液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素粗提物色素組分的分離純化與鑒定

徐菲菲，徐海笑，梁蓉，鐘芳

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)食品健康與安全關(guān)注日益增加，天然色素的市場需求日益增長，其開發(fā)和利用具有較大的商業(yè)價(jià)值。根據(jù)色素的色調(diào)，紅曲色素分為紅曲紅、紅曲黃和紅曲橙3類；其中公認(rèn)的黃色素2種組分為紅曲素和安卡紅曲黃素[1]。目前紅曲紅色素已大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，它具有一系列有利于健康的生理活性[2-7,8-10]。在固態(tài)紅曲米色素中，3類色素共存，含有一定含量的黃色素，種類較多、成分復(fù)雜，直接以溶劑提取法從紅曲色素產(chǎn)品中分離提取利用并不經(jīng)濟(jì)，因而相關(guān)的研究主要集中在高色價(jià)的紅曲菌篩選和固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化上。

毛鵬[11]篩選出黃色素產(chǎn)量高的紅曲菌Monascussp.sjs-6，并優(yōu)化發(fā)酵條件，最終發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黃色素色價(jià)達(dá)到397.2 U/mL。薄層析色譜對(duì)色素進(jìn)行展開，出現(xiàn)一個(gè)深黃色和一個(gè)淺黃色色帶，特征吸收波長分別為421和409 nm，且色素不含有橙色素和紅色素。但研究并未對(duì)這2種色素條帶進(jìn)行進(jìn)一步的純化鑒定，其所含色素的分子結(jié)構(gòu)式尚未明確。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前已發(fā)現(xiàn)35種紅曲黃色素組分[12]，因而需要分離純化出高純度紅曲黃色素組分并鑒定其分子結(jié)構(gòu)。

MARIE等[13]采用連續(xù)薄層析色譜法分離紅曲黃色素，先用氯仿-丙酮(9∶1，體積比)作為展開劑，然后用石油醚-二乙基醚(5∶5，體積比)再次展開，從MonascusruberATCC 96218的發(fā)酵產(chǎn)物中得到黃色斑點(diǎn)，進(jìn)一步使用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化，得到高純度組分，經(jīng)核磁共振分析確定為Monarubrin和Rubropunctin。楊強(qiáng)等[14]采用硅膠柱層析法，分離純化了紅曲菌絲體內(nèi)醇溶性紅曲黃色素，經(jīng)鑒定表征，確定3種色素組分為紅斑胺素、紅曲素、紅斑素，其中紅曲素為主要成分。夏明等[15]采用高速逆流色譜法，從紅曲米中提取的色素中分離出一種黃色素和一種紫紅色素，但并未對(duì)2種組分進(jìn)行進(jìn)一步分析。鄭允權(quán)等[16]建立兩步逆流萃取，通過高速逆流色譜法從紅曲粉中分離得到紅、橙、黃6種色素組分，純度均大于98.5%。崔莉等[17]從紅曲米中索氏抽提出紅曲黃色素粗提取物，并用制備液相分離純化得到高純度的紅曲素和安卡紅曲黃素，建立了高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)紅曲混合色素中紅曲黃色素含量的檢測(cè)方法，具有較高的重復(fù)性和精密度。

本研究以通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的高色價(jià)紅曲黃色素為研究對(duì)象，采用高效液相色譜作為分離手段，分離純化并制備少量高純度的紅曲黃色素組分，使用液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析對(duì)色素組分的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以鑒定液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素的主要色素成分，為紅曲黃色素在食品工業(yè)中應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素粗提物，由江南大學(xué)生物工程學(xué)院毛鵬所在實(shí)驗(yàn)室提供；無水乙醇、液相色譜級(jí)甲醇、液相色譜級(jí)甲酸、氘代氯仿，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超純水，市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

A560分光光度計(jì)，翱藝儀器(上海)有限公司；E2695高效液相色譜儀、1525半制備型液相色譜儀、MALDI SYNAPT MS液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Waters公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司；DZG-6050SAD真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Aduance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀，德國布魯克AXS有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲黃色素的萃取

