱跳躍基因（Jumping gene）。Tn不能獨立復(fù)制，必須依賴所在染色體、質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制而復(fù)制。插入序列（Insertion Sequence，IS）為序列較短的轉(zhuǎn)座子，長度不超過2 kb，只編碼一種轉(zhuǎn)座酶，其生物學(xué)作用有：（1）作為細(xì)菌正常基因的調(diào)控開關(guān)；（2）介導(dǎo)F質(zhì)粒的同源重組并插入到細(xì)菌染色體成為高頻重組菌株；（3）作為噬菌體基因的組分。另一類序列長度在2～8 kb的大轉(zhuǎn)座子，除攜帶與轉(zhuǎn)座有關(guān)的基因序列還包含其他功能的基因，如耐藥基因、重金屬抗性基因、腸毒素基因、糖發(fā)酵基因等，這類轉(zhuǎn)座子常稱為轉(zhuǎn)座子（Tn），與IS相區(qū)別。Tn兩端各具有一段反向重復(fù)序列（Inverted repeat，IR），具有特異位點插入功能；其中間序列編碼轉(zhuǎn)座酶、抗藥因子和毒力因子等。Tn轉(zhuǎn)座將引起被插入基因的突變，并引入一個或多個抗藥基因。Tn攜帶的抗藥基因在細(xì)菌染色體和質(zhì)粒之間或質(zhì)粒之間轉(zhuǎn)移，且不需要基因間的同源配對[41]。Tn宿主廣泛，可使耐藥基因在G+菌與G-菌之間廣泛轉(zhuǎn)移和傳播。常見的攜帶耐藥基因的轉(zhuǎn)座子如Tn1、Tn2、Tn3攜帶Ap（氨芐西林）耐藥基因；Tn4具有Ap、strSM（鏈霉素）、SU（磺胺）、Hg2+、Ble（博來霉素）的耐藥基因；Tn5、Tn6、Tn681含有Kan（卡那霉素）耐藥基因；Tn7攜帶TMP（甲氧芐氨嘧啶）、str的抗藥基因；Tn9具有Cam（氯霉素）耐藥基因；Tn10具有Tet（四環(huán)素）耐藥基因；Tn551、Tn903攜帶Em（紅霉素）耐藥基因[42]。

3.5 基因盒-整合子系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移和傳播

整合子（Integron）是一段具有獨特結(jié)構(gòu)和獨立功能的基因組序列。一個整合子由5’保守端（5’-conserved segment，5’-CS）、3’ 保 守 端（3’-CS）和二者之間的可變區(qū)（Variable region）3部分組成。5’-CS是整合子的基本結(jié)構(gòu)，包括整合酶基因（Integron integrase，intI）、附著位點（attI）和啟動子（P）。3’-CS的結(jié)構(gòu)序列因整合子的種類不同而變化?？勺儏^(qū)是基因的移動區(qū)，能夠捕獲不同種類和數(shù)量的基因盒?；蚝校℅ene cassette）是一個開放閱讀框（ORF），能被整合酶（IntI）整合到整合子或從整合子切除的可移動基因單元。在G-菌中，許多抗菌藥基因以基因盒的形式存在于整合子的可變區(qū)。基因盒與整合子構(gòu)成了細(xì)菌基因組中基因克隆與表達(dá)的完整結(jié)構(gòu)，稱作基因盒-整合子系統(tǒng)，能夠攜帶多個不同的耐藥基因盒。整合子自身無移動性，常整合在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體或細(xì)菌染色體上，捕獲耐藥基因盒。根據(jù)整合子的移動性，將其分為兩類：（1）移動性整合子（Mobile integron），又叫抗性整合子（Resistance integron，RI），即插入在細(xì)菌可移動遺傳因子（質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子與噬菌體等）上的整合子，攜帶的基因盒多與抗藥性有關(guān)，主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類整合子。（2）超級整合子（Super integron，SI），又稱染色體整合子（Chromosomal integron，CI），是整合在細(xì)菌染色體上的整合子，除了抗藥基因盒，還攜帶毒素、血凝素、脂蛋白等致病基因。CI隨細(xì)菌的繁殖垂直傳遞基因盒基因，主要是Ⅳ類整合子。PA基因組包含Ⅰ、Ⅲ類整合子，Ⅰ類整合子攜帶多種耐藥基因盒，包括β-內(nèi)酰胺酶、喹諾酮類（qnr）、甲氧芐啶、廣譜氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、氯霉素類和四環(huán)素類等抗生素的耐藥基因盒，從而產(chǎn)生耐多藥性。Ⅲ類整合子只攜帶抗碳青霉烯類的β-內(nèi)酰胺酶blaIMP基因。整合子通過捕獲多個耐藥基因盒使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥性（Multi-drug-Resistance），是臨床多重耐藥株出現(xiàn)的主要原因[43-44]。

3.6 細(xì)菌通過轉(zhuǎn)化吸取耐藥基因

轉(zhuǎn)化（Transformation）是指細(xì)菌從環(huán)境中攝入DNA序列并經(jīng)過重組整合進(jìn)細(xì)菌染色體的過程。自然界遍布死亡破碎的細(xì)菌細(xì)胞，釋放出大量斷裂的DNA序列分子，其中包含抗藥基因，易被其他活細(xì)菌攝取。PA菌的細(xì)胞壁外膜極其嚴(yán)密和閉封，不易被DNA分子透過，但當(dāng)其進(jìn)行細(xì)胞分裂等活動處于敏感狀態(tài)時就容易攝入抗藥基因，再通過同源重組整合入其基因組[45]。

總之，細(xì)菌染色體、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和噬菌體等都可能成為細(xì)菌耐藥基因形成與轉(zhuǎn)移的載體?；蛟诓粩嗟淖儺愡^程中產(chǎn)生新型耐藥基因。整個自然界是一個耐藥基因的儲藏庫，細(xì)菌產(chǎn)生新型耐藥基因的基因突變是無窮的[46]。耐藥基因通過質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動遺傳因子轉(zhuǎn)移和傳播?？咕幍氖褂弥粴缌瞬≡y以根除耐藥基因?？咕幍臑E用只消滅了敏感菌而選擇了耐藥菌，從而使得耐藥基因廣泛流傳[47]。

4 結(jié)語

新的耐藥基因不斷產(chǎn)生，耐藥菌株層出不窮，這給感染性疾病的防治帶來了極大的困難和挑戰(zhàn)。在現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)空前發(fā)展的背景下，耐藥菌感染性疾病的防治卻成了難題。抗菌藥的濫用選擇了耐藥菌，因此除了合理使用抗菌藥外，耐藥菌的防治還需要不斷開發(fā)新的治療方法。用宏基因組學(xué)方法篩查腸道和環(huán)境微生物中的耐藥基因可以為預(yù)測致病菌抗藥性的發(fā)展趨勢提供數(shù)據(jù)保障。化學(xué)藥物防治病原菌難以持久，研發(fā)疫苗、抗菌肽和噬菌體[48-49]等生物防治法將是感染性疾病防治的最優(yōu)選擇。