紅腐乳發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)與風(fēng)味相關(guān)性研究進(jìn)展

張雅婷，孫娜，于寒松，朱先明，朱世杰，任大勇*

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春，130118) 2(長春市朱老六食品股份有限公司，吉林 長春，130500)

腐乳(sufu)又名豆腐乳、霉豆腐等，是一種利用微生物法改變植物蛋白風(fēng)味的傳統(tǒng)大豆發(fā)酵制品[1],至今已有一千多年歷史。20 世紀(jì)50 年代前，釀造腐乳主要利用野生微生物培養(yǎng)毛坯；60 年代，應(yīng)用純毛霉菌種進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；70 年代，應(yīng)用曲類(紅曲霉、米曲霉)參與后期發(fā)酵，稱“曲系應(yīng)用發(fā)酵期”[2]；80年代，食用菌類(蘑菇、平菇、猴頭菇等)、花莖類(玫瑰花、桂花、生姜、人參)、曲類(豆曲、米曲、醬曲)、禽畜類(雞、火腿、水產(chǎn)類蝦子、蝦仁等)應(yīng)用于后期發(fā)酵,形成了各具特色的風(fēng)味腐乳；90年代,開始發(fā)展多菌種(毛霉、根霉、曲霉、酵母、小球菌等)及復(fù)合酶制劑釀造腐乳,進(jìn)入了“生物技術(shù)應(yīng)用期”，為腐乳發(fā)酵技術(shù)的研究與發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。

由于后期發(fā)酵過程中灌制的湯料不同，形成了各具特色的風(fēng)味腐乳，根據(jù)腐乳的風(fēng)味可分為紅腐乳、白腐乳、青腐乳等。其中紅腐乳就是在湯料中加入了紅曲、面曲等,使紅腐乳呈現(xiàn)出鮮明的紅色。在紅腐乳發(fā)酵前期，主要是毛霉等微生物的生長發(fā)育期，豆腐坯周圍布滿菌絲，同時分泌各種酶，使豆腐中少量淀粉糖化和蛋白質(zhì)逐步降解；發(fā)酵后期，毛霉、根霉與其他微生物共同發(fā)酵，經(jīng)過復(fù)雜的生物化學(xué)變化，將蛋白質(zhì)分解為胨、多肽和氨基酸等物質(zhì)，同時生成一些有機(jī)酸、醇類和酯類等，賦予紅腐乳特有的風(fēng)味[3-4]。近幾年，隨著測序技術(shù)和組學(xué)理論的快速發(fā)展，對紅腐乳發(fā)酵過程中微生物菌落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律與產(chǎn)品風(fēng)味之間的相關(guān)性有了更深入的了解，使得通過微生物調(diào)控技術(shù)來改善發(fā)酵工藝、提高產(chǎn)品風(fēng)味穩(wěn)定性成為可能。本文就紅腐乳發(fā)酵過程中微生物對風(fēng)味影響進(jìn)行了綜述。

1 腐乳中的微生物組成

由于地域和民族習(xí)俗不同，導(dǎo)致我國不同地區(qū)的腐乳使用的發(fā)酵菌種也有所不同。目前國內(nèi)應(yīng)用于腐乳生產(chǎn)的菌種大多為絲狀真菌(毛霉、根霉)和酵母菌，也有少數(shù)腐乳使用細(xì)菌發(fā)酵[5]，如黑龍江克東腐乳使用藤黃小球菌作發(fā)酵劑。由于傳統(tǒng)腐乳發(fā)酵是在開放式條件下進(jìn)行的，除主要生產(chǎn)菌種外，還有其他微生物參與發(fā)酵[6-8](見表1)，因此造就了腐乳中微生物群落的復(fù)雜性和多樣性。目前并不清楚這些微生物在腐乳發(fā)酵過程中所起到的具體作用，但有研究表明，這些復(fù)雜的微生物群落對腐乳風(fēng)味的形成起著十分重要的作用。

