油樟內(nèi)生細(xì)菌分離及α-松油醇高產(chǎn)菌株的篩選與誘變

黃金鳳，王鑫，梁玉娟，楊立艷，羅思燦，鄒月，魏琴*，梁寒峭

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039) 2(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 3(北京城市學(xué)院 生物醫(yī)藥學(xué)部，北京，100094)

油樟[Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N．Chao]屬樟科常綠喬木，是中國(guó)特有經(jīng)濟(jì)樹種，主產(chǎn)于四川省宜賓市[1]。油樟植株根、莖、葉、果實(shí)均可用于提煉精油，其葉為主要產(chǎn)油器官，含油量高達(dá)3.8%～4.5%[2-3]。油樟油富含幾十種不同沸點(diǎn)的物質(zhì)成分，其中α-松油醇為其主成分之一，相對(duì)含量在10%以上。α-松油醇作為食品添加劑，除具有類似紫丁香的宜人香氣，還具有各種生物和藥物特性，如抗氧化、抗癌、抗驚厥、抗?jié)?、抗腹瀉等，被認(rèn)為是最常用的香料化合物之一[4-6]。α-松油醇存在于多種植物精油中，但物質(zhì)含量較低，從植物源獲取α-松油醇需克服植物生長(zhǎng)周期問題，考慮植被破壞、廢渣污染等影響，所得α-松油醇也難以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，因此，實(shí)際使用的α-松油醇主要通過化學(xué)合成松油醇后再精制而得。目前，工業(yè)合成松油醇分為一步法與二步法，通過無(wú)機(jī)液體酸(H2SO4、H3PO4等)為催化劑，催化工業(yè)蒎烯或松節(jié)油水合合成松油醇[7-9]。其中，二步法所得松油醇純度較高、香氣較正但工藝繁瑣，成本高昂，一步法雖較為簡(jiǎn)單，但所得松油醇香氣較差。工業(yè)合成松油醇雖能滿足市場(chǎng)需求但其香味不及天然松油醇純正，且生產(chǎn)工藝以無(wú)機(jī)酸為催化劑，加重環(huán)境污染，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，增加生產(chǎn)成本[7,10]。近年食品安全問題關(guān)注度逐年增長(zhǎng)，被譽(yù)為“食品工業(yè)靈魂”的食品添加劑成為眾矢之的，合成的香精香料與人們對(duì)天然風(fēng)味物的追求已不相適應(yīng)[11]。

植物內(nèi)生菌指生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部的微生物，可通過組織學(xué)方法從表面嚴(yán)格消毒的植物組織中分離出來(lái)。經(jīng)報(bào)道，許多內(nèi)生菌由于與宿主的長(zhǎng)期共處，與后者形成了互利共生關(guān)系[12-13]；部分內(nèi)生菌可以產(chǎn)生與宿主細(xì)胞相同或相近的活性物質(zhì)[14]，分離培養(yǎng)植物內(nèi)生菌可為獲取其宿主植物活性物質(zhì)提供新思路。王濤等[15-16]從油樟植株分離內(nèi)生細(xì)菌和芽孢內(nèi)生細(xì)菌，根莖葉共分離203株內(nèi)生細(xì)菌和40株芽孢內(nèi)生細(xì)菌，其中葉的分離量均不超過20株，未能充分挖掘油樟葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性。本研究擬采用3種(組織塊、研磨、中和劑)處理方法分離油樟葉內(nèi)生細(xì)菌，旨在獲取更豐富的內(nèi)生細(xì)菌資源；并對(duì)α-松油醇高產(chǎn)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選及誘變育種，為進(jìn)一步開發(fā)利用高產(chǎn)菌株生產(chǎn)α-松油醇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來(lái)源

