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    液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素粗提物色素組分的分離純化與鑒定

    2020-01-07 03:27:10徐菲菲徐海笑梁蓉鐘芳
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:色價(jià)紅曲黃色素

    徐菲菲,徐海笑,梁蓉,鐘芳

    1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

    近年來,隨著消費(fèi)者對(duì)食品健康與安全關(guān)注日益增加,天然色素的市場需求日益增長,其開發(fā)和利用具有較大的商業(yè)價(jià)值。根據(jù)色素的色調(diào),紅曲色素分為紅曲紅、紅曲黃和紅曲橙3類;其中公認(rèn)的黃色素2種組分為紅曲素和安卡紅曲黃素[1]。目前紅曲紅色素已大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),它具有一系列有利于健康的生理活性[2-7,8-10]。在固態(tài)紅曲米色素中,3類色素共存,含有一定含量的黃色素,種類較多、成分復(fù)雜,直接以溶劑提取法從紅曲色素產(chǎn)品中分離提取利用并不經(jīng)濟(jì),因而相關(guān)的研究主要集中在高色價(jià)的紅曲菌篩選和固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化上。

    毛鵬[11]篩選出黃色素產(chǎn)量高的紅曲菌Monascussp.sjs-6,并優(yōu)化發(fā)酵條件,最終發(fā)酵罐中發(fā)酵液的黃色素色價(jià)達(dá)到397.2 U/mL。薄層析色譜對(duì)色素進(jìn)行展開,出現(xiàn)一個(gè)深黃色和一個(gè)淺黃色色帶,特征吸收波長分別為421和409 nm,且色素不含有橙色素和紅色素。但研究并未對(duì)這2種色素條帶進(jìn)行進(jìn)一步的純化鑒定,其所含色素的分子結(jié)構(gòu)式尚未明確。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道目前已發(fā)現(xiàn)35種紅曲黃色素組分[12],因而需要分離純化出高純度紅曲黃色素組分并鑒定其分子結(jié)構(gòu)。

    MARIE等[13]采用連續(xù)薄層析色譜法分離紅曲黃色素,先用氯仿-丙酮(9∶1,體積比)作為展開劑,然后用石油醚-二乙基醚(5∶5,體積比)再次展開,從MonascusruberATCC 96218的發(fā)酵產(chǎn)物中得到黃色斑點(diǎn),進(jìn)一步使用制備型高效液相色譜進(jìn)行純化,得到高純度組分,經(jīng)核磁共振分析確定為Monarubrin和Rubropunctin。楊強(qiáng)等[14]采用硅膠柱層析法,分離純化了紅曲菌絲體內(nèi)醇溶性紅曲黃色素,經(jīng)鑒定表征,確定3種色素組分為紅斑胺素、紅曲素、紅斑素,其中紅曲素為主要成分。夏明等[15]采用高速逆流色譜法,從紅曲米中提取的色素中分離出一種黃色素和一種紫紅色素,但并未對(duì)2種組分進(jìn)行進(jìn)一步分析。鄭允權(quán)等[16]建立兩步逆流萃取,通過高速逆流色譜法從紅曲粉中分離得到紅、橙、黃6種色素組分,純度均大于98.5%。崔莉等[17]從紅曲米中索氏抽提出紅曲黃色素粗提取物,并用制備液相分離純化得到高純度的紅曲素和安卡紅曲黃素,建立了高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)紅曲混合色素中紅曲黃色素含量的檢測(cè)方法,具有較高的重復(fù)性和精密度。

    本研究以通過液態(tài)發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的高色價(jià)紅曲黃色素為研究對(duì)象,采用高效液相色譜作為分離手段,分離純化并制備少量高純度的紅曲黃色素組分,使用液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析對(duì)色素組分的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,以鑒定液態(tài)發(fā)酵的天然紅曲黃色素的主要色素成分,為紅曲黃色素在食品工業(yè)中應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。

    1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素粗提物,由江南大學(xué)生物工程學(xué)院毛鵬所在實(shí)驗(yàn)室提供;無水乙醇、液相色譜級(jí)甲醇、液相色譜級(jí)甲酸、氘代氯仿,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水,市售。

