m6A-RNA甲基化在非小細胞肺癌中的研究進展

袁婷莫碧文

作者單位：541004 桂林 1桂林醫(yī)學院呼吸疾病重點實驗室；2桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的80%，大部分患者就診時臨床分期較晚，常伴局部侵犯和遠處轉(zhuǎn)移，臨床治療效果并不理想，5年生存率低于20%［1-2］。既往研究顯示表觀遺傳學修飾與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其主要通過DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重構(gòu)等方式對基因功能和表達水平進行調(diào)控，從而影響腫瘤的進展。表觀遺傳調(diào)控具有可遺傳性和可逆性［3］，廣泛參與調(diào)控腫瘤的多種惡性表型，并與其發(fā)生、發(fā)展和耐藥密切相關(guān)，因此揭示表觀遺傳調(diào)控機制有望為腫瘤患者的早期檢測、疾病監(jiān)測及預后判斷提供潛在的分子標志物［4］。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine，m6A）-RNA甲基化是一種類似DNA甲基化或組蛋白修飾的表觀遺傳修飾方式，是由甲基化轉(zhuǎn)移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和相關(guān)閱讀蛋白（Readers）共同調(diào)節(jié)的一種動態(tài)可逆的生物學過程［5］。目前研究顯示，m6A-RNA甲基化參與包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，其主要通過影響mRNA的穩(wěn)定性，調(diào)控腫瘤細胞增殖，影響細胞外基質(zhì)或改變細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力進而影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，可能是潛在的干預靶點［6］。本文就m6A-RNA甲基化在NSCLC中的研究進展作一綜述。

1 m6A-RNA甲基化的概述

RNA甲基化研究是近年來表觀遺傳領(lǐng)域的前沿研究熱點，其中m6A-RNA甲基化是最常見、最豐富的真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾［7］，其主要富集于終止密碼子附近和 3′-非編碼區(qū)（3′-untranslated region，3′UTR）［8］，具有動態(tài)可逆、分布廣泛以及修飾位點高度保守等特點。m6A的生物學過程主要由三種關(guān)鍵蛋白調(diào)控，即甲基化轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和甲基化閱讀蛋白。甲基化轉(zhuǎn)移酶以復合物形式發(fā)揮生物學作用，主要催化mRNA上的腺苷酸而發(fā)生m6A修飾；去甲基化酶可對已發(fā)生m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾；而甲基化閱讀蛋白則主要是識別發(fā)生m6A-RNA甲基化的堿基，從而激活下游的調(diào)控通路，如mRNA降解、miRNA加工等。甲基化轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶在m6A-RNA甲基化中起到動態(tài)調(diào)節(jié)作用［9］。

m6A-RNA甲基化在干細胞的維持與分化、生物鐘節(jié)律調(diào)控、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、免疫調(diào)控、代謝性疾病等過程中發(fā)揮重要作用。GEULA等［10］在小鼠初發(fā)多能分化過程中發(fā)現(xiàn)，m6A-RNA甲基化作為分子開關(guān)的調(diào)控因子，可確保多能因子穩(wěn)定性，而這是正確的遺傳啟動和干細胞分化所必需的。FUSTIN等［11］報道當m6A甲基化被抑制后，細胞質(zhì)mRNA生物節(jié)律與穩(wěn)態(tài)前體mRNA發(fā)生解偶聯(lián)，從而特異性抑制甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3），導致晝夜節(jié)律延長，RNA加工延遲。還有研究發(fā)現(xiàn)，METTL3介導的m6A-RNA甲基化可促進樹突狀細胞（dendritic cell，DC）的激活和功能成熟，樹突狀細胞中缺失METTL3基因可使其功能成熟受損，以及CD40、CD80和細胞因子IL-12表達下調(diào)，從而導致刺激T細胞反應(yīng)的能力下降［12］。m6ARNA甲基化的動態(tài)改變還可影響信號分子和代謝通路相關(guān)基因的表達，從而影響機體的新陳代謝，其可以表現(xiàn)出不同的生理功能，而功能失調(diào)的m6A-RNA甲基化可導致多種疾病的發(fā)生，包括肥胖、糖尿病、代謝綜合征以及癌癥［13］。

2 RNA甲基化研究是近年來表觀遺傳領(lǐng)域的前沿研究熱點，其m6A-RNA甲基化在NSCLC中的作用

RNA表觀遺傳修飾系統(tǒng)較復雜，m6A修飾酶既可以識別促癌基因也可以識別抑癌基因。既往研究顯示，m6A-RNA甲基化在NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其甲基化相關(guān)因子可作為促癌因子（如ALKBH5）或抑癌因子（如 METTL3、FTO、YTHDF1、HNRNPA2B1、HNRNPC和eIF3等）在NSCLC細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期中發(fā)揮作用，可能成為NSCLC治療的潛在的新靶點。