根據(jù)前期研究結(jié)果，以宜賓市高縣月江森林經(jīng)營(yíng)所紅巖山油樟母本園中油樟產(chǎn)油率和成分相對(duì)含量存在差異的5株油樟株系葉片為材料(表1)。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(tryptose soya agar,TSA)、卵磷脂吐溫-80營(yíng)養(yǎng)瓊脂均為成品培養(yǎng)基，杭州百思生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒、PCR通用引物(27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3’；1492R：5’ -ACGGT TACCTTGTTACGACTT -3’),上海生工生物工程公司提供和合成；中和劑：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%甘氨酸，體積分?jǐn)?shù)3%吐溫-80，磷酸緩沖液(0.1 mol/L pH 7.2)；乙醇、NaClO、MgSO4為分析純、二氯甲烷為色譜純,成都科隆化學(xué)品有限公司；

1.2 方法

1.2.1 油樟葉表面消毒處理

1～5號(hào)油樟葉于流水沖洗10 min后，在無(wú)菌條件下按無(wú)菌水2次(30 s/次)→體積分?jǐn)?shù)75%乙醇2 min→無(wú)菌水2次(30 s/次)→體積分?jǐn)?shù)2% NaClO(按有效氯含量計(jì)算)5 min→無(wú)菌水4～5次(30 s/次)程序進(jìn)行表面消毒，備用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置漂洗對(duì)照、印記對(duì)照和環(huán)境對(duì)照。

1.2.2 中和劑濃度的篩選

無(wú)菌條件下，稱取1 g經(jīng)消毒的油樟葉于無(wú)菌研缽中，剪碎，依次添加體積分?jǐn)?shù)為0，10%，30%，50%，70%，90%經(jīng)121 ℃滅菌15 min的中和劑9 mL，充分研磨，各取200 μL接種LB培養(yǎng)基，重復(fù)3次，36 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察出菌情況，篩選最適中和劑濃度。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離

無(wú)菌條件下，取表面徹底消毒的1～5號(hào)油樟葉片，吸干表面水分，(1)用無(wú)菌鑷子和剪刀裁去油樟葉葉柄及組織邊緣，沿著葉脈將其剪成0.5～1 cm的組織塊，備用；(2)稱取1g油樟葉于無(wú)菌研缽中，剪碎后加入9 mL無(wú)菌蒸餾水，充分研磨，備用；(3)稱取1g油樟葉于無(wú)菌研缽中，剪碎后加入9 mL最適濃度中和劑，充分研磨，備用。將上述組織塊及研磨液分別接種LB、TSA和卵磷脂吐溫-80營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，組織塊每皿接種5片，研磨液每皿接種200 μL，設(shè)置5個(gè)重復(fù)，36 ℃恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察出菌情況并計(jì)數(shù)。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌分子鑒定

按同方法同樣本同培養(yǎng)基原則挑取特征菌落于液體培養(yǎng)基，36 ℃、140 r/min培養(yǎng)12 h。按細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系為：12.5 μLTaqPCR Master Mix (2x)，1 μL DNA模板，1 μL 10 μmol/L 引物27F，1 μL 10 μmol/L 引物1492R，用Sterilized ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；30個(gè)循環(huán)94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，測(cè)定序列提交GenBank進(jìn)行Blast同源性匹配。

1.2.5 α-松油醇高產(chǎn)菌株的篩選

樣品制備：油樟葉內(nèi)生細(xì)菌接種至40 mL LB液體培養(yǎng)基，36 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng)12 h。將二氯甲烷與菌液按1∶1(mL∶mL)混合，超聲破碎20 min后充分混勻，靜置。取有機(jī)相，添加適量無(wú)水MgSO4，靜置過夜。吸取1 mL二氯甲烷萃取液，0.22 μm 微孔濾膜過濾，進(jìn)行GC-MS(安捷倫7890A-5975C)分析檢測(cè)。

GC條件：HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣(He)；流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度220 ℃；柱溫60 ℃用于0 min，然后10 ℃/min 到190 ℃，保持 2 min，5 ℃/min 到 210 ℃保持2 min，然后 10 ℃/min 到 220 ℃保持 8 min。運(yùn)行30 min。