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

    A560分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;E2695高效液相色譜儀、1525半制備型液相色譜儀、MALDI SYNAPT MS液相色譜四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Waters公司;R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海申順生物科技有限公司;DZG-6050SAD真空干燥箱,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Aduance Ⅲ 400 MHz全數(shù)字化核磁共振波譜儀,德國布魯克AXS有限公司。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 紅曲黃色素的萃取

    將體積分?jǐn)?shù)為85%的乙醇溶液與含色素的脂溶性提取物按體積比4∶1混勻,靜置分層,取上層乙醇溶液,經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后,除去乙醇和水,獲得天然紅曲黃色素油樹脂(色素和油脂類物質(zhì)的互溶物)。

    1.3.2 紅曲黃色素色價(jià)的測(cè)定

    精確稱取一定量紅曲黃色素油樹脂,用無水乙醇溶解,定容至100 mL,搖勻。取樣品溶液置于1 cm比色皿中,以無水乙醇為空白對(duì)照,用分光光度計(jì)在350~600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描,于波長(410±10)nm的最大吸收波長處測(cè)定其吸光度。色價(jià)(U/g)按公式(1)計(jì)算:

    色價(jià)=吸光度(A)×稀釋倍數(shù)

    (1)

    1.3.3 分析型高效液相色譜分離紅曲黃色素組分

    稱取0.15 g紅曲黃色素油樹脂,用無水乙醇溶解并定容至250 mL。將溶液以0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣。流動(dòng)相A:100%甲醇,流動(dòng)相B:100%水;流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣體積:20 μL,樣品室溫度:20 ℃;柱溫:30 ℃;波長掃描范圍:220~600 nm;色譜柱:Symmetry C18反相硅膠柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。分離度R按公式(2)計(jì)算:

    (2)

    式中,tR2,相鄰兩峰后一峰的保留時(shí)間;tR1,相鄰兩峰前一峰的保留時(shí)間;W1、W2,相鄰兩峰的峰寬。

    1.3.4 制備型液相色譜分離紅曲黃色素組分

    稱取一定量的紅曲黃色素油狀樹脂,用甲醇溶解,制得0.1 g/mL的色素甲醇溶液,以0.22 μm有機(jī)膜過濾。將分析型液相色譜的分離條件乘以放大系數(shù)4.73后作為制備液相的初始條件,再根據(jù)實(shí)際的分離情況對(duì)分離條件進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)收集到的目標(biāo)組分在分析型液相色譜上進(jìn)行分析,以峰面積歸一化法計(jì)算純度。色譜柱為X bridge C18反相硅膠柱(10 mm×250 mm,5 μm)。流出液在40 ℃進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),收集液至稱量瓶中;吹N2除去甲醇后置于真空干燥箱,30 ℃下真空干燥72 h,獲得高純度色素組分。

    1.3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

    紅曲黃色素組分用色譜級(jí)甲醇溶解,經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾后進(jìn)樣。色譜柱:Waters BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A:100%甲醇;流動(dòng)相B:水(含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸);流速:0.3 mL/min:分析時(shí)間:15 min。洗脫程序:0~0.1 min,5%甲醇等度洗脫;0.1~8 min,5%甲醇線性變化至80%甲醇;8~10 min,80%甲醇線性變化至100%甲醇;10~12 min 100%甲醇等度洗脫;12~12.1 min 100%甲醇線性變化至5%甲醇。超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀條件:ESI源,ESI+毛細(xì)管電壓:3.5 kV;離子源溫度:100 ℃;脫溶劑氣溫度:400 ℃;脫溶劑氣流:700 L/h;錐孔氣流:50 L/h;碰撞能量:6 eV;掃描質(zhì)量(m/z)范圍:50~1 000;檢測(cè)器電壓:1 800 V。

    1.3.6 核磁共振分析

    以氘代氯仿為溶劑,樣品質(zhì)量濃度:30 mg/mL,測(cè)試溫度:25 ℃,氫譜(1H NMR)的觀測(cè)頻率:400.140 MHz,碳譜(13CNMR)的觀測(cè)頻率:100.625 MHz。

    1.3.7 數(shù)據(jù)分析

    核磁共振分析軟件為TopSpin 4.0.1,質(zhì)譜分析軟件為MassLynx V4.1。所得數(shù)據(jù)采用OriginPro 9.0軟件制圖,其中二維核磁共振數(shù)據(jù)采用MestReNova制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 紅曲黃色素的萃取