2.1 m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶

m6A修飾是由METTL3和甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）及其輔因子腎母細胞瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）、RNA 結(jié)合基序 15（RBM15）、KIAA1429、ZC3H13 和METTL16組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復合物（Writers）催化的。其中，具有催化亞基活性的是METTL3，METTL14可與METTL3形成二聚體，而WTAP通過與RBM15、KIAA1429和ZC3H13結(jié)合形成復合體招募METTL3-METTL14二聚體至核小斑對底物進行甲基化修飾［14-16］。METTL3是m6A甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中最主要的催化酶，可作為原癌基因或抑癌基因參與腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、遷移、細胞周期、分化等生物學進程［17-20］。目前，m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶在NSCLC中的作用主要集中于METTL3的相關(guān)研究。研究表明，敲低METTL3可抑制肺癌A549和H1299細胞存活和增殖，并且誘導細胞凋亡，同時也可以改變PI3K/AKT信號通路成員的蛋白表達和磷酸化，進而發(fā)揮抑癌作用［21-22］。在METTL3的SUMO化修飾介導的mRNA中，m6A的交替以及隨后的基因表達譜改變可能直接影響肺癌H1299細胞生長［23］。此外，METTL3也可能以非m6A依賴性的方式影響NSCLC進展。JIN等［24］研究發(fā)現(xiàn)，METTL3通過與eIF3h相互作用，使mRNA環(huán)化，核糖體回收再利用的效率提高，從而增強了翻譯效率，促進NSCLC的轉(zhuǎn)移。該研究還發(fā)現(xiàn)抑制METTL3不僅可能成為治療NSCLC的靶點，也可以增強化療敏感性。由此認為，METTL3在NSCLC細胞中主要發(fā)揮促癌作用，可能是NSCLC潛在的診斷和治療靶點。

2.2 m6A去甲基化酶

m6A去甲基化酶主要有肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated protein，F(xiàn)TO）和烷烴羥化酶同源5基因（a-ketoglutarate-dependent dioxygenase alk B homolog 5，ALKBH5）均屬于AlkB同系物家族，并被歸類為2-氧戊二酸鹽和鐵依賴性核酸氧合酶［25］。FTO和ALKBH5主要對m6A修飾的堿基進行去甲基化修飾，其中FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，顯示出對m6A的高去甲基活性，可影響代謝疾病和人類肥胖的發(fā)生［26］；而ALKBH5可催化去除核RNA（主要是mRNA）上的m6A修飾，進而影響核RNA輸出、代謝和基因表達，甚至小鼠的生育能力［27-28］。然而目前研究顯示，ALKBH5和FTO雖然同為m6A去甲基化酶，但兩者在NSCLC的病理發(fā)展過程中卻發(fā)揮不同的作用。其中，ALKBH5在NSCLC中主要發(fā)揮抑癌作用，而FTO在NSCLC中則可能發(fā)揮促癌作用。研究發(fā)現(xiàn)異常表達的ALKBH5可下調(diào)YTHDFs介導的Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP）表達并抑制miR-107/LATS2介導的YAP活性，從而抑制NSCLC細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［29］。但是在肺鱗狀細胞癌L78和 NCI-H520細胞中敲除FTO基因，卻發(fā)現(xiàn)有效抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，而過表達FTO則促進其惡性進展［30］。在肺腺癌A549和H1299細胞中過表達FTO同樣可觀察到細胞的增殖、遷移和侵襲能力增強，且m6A-RNA表達水平下調(diào)，因此推測FTO可能通過m6A去甲基化致使細胞遷移而促進肺腺癌進展［31］。LI等［32］在NSCLC組織和細胞系中也發(fā)現(xiàn)FTO過表達，而m6A含量降低，進一步在細胞中敲低FTO表達發(fā)現(xiàn)可抑制NSCLC細胞增殖，其作用機制可能與FTO的去甲基化酶活性有關(guān)。同時有研究［30］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO發(fā)生突變后其過表達并不能促進NSCLC細胞增殖和侵襲，說明FTO對NSCLC的致癌作用可能主要依賴于其催化活性。以上研究結(jié)果說明FTO在NSCLC中發(fā)揮促癌作用，抑制FTO可能延緩NSCLC進展。