MS條件：接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍45～300 u。

1.2.6 α-松油醇高產(chǎn)菌株的誘變選育

將α-松油醇高產(chǎn)菌株按10倍梯度用PBS緩沖液稀釋到適當(dāng)菌種濃度后，取100 μL涂布LB培養(yǎng)基，放置帶菌平板于30 W、30 cm紫外燈處，進(jìn)行紫外誘變。誘變以30 s為時(shí)間間隔，隨后36 ℃避光倒置培養(yǎng)12 h，計(jì)算致死率。挑取誘變菌株接種LB液體培養(yǎng)基，36 ℃，140 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，制樣，進(jìn)行GC-MS分析檢測(cè)。致死率計(jì)算如公式(1)所示，

(1)

1.2.7 α-松油醇誘變菌株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

對(duì)篩選到的誘變菌株進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，采用平板劃線傳至第5代，測(cè)定子代產(chǎn)α-松油醇的穩(wěn)定性。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，origin 8.0軟件作圖。α-松油醇含量采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑濃度的選擇

如表2所示，隨著中和劑濃度的增大，油樟葉內(nèi)生細(xì)菌分離量呈先上升后下降的趨勢(shì)。在中和劑體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，油樟葉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最高達(dá)到4.9×103CFU/g 葉重。繼續(xù)增大中和劑濃度，油樟葉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量開始遞減，說(shuō)明高濃度下的中和劑對(duì)油樟葉內(nèi)生細(xì)菌的分離存在抑制作用。

2.2 不同處理方法分離油樟葉內(nèi)生細(xì)菌的結(jié)果

3種培養(yǎng)基中，組織塊法接種75皿375片油樟葉組織塊，5 d內(nèi)僅有3.2%組織塊長(zhǎng)出13株內(nèi)生細(xì)菌；研磨法接種75皿，5 d內(nèi)48皿長(zhǎng)出內(nèi)生細(xì)菌181株；在中和劑作用下，接種75皿培養(yǎng)基，5 d內(nèi)51皿長(zhǎng)出內(nèi)生細(xì)菌458株，見表3。3種處理方法分離效果依次為中和劑輔助法>研磨法>組織塊法。研磨法分離內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)大于組織塊植入，可能因?yàn)檠心ヌ幚硎箖?nèi)生細(xì)菌從組織分散到勻漿液，更多內(nèi)生細(xì)菌直接或更快吸收培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)，從而生長(zhǎng)更快。王濤等[15]采用研磨法分離到油樟葉內(nèi)生細(xì)菌13株，少于本實(shí)驗(yàn)研磨法所得數(shù)量，這可能受油樟葉采集季節(jié)、葉齡、樹齡等[17]因素影響，也可能與所用的營(yíng)養(yǎng)瓊脂(nutrient agar,NA)培養(yǎng)基有關(guān)。其次，中和劑輔助分離油樟葉內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于傳統(tǒng)研磨法與組織塊法，這可能是中和劑抑制了油樟油抑菌活性。研究表明[18-19]，3.13～12.50 μL/mL濃度油樟油即可顯著抑制多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，而中和劑的加入可能使得油樟油抑菌活性被抑制。也可能是因?yàn)橹泻陀驼寥~因充分研磨而釋放的黏液，促進(jìn)內(nèi)生細(xì)菌釋放。

注：T1、T2、T3依次代表組織塊法、研磨法、中和劑輔助法；J、M、Z依次為L(zhǎng)B、TSA、卵磷脂吐溫-80營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