    紅曲發(fā)酵液的黃色素粗提物油相的色價(jià)為(701±42.7) U/g,所得油樹脂的色價(jià)為(9 100±93.1)U/g,萃取率為63.50%,與李明起[18]采用溶劑抽提法提取紅曲色素的得率66%較為接近。

    2.2 分析型液相色譜分離條件的優(yōu)化

    以甲醇-水為流動(dòng)相,流速為0.5 mL/min,并通過改變流動(dòng)相的極性,探究紅曲黃色素中不同組分的保留時(shí)間、出峰形狀和相鄰峰干擾狀況,優(yōu)化分離條件使紅曲黃色素組分之間完全分離,即分離度R大于1.5[19-20]。

    由表1可知,在90%甲醇等度洗脫的情況下,紅曲黃色素在330~440 nm波長范圍內(nèi)出現(xiàn)2個(gè)相鄰的大峰,峰A和峰B。330~440 nm為黃色素的特征吸收峰[21],峰A和峰B的對(duì)應(yīng)物質(zhì)為紅曲黃色素的主要組分。其中,峰A的最大吸收波長為235和394 nm,峰B的最大吸收波長為235和389 nm。此條件下2個(gè)相鄰峰的分離度為0.95,表明2個(gè)峰沒有完全分開。將流動(dòng)相調(diào)整為85%甲醇時(shí),兩峰之間的分離度為1.63,表明二者完全分離,但存在雜質(zhì)峰與兩峰部分重疊。進(jìn)一步將流動(dòng)相調(diào)整為80%甲醇時(shí),2個(gè)峰的分離度進(jìn)一步增加至2.51,且無雜質(zhì)峰干擾(圖1)。但當(dāng)流動(dòng)相進(jìn)一步調(diào)整至75%甲醇時(shí),兩峰的保留時(shí)間變長,分別達(dá)到19.8 min和22.1 min,分離度因峰變寬而減小,為2.21。綜合考慮分離效果和分離時(shí)間,確定最佳洗脫條件為80%的甲醇等度洗脫。

    2.3 制備型液相色譜分離純化制備高純度紅曲黃色素組分

    根據(jù)色素組分分離狀況和分離時(shí)間調(diào)整流動(dòng)相的極性和流速,確定洗脫條件為:流速4 mL/min,70%甲醇等度洗脫。組分A和組分B的保留時(shí)間分別為18.7和20.5 min,分離度為2.12,滿足分離要求(圖2)。收集半峰高以上的流出液以確保色素組分較高的純度。

    收集得到的組分A和組分B的流出液在分析型液相上進(jìn)行純度檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè),制備液相純化得到的組分A和組分B的純度分別為98.95%和99.02%,已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)品純度(純度大于97%)。

    2.4 質(zhì)譜分析

    對(duì)制備型液相色譜分離得到的高純度色素組分A和組分B進(jìn)行質(zhì)譜分析(見圖3)。

    由圖3可知,組分A在質(zhì)譜上的離子峰為359,故組分A的相對(duì)分子質(zhì)量為358。此相對(duì)分子質(zhì)量與BUSABA等[22-23]報(bào)道的紅曲素和Monankins A、Monankins B和Monakins F的相對(duì)分子質(zhì)量一致,組分B在質(zhì)譜上的離子峰為333,故其相對(duì)分子質(zhì)量為332,目前的文獻(xiàn)報(bào)道[24]Monaphilone B的相對(duì)分子質(zhì)量為332,最大吸收波長為229和384 nm。組分的B的最大吸收波長分別為235和389 nm,與文獻(xiàn)報(bào)道的最大吸收波長存在差異。

    經(jīng)質(zhì)譜分析確定了組分A與組分B的相對(duì)分子質(zhì)量,目前已知的與組分A同分異構(gòu)的紅曲色素有4種,而組分B的相對(duì)分子質(zhì)量僅與1種已知組分吻合,但最大吸收波長存在差異。因此,進(jìn)一步通過核磁共振分析對(duì)組分A和組分B的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征,以確定其具體化學(xué)結(jié)構(gòu)。

    2.5 核磁共振分析

    核磁共振分析中,可通過一維核磁,即氫譜(1HNMR)和碳譜(13CNMR)給出未知物質(zhì)分子中氫原子和碳原子的化學(xué)位移信息,通過二維核磁,即COSY譜、HSQC譜和HMBC譜分別給出的相鄰氫、相鄰碳?xì)浜瓦h(yuǎn)程碳?xì)涞鸟詈详P(guān)系,來鑒定未知物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。