將體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液與含色素的脂溶性提取物按體積比4∶1混勻，靜置分層，取上層乙醇溶液，經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，除去乙醇和水，獲得天然紅曲黃色素油樹脂(色素和油脂類物質(zhì)的互溶物)。

1.3.2 紅曲黃色素色價(jià)的測(cè)定

精確稱取一定量紅曲黃色素油樹脂，用無水乙醇溶解，定容至100 mL，搖勻。取樣品溶液置于1 cm比色皿中，以無水乙醇為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在350～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描，于波長(410±10)nm的最大吸收波長處測(cè)定其吸光度。色價(jià)(U/g)按公式(1)計(jì)算:

色價(jià)=吸光度(A)×稀釋倍數(shù)

(1)

1.3.3 分析型高效液相色譜分離紅曲黃色素組分

稱取0.15 g紅曲黃色素油樹脂，用無水乙醇溶解并定容至250 mL。將溶液以0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣。流動(dòng)相A：100%甲醇，流動(dòng)相B：100%水；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL，樣品室溫度：20 ℃；柱溫：30 ℃；波長掃描范圍：220～600 nm；色譜柱：Symmetry C18反相硅膠柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。分離度R按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中，tR2,相鄰兩峰后一峰的保留時(shí)間；tR1,相鄰兩峰前一峰的保留時(shí)間；W1、W2,相鄰兩峰的峰寬。

1.3.4 制備型液相色譜分離紅曲黃色素組分

稱取一定量的紅曲黃色素油狀樹脂，用甲醇溶解，制得0.1 g/mL的色素甲醇溶液，以0.22 μm有機(jī)膜過濾。將分析型液相色譜的分離條件乘以放大系數(shù)4.73后作為制備液相的初始條件，再根據(jù)實(shí)際的分離情況對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)收集到的目標(biāo)組分在分析型液相色譜上進(jìn)行分析，以峰面積歸一化法計(jì)算純度。色譜柱為X bridge C18反相硅膠柱(10 mm×250 mm，5 μm)。流出液在40 ℃進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集液至稱量瓶中；吹N2除去甲醇后置于真空干燥箱，30 ℃下真空干燥72 h，獲得高純度色素組分。

1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

紅曲黃色素組分用色譜級(jí)甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣。色譜柱：Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相A：100%甲醇；流動(dòng)相B：水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸)；流速：0.3 mL/min：分析時(shí)間：15 min。洗脫程序：0～0.1 min，5%甲醇等度洗脫；0.1～8 min，5%甲醇線性變化至80%甲醇；8～10 min，80%甲醇線性變化至100%甲醇；10～12 min 100%甲醇等度洗脫；12～12.1 min 100%甲醇線性變化至5%甲醇。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀條件：ESI源，ESI+毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流：700 L/h；錐孔氣流：50 L/h；碰撞能量：6 eV；掃描質(zhì)量(m/z)范圍：50～1 000；檢測(cè)器電壓：1 800 V。

1.3.6 核磁共振分析

以氘代氯仿為溶劑，樣品質(zhì)量濃度：30 mg/mL，測(cè)試溫度：25 ℃，氫譜(1H NMR)的觀測(cè)頻率：400.140 MHz，碳譜(13CNMR)的觀測(cè)頻率：100.625 MHz。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

核磁共振分析軟件為TopSpin 4.0.1，質(zhì)譜分析軟件為MassLynx V4.1。所得數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.0軟件制圖，其中二維核磁共振數(shù)據(jù)采用MestReNova制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲黃色素的萃取

紅曲發(fā)酵液的黃色素粗提物油相的色價(jià)為(701±42.7) U/g，所得油樹脂的色價(jià)為(9 100±93.1)U/g，萃取率為63.50%，與李明起[18]采用溶劑抽提法提取紅曲色素的得率66%較為接近。