2.3 m6A甲基化閱讀蛋白

目前研究顯示，m6A甲基化閱讀蛋白主要作為促癌因子影響NSCLC增殖、遷移和侵襲。生物體中存在能與m6A特異性識別結(jié)合并介導其行使生物學功能的m6A閱讀蛋白，包括YTH結(jié)構(gòu)域蛋白1（YTH domaincontaining family protein 1，YTHDF1）、YTH結(jié)構(gòu)域蛋白 2（YTH domain-containing family protein 2，YTHDF2）、YTH結(jié)構(gòu)域蛋白 C1（YTH domain-containing protein C1，YTHDC1），核不均一核糖核蛋白 A2B1（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2B1，hnRNPA2B1）及核不均一核糖核蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C，hnRNPC），真核起始因子 3（eukaryotic initiation factor 3，eIF3），胰島素樣生長因子2mRNA結(jié)合蛋白1（insulin-likegrowthfactor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1）等，這些蛋白與 m6A 特異性結(jié)合后可介導RNA的選擇性剪切［33］、細胞內(nèi)定位和翻譯控制［34］等RNA代謝過程。

SHI等［35］報道 YTHDF1 缺失可影響 CDK2、CDK4和cyclin D1的翻譯效率而抑制NSCLC細胞增殖及肺鱗狀細胞癌進展，而YTHDF1高表達與更好的臨床結(jié)局相關(guān)。另有學者［36］檢測50例NSCLC組織標本同樣發(fā)現(xiàn)hnRNPA2B1在NSCLC中高度表達，且可與MGMT（甲基鳥嘌呤DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶）mRNA結(jié)合，認為hnRNPA2B1可能參與NSCLC發(fā)病。此外，hnRNPA2B1還也可通過特異性結(jié)合COX-2的核心啟動子調(diào)節(jié)NSCLC生長［37］；hnRNPC過表達與較晚的臨床分期及淋巴結(jié)和遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，且可促進 NSCLC細胞增殖、遷移和侵襲［38］，其可能是通過激活I(lǐng)FN-α-JAK-STAT1信號通路發(fā)揮作用。

eIF3是最大、最復雜的翻譯起始因子之一，由13個亞單位組成，如 eIF3a、eIF3b、eIF3d、eIF3h 等。其中，eIF3a是管家基因，與肺癌的發(fā)生和耐藥性密切相關(guān)［39］。在NSCLC細胞中eIF3b呈高表達，且與疾病進展及不良預后有關(guān)，還能促進NSCLC細胞增殖，抑制細胞凋亡［40］。在NSCLC細胞A549和95D中敲低eIF3d也發(fā)現(xiàn)可顯著抑制細胞增殖和集落形成，并阻滯細胞周期于G2/M期［41］。而這一作用可能是通過抑制整合素α5（integrin α 5）及腫瘤壞死因子受體超家族成員 21（tumor necrosis factor receptor superfamily member 21，TNFRSF21）表達或激活β-連環(huán)蛋白信號通路實現(xiàn)［42-44］。此外，有研究報道eIF3h與METTL3之間直接的物理和功能相互作用是增強致癌mRNA翻譯、形成密集包裝多核糖體和肺腺癌致癌性轉(zhuǎn)化所必需的［45］。而有研究報道eIF3h蛋白在肺腺癌組織中高表達，eIF3h過表達促進肺腺癌細胞遷移和侵襲，這進一步證實了eIF3h是肺腺癌的致癌因素［46］。由此可見，在NSCLC中eIF3亞基主要表現(xiàn)為促進癌細胞增殖、遷移、侵襲和抑制細胞凋亡作用，有望成為NSCLC治療的潛在靶點。

IGF2BP1是一種新型m6A閱讀器，而IGF2BPs（IGF2BP1/2/3）作為一個獨特的m6A家族讀碼器，可通過識別一致的GG（m6A）C序列靶向成千上萬的mRNA轉(zhuǎn)錄［47］。分析癌癥基因組圖譜（TCGA）發(fā)現(xiàn)IGF2BP1在NSCLC組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，下調(diào)IGF2BP1可抑制NSCLC細胞增殖［48］。

3 小結(jié)

m6A-RNA甲基化在NSCLC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其甲基化相關(guān)因子可作為促癌因子或抑癌因子參與NSCLC細胞的生物學進程及化療耐藥，因此深入探討m6A-RNA甲基化在NSCLC中的作用及其作用機制，以及m6A相關(guān)因子在NSCLC發(fā)生發(fā)展過程中的協(xié)同或拮抗作用，有望為NSCLC的診斷及治療提供新的思路。