2.3 油樟葉內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA鑒定

如表4、表5所示，5株油樟植株共保存176株內(nèi)生細(xì)菌，經(jīng)鑒定分屬于4個(gè)門13個(gè)屬的34個(gè)種。13個(gè)屬包括Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Microbacterium、Micrococcus、Rothia、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria、Virgibacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Chryseobacterium。其中，組織塊法保存10株，分屬于1個(gè)門4個(gè)屬；研磨法保存59株，分屬于3個(gè)門7個(gè)屬；中和劑輔助法保存107株，分屬于3個(gè)門7個(gè)屬。Bacillus和Staphylococcus分別為油樟葉內(nèi)生細(xì)菌第一優(yōu)勢(shì)屬和第二優(yōu)勢(shì)屬，占總量的71.02%和11.36%。

34種油樟葉內(nèi)生細(xì)菌中，Micrococcus、Kocuria和Chryseobacterium僅出現(xiàn)在1號(hào)油樟株系；Rothia僅出現(xiàn)在3號(hào)油樟株系；Microbacterium和Sphingomonas僅出現(xiàn)在4號(hào)油樟株系；Aerococcus、Virgibacillus和Pseudomonas僅出現(xiàn)在5號(hào)油樟株系，這可能與1～5號(hào)油樟植株產(chǎn)油率和1,8-桉葉油素含量差異有關(guān)(表1),有待進(jìn)一步研究。并且,Microbacterium僅用LB培養(yǎng)基分離獲得；Rothia、Sphingomonas和Acinetobacter僅用TSA培養(yǎng)基分離獲得；Micrococcus、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria和Chryseobacterium僅用卵磷脂吐溫-80營(yíng)養(yǎng)瓊脂分離獲得，這可能與該屬油樟葉內(nèi)生細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的專一性有關(guān)。王濤等[15-16]采用NA培養(yǎng)基分離到Paenibacillus油樟葉內(nèi)生細(xì)菌，本實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均未分離到該屬內(nèi)生細(xì)菌，除與培養(yǎng)基有關(guān)，也可能是油樟植株種屬、株號(hào)、季節(jié)等不同造成的。

2.4 α-松油醇高產(chǎn)菌株的篩選結(jié)果

天然的香氣物質(zhì)除來(lái)源植物精油或揮發(fā)油外，微生物是其獲取的另一生物途徑。由圖1可知，34種油樟葉內(nèi)生細(xì)菌通過液體培養(yǎng)后，均可在培養(yǎng)液中檢測(cè)到不同物質(zhì)含量的α-松油醇，其中α-松油醇產(chǎn)量最高的為芽孢桿菌屬(Bacillus)的1株內(nèi)生細(xì)菌，菌株編號(hào)為T3-M-39(圖2)，其α-松油醇產(chǎn)量為1.075 mg/L。將T3-M-39菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變?cè)囼?yàn)。

2.5 紫外誘變時(shí)間的選擇

紫外線具有較高的殺菌能力和誘變能力，隨著照射時(shí)間延長(zhǎng)，培養(yǎng)皿中活菌數(shù)逐漸減少(圖3)。一般認(rèn)為，高劑量誘變(致死率90%以上)引發(fā)的突變范圍更廣，變異菌株更多，但高劑量誘變下回復(fù)突變菌株出現(xiàn)率增大[20]，不利于篩選，且一般認(rèn)為低劑量可以提高正突變率。目前普遍認(rèn)為致死率控制在70%～80%時(shí)的誘變劑量較為合適[21-22]。如圖4所示，從2.5 min開始，T3-M-39菌株紫外誘變致死率超過80%，2 min時(shí)，致死率為74.07%，符合正向突變菌株的理想致死率，故選擇誘變時(shí)間2 min作為最佳誘變時(shí)間。

2.6 突變菌株產(chǎn)α-松油醇能力及遺傳穩(wěn)定性分析

如圖5、圖6所示，出發(fā)菌株T3-M-39經(jīng)紫外誘變處理2 min時(shí)，其正突變率和負(fù)突變率分別為26.04%和14.34%。將出發(fā)菌株T3-M-39作為對(duì)照，經(jīng)紫外誘變后，T3-M-39最優(yōu)正向突變菌株產(chǎn)α-松油醇能力比出發(fā)菌株提高了34.85%，顯著高于出發(fā)菌株(P<0.05)。對(duì)該菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)5代，測(cè)定α-松油醇含量，發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)α-松油醇能力穩(wěn)定，未出現(xiàn)回復(fù)突變菌株。并且，T3-M-39最優(yōu)突變菌株子代產(chǎn)α-松油醇含量保持在1.450 mg/L左右，無(wú)差異顯著性變化(P>0.05)，說(shuō)明該菌株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