1.1 腐乳中的微生物組成

1.1.1 毛霉

毛霉是腐乳生產(chǎn)過程中的常用菌種，用于腐乳生產(chǎn)的毛霉主要有五通橋毛霉、腐乳毛霉、總狀毛霉、雅致放射毛霉、高大毛霉等。毛霉在腐乳生產(chǎn)過程中能釋放豐富的蛋白水解酶及其他有益酶系[9]，在α-淀粉酶的作用下將豆腐中少量淀粉轉(zhuǎn)化成糖；所含蛋白酶、肽酶可分解原料中的蛋白質(zhì)，從而生成胨、多肽和氨基酸，是一種賦予腐乳營養(yǎng)和風(fēng)味的重要途徑[10-11]。此外，毛霉可在腐乳坯表層均勻覆蓋 0.1～0.2 cm的嫩滑皮膜，賦予產(chǎn)品良好的外形及獨(dú)特的柔糯、細(xì)膩、潤滑的質(zhì)地，提高了產(chǎn)品的感官品質(zhì)。

1.1.2 根霉

用于腐乳生產(chǎn)的根霉主要有米根霉、華根霉、無根根霉等。根霉與毛霉同屬毛霉科，親緣很近，形態(tài)相似，分泌酶系類似。因此，這2種微生物在腐乳中的作用相似。不同的是，相比于毛霉適宜生長溫度偏低、受季節(jié)性限制等特點(diǎn)，現(xiàn)用的一些根霉呈現(xiàn)耐高溫的特性，在37 ℃環(huán)境下生長良好[12]。

1.1.3 酵母

酵母菌由于細(xì)胞內(nèi)部含有豐富的酶系、蛋白質(zhì)和維生素，被用作提高腐乳風(fēng)味、縮短腐乳發(fā)酵周期的菌種。傳統(tǒng)發(fā)酵需4～6 個月，添加酵母菌后，生產(chǎn)周期縮短為60 d[13]。此外，也可添加酵母發(fā)酵產(chǎn)物來改善腐乳的風(fēng)味，如曾衛(wèi)國等[14-15]在腐乳發(fā)酵中添加酵母抽提物，有效的提高了產(chǎn)品中的呈鮮味物質(zhì)次黃嘌呤核苷酸(IMP)和鳥嘌呤核苷酸(GMP)。

1.1.4 細(xì)菌

細(xì)菌型腐乳生產(chǎn)用菌大多為藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌等。細(xì)菌在腐乳發(fā)酵過程中的作用與霉菌相似，利用細(xì)菌生長繁殖過程中分泌的酶使蛋白質(zhì)分解，淀粉糖化。不同的是細(xì)菌發(fā)酵沒有菌絲，不能在腐乳坯體表面形成堅韌細(xì)膩的菌膜，因此產(chǎn)品外形較差，成為制約開發(fā)細(xì)菌型腐乳的重要限制條件。但細(xì)菌的發(fā)酵能力強(qiáng)，分泌的蛋白酶等酶活力較高且積累量大，氨基酸生成率較高，最終賦予腐乳鮮美醇厚、后味綿長的風(fēng)味[16]。

1.2 腐乳不同發(fā)酵階段的微生物變化

腐乳發(fā)酵期間，前發(fā)酵中，白坯、晾曬期和腌坯期的微生物變化較大，其中菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)、乳酸菌數(shù)以及真菌數(shù)(毛霉，根霉等)都隨著發(fā)酵時間呈上升趨勢，分別達(dá)到5.10、5.01、4.94、4.54 lg CFU/g，在晾曬期，菌落總數(shù)、芽孢桿菌數(shù)和毛霉、酵母達(dá)到頂峰，分別為9.11、8.87、7.77 lg CFU/g，而乳酸菌數(shù)在腌坯期達(dá)到最大值8.28 lg CFU/g，之后由于食鹽鹽漬微生物數(shù)量明顯下降，表明食鹽對真菌及一些其他微生物有較強(qiáng)的抑制作用；當(dāng)加入湯料進(jìn)行后發(fā)酵時，細(xì)菌總數(shù)在早熟期(5～10 d)逐漸降低至約5.7 lg CFU/g，并在成熟10 d后穩(wěn)定且稍微升高，蠟狀芽孢桿菌保持在3 lg CFU/g以下，乳酸菌數(shù)逐漸降低至<2 lg CFU/g，在成熟20和30 d后，腸桿菌科和真菌降低至不可檢測的水平[5,17]。