2.2 分析型液相色譜分離條件的優(yōu)化

以甲醇-水為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，并通過改變流動(dòng)相的極性，探究紅曲黃色素中不同組分的保留時(shí)間、出峰形狀和相鄰峰干擾狀況，優(yōu)化分離條件使紅曲黃色素組分之間完全分離，即分離度R大于1.5[19-20]。

由表1可知，在90%甲醇等度洗脫的情況下，紅曲黃色素在330～440 nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)相鄰的大峰，峰A和峰B。330～440 nm為黃色素的特征吸收峰[21]，峰A和峰B的對(duì)應(yīng)物質(zhì)為紅曲黃色素的主要組分。其中，峰A的最大吸收波長為235和394 nm，峰B的最大吸收波長為235和389 nm。此條件下2個(gè)相鄰峰的分離度為0.95，表明2個(gè)峰沒有完全分開。將流動(dòng)相調(diào)整為85%甲醇時(shí)，兩峰之間的分離度為1.63，表明二者完全分離，但存在雜質(zhì)峰與兩峰部分重疊。進(jìn)一步將流動(dòng)相調(diào)整為80%甲醇時(shí)，2個(gè)峰的分離度進(jìn)一步增加至2.51，且無雜質(zhì)峰干擾(圖1)。但當(dāng)流動(dòng)相進(jìn)一步調(diào)整至75%甲醇時(shí)，兩峰的保留時(shí)間變長，分別達(dá)到19.8 min和22.1 min，分離度因峰變寬而減小，為2.21。綜合考慮分離效果和分離時(shí)間，確定最佳洗脫條件為80%的甲醇等度洗脫。

2.3 制備型液相色譜分離純化制備高純度紅曲黃色素組分

根據(jù)色素組分分離狀況和分離時(shí)間調(diào)整流動(dòng)相的極性和流速，確定洗脫條件為：流速4 mL/min，70%甲醇等度洗脫。組分A和組分B的保留時(shí)間分別為18.7和20.5 min，分離度為2.12，滿足分離要求(圖2)。收集半峰高以上的流出液以確保色素組分較高的純度。

收集得到的組分A和組分B的流出液在分析型液相上進(jìn)行純度檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)，制備液相純化得到的組分A和組分B的純度分別為98.95%和99.02%，已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品純度(純度大于97%)。

2.4 質(zhì)譜分析

對(duì)制備型液相色譜分離得到的高純度色素組分A和組分B進(jìn)行質(zhì)譜分析(見圖3)。

由圖3可知，組分A在質(zhì)譜上的離子峰為359，故組分A的相對(duì)分子質(zhì)量為358。此相對(duì)分子質(zhì)量與BUSABA等[22-23]報(bào)道的紅曲素和Monankins A、Monankins B和Monakins F的相對(duì)分子質(zhì)量一致，組分B在質(zhì)譜上的離子峰為333，故其相對(duì)分子質(zhì)量為332，目前的文獻(xiàn)報(bào)道[24]Monaphilone B的相對(duì)分子質(zhì)量為332，最大吸收波長為229和384 nm。組分的B的最大吸收波長分別為235和389 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收波長存在差異。

經(jīng)質(zhì)譜分析確定了組分A與組分B的相對(duì)分子質(zhì)量，目前已知的與組分A同分異構(gòu)的紅曲色素有4種，而組分B的相對(duì)分子質(zhì)量僅與1種已知組分吻合，但最大吸收波長存在差異。因此，進(jìn)一步通過核磁共振分析對(duì)組分A和組分B的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，以確定其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2.5 核磁共振分析

核磁共振分析中，可通過一維核磁，即氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)給出未知物質(zhì)分子中氫原子和碳原子的化學(xué)位移信息，通過二維核磁，即COSY譜、HSQC譜和HMBC譜分別給出的相鄰氫、相鄰碳?xì)浜瓦h(yuǎn)程碳?xì)涞鸟詈详P(guān)系，來鑒定未知物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。