α-松油醇作為一種允許使用的食品合成香精香料，廣泛用于食品工業(yè)。然而，通過化工合成的α-松油醇已難以滿足人們對(duì) “綠色”香精香料的需求。生物法生產(chǎn)香精香料是一種模擬天然動(dòng)植物代謝過程的方法，其產(chǎn)物已被歐洲和美國(guó)食品法規(guī)界定為“天然的”[23]。利用微生物采用生物技術(shù)是生產(chǎn)天然香精香料的途徑之一。鑒于內(nèi)生菌的生境特殊性，從植物微生態(tài)系統(tǒng)中篩選與宿主植株存在共代謝作用的功能菌株是獲取菌株材料的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法、研磨法、中和劑輔助法共保存176株內(nèi)生細(xì)菌，鑒定分屬于Bacillus、Lysinibacillus、Staphylococcus、Microbacterium、Micrococcus、Rothia、Aerococcus、Pseudomonas、Kocuria、Virgibacillus、Sphingomonas、Acinetobacter、Chryseobacterium的34個(gè)種。其中，Bacillus為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，這與大多數(shù)其他植物內(nèi)生菌優(yōu)勢(shì)屬研究結(jié)果相似[24]。內(nèi)生芽孢桿菌屬可能較其他內(nèi)生細(xì)菌更易產(chǎn)生宿主植物主要活性物質(zhì)或前體物質(zhì)[25-26]。通過對(duì)34種油樟葉內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)液中α-松油醇含量進(jìn)行GC-MS分析，篩選到1株芽孢桿菌屬高產(chǎn)α-松油醇的內(nèi)生細(xì)菌T3-M-39，說(shuō)明Bacillus內(nèi)生細(xì)菌在與油樟的相互作用中可能發(fā)揮著重要作用。

野生菌株生產(chǎn)能力較低，一般用于生產(chǎn)的菌株需經(jīng)過菌種改良提高生產(chǎn)能力?；蚬こ碳夹g(shù)在菌種選育方面取得了矚目成就，但利用物理或化學(xué)誘變?nèi)匀皇菄?guó)內(nèi)外提高菌種生產(chǎn)能力的重要手段[27]。張建新等[28]采用紫外誘變產(chǎn)β-甘露聚糖酶的黃豆內(nèi)生菌，使其產(chǎn)酶能力較出發(fā)菌株提高了37%。徐婉如[29]對(duì)1株分離自秦艽根部的內(nèi)生真菌QJ18進(jìn)行80 s紫外照射，發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)龍膽苦苷的能力比出發(fā)菌株提高25.2%。本實(shí)驗(yàn)將T3-M-39菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，誘變條件為30 W紫外燈30 cm處照射2 min，其最優(yōu)正向突變菌株α-松油醇產(chǎn)量增至1.451 mg/L，較出發(fā)菌株提高了34.85%，且遺傳穩(wěn)定性良好。說(shuō)明通過紫外誘變方式提高T3-M-39菌株生產(chǎn)α-松油醇是可行的，結(jié)果可為提高α-松油醇產(chǎn)量提供菌株材料，為利用生物法生產(chǎn)α-松油醇奠定基礎(chǔ)。然而本實(shí)驗(yàn)僅采用單一誘變對(duì)菌株進(jìn)行改良，為防止平頂效應(yīng)[30]，還有待于通過多輪復(fù)合誘變或基因工程技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行改造，優(yōu)化發(fā)酵工藝條件以提高α-松油醇產(chǎn)量。