2 腐乳中的風(fēng)味成分

風(fēng)味是區(qū)別腐乳的一種重要感官特征，其研究對穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量和提高產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。盧靖等[18]利用固相微萃取法結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法分析了腐乳發(fā)酵過程中的揮發(fā)性風(fēng)味成分，結(jié)果顯示腐乳中主要風(fēng)味物質(zhì)是酯類、酸類、醛類、酮類、醇類以及烴類；也有學(xué)者對不同品牌的腐乳風(fēng)味成分進(jìn)行了分析，結(jié)果均顯示酯類、醇類、酮類、醛類和 烴類是腐乳生產(chǎn)過程中主要的風(fēng)味物質(zhì)[19-21]。這些風(fēng)味物質(zhì)在腐乳發(fā)酵時期起到至關(guān)重要的作用，本文對不同品牌和不同品種的紅腐乳風(fēng)味成分進(jìn)行了總結(jié)，如表2所示。

注：“+”檢出；“-”未檢出。

2.1 腐乳不同發(fā)酵階段的風(fēng)味變化

2.1.1 酯類

酯類是通過有機(jī)酸和醇類酯化反應(yīng)生成的，被公認(rèn)為腐乳中最重要的風(fēng)味成分，占揮發(fā)性物質(zhì)種類總數(shù)的34%。白坯中檢測出6種酯類物質(zhì)，含量較低；經(jīng)毛霉發(fā)酵形成毛坯后，增加到22 種，相對含量也隨之升高；腌坯過程由于輔料加入，烴類、醛類等物質(zhì)含量升高，酯類物質(zhì)含量明顯降低；后發(fā)酵階段，坯體中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)降解以及生成的產(chǎn)物與輔料中的化學(xué)物質(zhì)的協(xié)同作用使酯類物質(zhì)不斷豐富，主要有乙酸乙酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、戊酸乙酯等，為腐乳提供了果香味和奶油香味等風(fēng)味[22-23]。

2.1.2 醇類

醇的種類和含量與外界添加有關(guān)，在腌制時常常添加乙醇來增加其種類和含量。紅腐乳發(fā)酵過程中鑒定出12 種醇類物質(zhì)(乙醇、戊醇、己醇和苯乙醇等)：白坯中僅有3種；毛坯和腌坯中由于真菌和細(xì)菌的代謝，醇類增多；后發(fā)酵醇類含量開始降低，因為其發(fā)生酯化反應(yīng)或氧化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)，賦予腐乳酒香味、玫瑰香味以及香草味等風(fēng)味[24]。

2.1.3 醛類

醛類是通過氨基酸的Strecker降解以及酯類物質(zhì)過氧化和降解2條途徑產(chǎn)生的。腐乳中鑒定出的醛類主要有正己醛、苯乙醛、壬醛、反式-2-壬烯醛等。發(fā)酵前期白坯中醛類物質(zhì)風(fēng)味含量為69.55%，中期經(jīng)毛霉菌株發(fā)酵后相對含量迅速降低至7.92%，后期發(fā)酵階段則呈現(xiàn)不斷增長的趨勢，后期發(fā)酵36 d相對含量增長至16.7%。其中，正己醛含量高達(dá)51.45%；隨著腌制與后發(fā)酵的進(jìn)行，其含量先降低后升高，這可能與輔料的加入以及不飽和脂肪酸的氧化有關(guān)，賦予腐乳甜味、水果味、堅果味以及焦糖味等風(fēng)味[25]。

2.1.4 酮類

酮類化合物是脂肪和氨基酸在毛霉分泌的酶系的降解作用或者是美拉德反應(yīng)作用下產(chǎn)生的。腐乳發(fā)酵過程中酮類物質(zhì)含量相對較低，主要有2-庚酮、甲基庚烯酮、2-壬酮、1-辛烯-3-酮等，賦予腐乳香辣味、桂皮味、花香味、草本味及水果味等[26-27]。

2.1.5 烴類

腐乳中烴類物質(zhì)主要有烯烴和烷烴兩大類，其中烷烴含量較低，貢獻(xiàn)較小；烯烴類物質(zhì)從白坯到毛坯，含量由6.52%降到3.2%，隨著發(fā)酵時間的延長，其含量降至1.04%，可能是由于其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定易氧化造成的。其中蒎烯的松節(jié)油氣味、異松油烯的松木樹脂氣味等，均對腐乳的風(fēng)味有一定的貢獻(xiàn)[28-29]。