    2.5.1 一維核磁分析

    如圖4所示,組分A的氫譜數(shù)據(jù)為δ 0.89(3H,J=7.2,t),δ1.30(4H,m),δ1.45(3H,s),δ1.62(2H,m),δ1.87(3H,J=7.2,d),δ2.44(1H,J=18.0,11.8,dd),δ2.60(1H,J=18.0,7.2,dt),δ2.67(1H,J=17,4,dd),δ3.01(1H,J=18,7.2,dt),δ3.23(1H,m),δ3.67(1H,J=13.2,d),δ4.72(1H,J=12.6,d),δ5.06(1H,J=12.6,d),δ5.27(1H,s),δ5.90(1H,J=15.4,d),δ6.50(1H,J=22.4,7.2,dt)。組分A的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9,δ17.7,δ18.5,δ22.4,δ22.8,δ29.4,δ31.2,δ42.9,δ54.9,δ63.8,δ83.2,δ103.3,δ114.0,δ124.4,δ135.4,δ150.8,δ160.5,δ169.5,δ189.8,δ202.5。結(jié)合氫譜和碳譜的數(shù)據(jù),可知組分A有21個(gè)碳原子,26個(gè)氫原子,其相對(duì)分子質(zhì)量為358,所以可知組分A的分子式為C21H26O5。

    組分B的氫譜數(shù)據(jù)為δ0.89(3H,J=7.2,t),δ1.16(3H,s),δ1.28(4H,m),δ1.58(2H,m),δ1.86(3H,J=7.2,d),δ2.10(1H,J=20,12.2,dd),δ2.40(3H,m),δ2.60(2H,m),δ2.97(1H,J=17,d),δ4.76(1H,J=12.4,d),δ5.01(1H,J=12.4,d),δ5.22(1H,s),δ5.89(1H,J=15.4,d),δ6.47(1H,J=22.4,7.2,dt)。組分B的碳譜數(shù)據(jù)為δ13.9,δ18.4,δ19.9,δ22.4,δ23.5,δ31.4,δ32.6,δ39.4,δ42.0,δ43.2,δ64.0,δ74.1,δ103.4,δ113.0,δ124.7,δ134.7,δ152.5,δ160.4,δ197.9,δ210.1。組分B有20個(gè)碳原子,28個(gè)氫原子,其相對(duì)分子質(zhì)量為332,所以可知組分B的分子式為C20H28O4。組分A和組分B可能為紅曲素和Monaphilone B,但部分氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]存在差異,且最大吸收波長不一致,推測(cè)組分A和組分B有可能分別為紅曲素和Monaphilone B的同分異構(gòu)體,將進(jìn)一步采用二維核磁分析以確定組分A與組分B的分子結(jié)構(gòu)。

    2.5.2 二維核磁分析

    根據(jù)碳譜數(shù)據(jù),組分A有20個(gè)碳核,分別以1~20編號(hào),但C8有裂峰,實(shí)際有2種碳,分別編號(hào)為C8a和C8b。根據(jù)化學(xué)位移可知,C12、C13、C14、C15、C16和C17為雙鍵上的碳,C18、C19和C20為羰基碳。結(jié)合HSQC圖譜(圖5),H1與C1相連,H2與C4,C7相連,H3與C2相連,H4與C5相連,H5與C3相連,H6與C6相連,H7a與C8a相連,H7b與C6相連,H8與C8a相連,H9與C8b相連,H10與C9相連,H11、H12與C10相連,H13與C12相連,H14與C14相連,H15與C15相連,C11、C13、C16、C17、C18、C19、C20沒有氫原子與之相連。H11和H12為C10上的2個(gè)氫,H6和H7b為C6上的2個(gè)氫,H7a和H8為C8a上的2個(gè)氫。

    分析A的HMBC圖譜,可知H3與C8b、C11和C19耦合,表明C8b、C11和C19為C2的鄰位碳和間位碳;H7a、H8與C5、C7和C20耦合,所以戊烷基與羰基(C20)相連;H9與C6、C9、C11、C19和C20耦合;H10與C6、C8b、C18和C20耦合,C6、C8b、C18和C20為C9的鄰位碳和間位碳。H11、H12與C13、C16、C17和C19耦合,H13與C6、C10、C13、C14、C16、C17和C9耦合。