2.5.1 一維核磁分析

如圖4所示,組分A的氫譜數(shù)據(jù)為δ 0.89(3H，J=7.2，t)，δ1.30(4H，m)，δ1.45(3H，s)，δ1.62(2H，m)，δ1.87(3H，J=7.2，d)，δ2.44(1H，J=18.0，11.8，dd)，δ2.60(1H，J=18.0，7.2，dt)，δ2.67(1H，J=17，4，dd)，δ3.01(1H，J=18，7.2，dt)，δ3.23(1H，m)，δ3.67(1H，J=13.2，d)，δ4.72(1H，J=12.6，d)，δ5.06(1H，J=12.6，d)，δ5.27(1H，s)，δ5.90(1H，J=15.4，d)，δ6.50(1H，J=22.4，7.2，dt)。組分A的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9，δ17.7，δ18.5，δ22.4，δ22.8，δ29.4，δ31.2，δ42.9，δ54.9，δ63.8，δ83.2，δ103.3，δ114.0，δ124.4，δ135.4，δ150.8，δ160.5，δ169.5，δ189.8，δ202.5。結(jié)合氫譜和碳譜的數(shù)據(jù)，可知組分A有21個(gè)碳原子，26個(gè)氫原子，其相對(duì)分子質(zhì)量為358，所以可知組分A的分子式為C21H26O5。

組分B的氫譜數(shù)據(jù)為δ0.89(3H，J=7.2，t)，δ1.16(3H，s)，δ1.28(4H，m)，δ1.58(2H，m)，δ1.86(3H，J=7.2，d)，δ2.10(1H，J=20，12.2，dd)，δ2.40(3H，m)，δ2.60(2H，m)，δ2.97(1H，J=17，d)，δ4.76(1H，J=12.4，d)，δ5.01(1H，J=12.4，d)，δ5.22(1H，s)，δ5.89(1H，J=15.4，d)，δ6.47(1H，J=22.4，7.2，dt)。組分B的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9，δ18.4，δ19.9，δ22.4，δ23.5，δ31.4，δ32.6，δ39.4，δ42.0，δ43.2，δ64.0，δ74.1，δ103.4，δ113.0，δ124.7，δ134.7，δ152.5，δ160.4，δ197.9，δ210.1。組分B有20個(gè)碳原子，28個(gè)氫原子，其相對(duì)分子質(zhì)量為332，所以可知組分B的分子式為C20H28O4。組分A和組分B可能為紅曲素和Monaphilone B，但部分氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]存在差異，且最大吸收波長不一致，推測(cè)組分A和組分B有可能分別為紅曲素和Monaphilone B的同分異構(gòu)體，將進(jìn)一步采用二維核磁分析以確定組分A與組分B的分子結(jié)構(gòu)。

2.5.2 二維核磁分析

根據(jù)碳譜數(shù)據(jù)，組分A有20個(gè)碳核，分別以1～20編號(hào)，但C8有裂峰，實(shí)際有2種碳，分別編號(hào)為C8a和C8b。根據(jù)化學(xué)位移可知，C12、C13、C14、C15、C16和C17為雙鍵上的碳，C18、C19和C20為羰基碳。結(jié)合HSQC圖譜(圖5)，H1與C1相連，H2與C4，C7相連，H3與C2相連，H4與C5相連，H5與C3相連，H6與C6相連，H7a與C8a相連，H7b與C6相連，H8與C8a相連，H9與C8b相連，H10與C9相連，H11、H12與C10相連，H13與C12相連，H14與C14相連，H15與C15相連，C11、C13、C16、C17、C18、C19、C20沒有氫原子與之相連。H11和H12為C10上的2個(gè)氫，H6和H7b為C6上的2個(gè)氫，H7a和H8為C8a上的2個(gè)氫。

分析A的HMBC圖譜，可知H3與C8b、C11和C19耦合，表明C8b、C11和C19為C2的鄰位碳和間位碳；H7a、H8與C5、C7和C20耦合，所以戊烷基與羰基(C20)相連；H9與C6、C9、C11、C19和C20耦合；H10與C6、C8b、C18和C20耦合，C6、C8b、C18和C20為C9的鄰位碳和間位碳。H11、H12與C13、C16、C17和C19耦合，H13與C6、C10、C13、C14、C16、C17和C9耦合。