2.2 不同品牌腐乳中的風(fēng)味成分

地區(qū)的差異性導(dǎo)致環(huán)境中微生物的不同，產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)各不相同。閆平平等[30]研究了鼎豐、王致和腐乳的風(fēng)味成分差異性，其中王致和腐乳檢出醛類11 種、酮類4 種、酯類24 種、醇類7 種、呋喃類1 種、吡嗪類2 種、其他類5 種；鼎豐腐乳中檢出醛類15 種、酮類4 種、酯類27 種、醇類6 種、呋喃類1 種、其他類3 種。劉娜等[25]在測定紅腐乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中得出，咸亨腐乳中醇類4種、酯類13種、萜烯類5種、雜環(huán)類1種、醛類5種、烯烴類1種、酚類1種、烴類2種、酮類1種；老才臣腐乳中醇類6種、萜烯類18種、酯類11種、雜環(huán)類2種、酚類1種、醛類6種、酮類3種、烯烴類1種；王致和腐乳中醇類4 種、酯類14 種、萜烯類10 種、雜環(huán)類2 種、醛類5 種、酮類3 種、烯烴類 3種、酚類1 種、烴類1 種。圖1比較了王致和、鼎豐、老才臣、咸亨4種腐乳風(fēng)味，可以看出酯類、酮類、醛類、醇類為共有風(fēng)味物質(zhì)。

圖2顯示，共鑒定出63 種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類27 種(共有風(fēng)味6 種：乙酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、丙酸乙酯、十六酸乙酯)、醇類9 種(共有2 種：1-辛烯-3-醇、苯乙醇)、醛類11 種(共有2 種：苯甲醛、3-甲基丁醛)、酮類6 種(共有1 種：2-庚酮)、雜環(huán)化合物2 種(共有1 種：2-戊基呋喃)、烴類8 種、酚類2 種，王致和腐乳中醇類含量達(dá)57.01%，高于其他3種腐乳含量，酒香最為明顯；老才臣和咸亨腐乳中的風(fēng)味物質(zhì)(酯、醛、酮、酸等)含量相似，其中老才臣腐乳中萜烯物質(zhì)含量(茴香腦)遠(yuǎn)高于其余3種腐乳含量，說明老才臣生產(chǎn)中使用辛香料用量要大于其余腐乳中的辛香料用量；另外咸亨腐乳酯類物質(zhì)含量高于其余3種腐乳含量，甜香濃厚，這些區(qū)別使得4種腐乳香氣各有不同。

3 菌群結(jié)構(gòu)與風(fēng)味物質(zhì)的關(guān)系

腐乳發(fā)酵過程中，微生物通過合成代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)，并產(chǎn)生相關(guān)的酶將原料中的大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子風(fēng)味物質(zhì)。腐乳發(fā)酵過程中霉菌大量繁殖，酶系分泌活躍，能分泌各種酶系(蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、肽酶等)，蛋白酶和肽酶使大豆蛋白水解成短肽和游離氨基酸,游離氨基酸在腐乳風(fēng)味中有巨大的貢獻(xiàn)[7,31-32]，前發(fā)酵中白坯到毛坯階段，谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸以及賴氨酸含量增長迅速，其中苯丙氨酸和亮氨酸代謝形成2-苯乙醇和3-甲基丁醇。脂肪酶可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng),在腐乳前發(fā)酵階段，脂肪酶降解豆腐坯中粗脂肪的能力加快，在腌坯階段由于輔料的添加使酶活力下降，游離脂肪酸生成速度隨之下降，在后發(fā)酵期由于酶活力的回升和后酵時間延長，游離脂肪酸總量逐步增加，醇類(乙醇、2-苯乙醇和3-甲基丁醇)的添加與脂肪酸(亞油酸、棕櫚酸、油酸)通過酯化反應(yīng)形成相應(yīng)的酯類(己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯和癸酸乙酯等)，同時酸類物質(zhì)也出現(xiàn)明顯的增加[17,33-37]。