    結(jié)合組分A的氫譜、碳譜、COSY譜、HSQC譜和HMBC譜,以及二維核磁數(shù)據(jù)(表2),最終確定組分A為紅曲素,分子結(jié)構(gòu)圖如圖6所示。

    與組分A二維核磁的分析方法相同,對(duì)組分B的COSY譜、HSQC譜和HMBC譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

    根據(jù)組分B的二維核磁數(shù)據(jù)(表3),最終確定該組分為Monaphilone B,分子結(jié)構(gòu)圖如圖7所示。

    2.6 紅曲黃色素分子結(jié)構(gòu)對(duì)其吸收波長的影響

    分離得到的紅曲素與Monaphilone B經(jīng)紫外-可見光分光光度計(jì)在200~600 nm波長范圍進(jìn)行全波長掃描,紅曲素的最大吸收波長為235和394 nm,Monaphilone B的最大吸收波長為235和389 nm(圖8),與HPLC檢測(cè)結(jié)果一致。

    根據(jù)分子結(jié)構(gòu)式可知,紅曲素與Monaphilone B的主體結(jié)構(gòu)基本一致,是1個(gè)具有延伸共軛雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)(圖9)。

    根據(jù)α,β-不飽和酮的吸收規(guī)則[25]可以推算紅曲黃色素組分的最大吸收波長λmax:推理過程如下,α,β-不飽和酮的基本吸收波長為215 nm,該結(jié)構(gòu)上增加了2個(gè)共軛雙鍵,增量為30×2 nm;且延伸的2個(gè)共軛雙鍵在同1個(gè)環(huán)內(nèi),故吸收波長增加39 nm;由于α位點(diǎn)、β位點(diǎn)和ζ位點(diǎn)均有烷基取代,所以吸收波長分別增加10、12 nm和18 nm;δ位點(diǎn)上存在1個(gè)烷氧基取代,所以吸收波長增加31 nm;紅曲素分子中存在1個(gè)內(nèi)酯五元環(huán)與α,β-不飽和酮六元環(huán)連接,故吸收波長增加6 nm,因此紅曲素理論最大吸收波長為391 nm,與實(shí)測(cè)吸收波長394 nm基本吻合,而Monaphilone B分子結(jié)構(gòu)中沒有內(nèi)酯結(jié)構(gòu),所以其理論最大吸收波長為385 nm,與實(shí)測(cè)吸收波長389 nm基本吻合。紅曲素和Monaphilone B同時(shí)在235 nm處有強(qiáng)吸收,根據(jù)紅曲素在235 nm處存在1個(gè)強(qiáng)吸收,根據(jù)共軛多烯類化合物的吸收規(guī)則[25],紅曲素和Monaphilone B中鏈狀共軛二烯基本吸收值為217 nm,由于存在2個(gè)烷基取代和1個(gè)烷氧基取代,分別增加5×2 nm和6 nm,所以理論最大吸收波長為233 nm,與實(shí)測(cè)波長235 nm基本一致。

    3 結(jié)論

    本研究從發(fā)酵液的粗提物中萃取得到高色價(jià)的紅曲黃色素油樹脂,以高效液相色譜為分離純化,其色價(jià)高達(dá)9 100 U/g,萃取率為63.50%,具有較高的應(yīng)用價(jià)值。分析型高效液相色譜最佳分離條件為80%甲醇等度洗脫,流速為0.5 mL/min下,在液態(tài)發(fā)酵紅曲黃色素中檢測(cè)出2種主要色素組分,色素組分之間分離度為2.51,且不受雜質(zhì)峰影響,分離效果較好。制備型高效液相色譜最佳的分離條件為70%甲醇等度洗脫,流速為4 mL/min,2種組分純度分別為98.95%和99.02%,達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)品的要求(>97%)。通過液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振分析,最終確定分離得到的2種色素組分為紅曲素(C21H26O5)和Monaphilone B(C20H28O4),發(fā)酵液的粗提物中的紅曲黃色素主要色素組分為紅曲素,紅曲黃色素的顯色性能來自于分子結(jié)構(gòu)中具有延伸雙鍵的α,β-不飽和酮結(jié)構(gòu)。

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