結(jié)合組分A的氫譜、碳譜、COSY譜、HSQC譜和HMBC譜，以及二維核磁數(shù)據(jù)(表2)，最終確定組分A為紅曲素，分子結(jié)構(gòu)圖如圖6所示。

與組分A二維核磁的分析方法相同，對(duì)組分B的COSY譜、HSQC譜和HMBC譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

根據(jù)組分B的二維核磁數(shù)據(jù)(表3)，最終確定該組分為Monaphilone B，分子結(jié)構(gòu)圖如圖7所示。

2.6 紅曲黃色素分子結(jié)構(gòu)對(duì)其吸收波長的影響

分離得到的紅曲素與Monaphilone B經(jīng)紫外-可見光分光光度計(jì)在200～600 nm波長范圍進(jìn)行全波長掃描，紅曲素的最大吸收波長為235和394 nm，Monaphilone B的最大吸收波長為235和389 nm(圖8)，與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致。

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)式可知，紅曲素與Monaphilone B的主體結(jié)構(gòu)基本一致，是1個(gè)具有延伸共軛雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)(圖9)。

根據(jù)α,β-不飽和酮的吸收規(guī)則[25]可以推算紅曲黃色素組分的最大吸收波長λmax：推理過程如下，α,β-不飽和酮的基本吸收波長為215 nm，該結(jié)構(gòu)上增加了2個(gè)共軛雙鍵，增量為30×2 nm；且延伸的2個(gè)共軛雙鍵在同1個(gè)環(huán)內(nèi)，故吸收波長增加39 nm；由于α位點(diǎn)、β位點(diǎn)和ζ位點(diǎn)均有烷基取代，所以吸收波長分別增加10、12 nm和18 nm；δ位點(diǎn)上存在1個(gè)烷氧基取代，所以吸收波長增加31 nm；紅曲素分子中存在1個(gè)內(nèi)酯五元環(huán)與α,β-不飽和酮六元環(huán)連接，故吸收波長增加6 nm，因此紅曲素理論最大吸收波長為391 nm，與實(shí)測(cè)吸收波長394 nm基本吻合，而Monaphilone B分子結(jié)構(gòu)中沒有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，所以其理論最大吸收波長為385 nm，與實(shí)測(cè)吸收波長389 nm基本吻合。紅曲素和Monaphilone B同時(shí)在235 nm處有強(qiáng)吸收，根據(jù)紅曲素在235 nm處存在1個(gè)強(qiáng)吸收，根據(jù)共軛多烯類化合物的吸收規(guī)則[25]，紅曲素和Monaphilone B中鏈狀共軛二烯基本吸收值為217 nm，由于存在2個(gè)烷基取代和1個(gè)烷氧基取代，分別增加5×2 nm和6 nm，所以理論最大吸收波長為233 nm，與實(shí)測(cè)波長235 nm基本一致。

3 結(jié)論

本研究從發(fā)酵液的粗提物中萃取得到高色價(jià)的紅曲黃色素油樹脂，以高效液相色譜為分離純化，其色價(jià)高達(dá)9 100 U/g，萃取率為63.50%，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。分析型高效液相色譜最佳分離條件為80%甲醇等度洗脫，流速為0.5 mL/min下，在液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素中檢測(cè)出2種主要色素組分，色素組分之間分離度為2.51，且不受雜質(zhì)峰影響，分離效果較好。制備型高效液相色譜最佳的分離條件為70%甲醇等度洗脫，流速為4 mL/min，2種組分純度分別為98.95%和99.02%，達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的要求(>97%)。通過液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析，最終確定分離得到的2種色素組分為紅曲素(C21H26O5)和Monaphilone B(C20H28O4)，發(fā)酵液的粗提物中的紅曲黃色素主要色素組分為紅曲素，紅曲黃色素的顯色性能來自于分子結(jié)構(gòu)中具有延伸雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)。