腐乳在前發(fā)酵階段葡萄球菌屬、未分類細(xì)菌和未分類的明串珠菌屬占優(yōu)勢，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬占主導(dǎo)地位。其中乳桿菌屬、假單胞菌屬都與脂肪酸類、酯類物質(zhì)具有很強(qiáng)的相關(guān)性，因為這些菌在代謝過程中產(chǎn)生乙酸、丙酸、乳酸等，而這些酸又是長鏈脂肪酸和酯的合成前體物質(zhì)，乳桿菌屬在發(fā)酵過程中分解糖的能力較強(qiáng)，它消耗葡萄糖和果糖產(chǎn)生有機(jī)酸，其與乳酸呈正相關(guān)，同時乳桿菌屬生長使環(huán)境偏酸，從而能夠抑制腐敗性菌的生長，在發(fā)酵過程中具有一定的防腐作用；乳桿菌和酵母菌協(xié)同代謝出可發(fā)酵糖，產(chǎn)生乙醇、乳酸、乙酸等產(chǎn)物并結(jié)合成乳酸乙酯和乙酸乙酯等呈香物質(zhì)；部分乳桿菌屬和明串珠菌屬發(fā)酵后能轉(zhuǎn)化糖生成雙乙酰、乙酰甲基原醇和3-羥基丁酮等芳香成分；此外，有的乳酸菌可將蛋白質(zhì)分解成肽和氨基酸，賦予食品獨(dú)特的風(fēng)味；假單孢菌屬能分解蛋白和脂肪，產(chǎn)生一些風(fēng)味前體物質(zhì)，它屬于嚴(yán)格的好氧菌，隨著發(fā)酵的進(jìn)行含氧量降低以及酸度增加，其豐度逐漸降低。芽孢桿菌屬也與酯類物質(zhì)有較強(qiáng)的相關(guān)性，芽孢桿菌屬在發(fā)酵過程中豐度不斷降低，因為芽孢桿菌多為好氧菌，在發(fā)酵前期氧氣量充足的情況下能夠很好生長，隨著發(fā)酵進(jìn)行，含氧量降低逐漸抑制了芽孢桿菌的生長，豐度逐漸下降，而且發(fā)酵后期酒精度升高也會抑制芽孢桿菌的生長，芽孢桿菌屬在腐乳后發(fā)酵階段產(chǎn)生醇類、酯類等風(fēng)味物質(zhì)也是腐乳重要的組成風(fēng)味；四聯(lián)球菌與胍基乙酸鹽，苯丙氨酸，色度和pH顯著相關(guān)；假單胞菌與2種碳水化合物(葡萄糖和阿拉伯糖)和8種含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，高絲氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸，苯丙氨酸和焦谷氨酸)以及pH顯著相關(guān)；鏈球菌與6種碳水化合物(甘油，阿拉伯糖，乙酸，核糖，果糖和乳酸)和8種含氮化合物(谷氨酸，丙氨酸，纈氨酸，蘇氨酸，胍基乙酸，天冬氨酸，甘氨酸和苯丙氨酸)以及色度和pH顯著相關(guān)[16,38-40]；圖3清楚的表明腐乳發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化主要與細(xì)菌和霉菌有較強(qiáng)的相關(guān)性，同時腐乳菌群結(jié)構(gòu)也是影響風(fēng)味物質(zhì)變化的本質(zhì)原因。

4 展望

當(dāng)前對不同地區(qū)、不同品牌腐乳中的菌群結(jié)構(gòu)與風(fēng)味物質(zhì)間關(guān)系的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，但仍有諸多問題亟待回答，如腐乳體系中獨(dú)特的菌群結(jié)構(gòu)是如何形成的，又是如何影響產(chǎn)品風(fēng)味的？有哪些微生物起到了關(guān)鍵的成味作用？不同微生物間的互作機(jī)制是什么？腐乳基質(zhì)條件下核心微生物的代謝途徑是否有別于其他環(huán)境？對于這些問題的探索將有助于開發(fā)優(yōu)良發(fā)酵劑，實現(xiàn)定向利用微生物調(diào)控技術(shù)提高產(chǎn)品品質(zhì)和穩(wěn)定性，從而為開發(fā)傳統(tǒng)腐乳產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)新技術(shù)奠定基礎(chǔ)。