Trichothecium roseum 的酸堿屬性及pH 值對其胞外酶活性和致病性的影響

王振宇，胡慧敏，龔 迪，張國軍，Dov PRUSKY,3，畢 陽,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070；3.以色列農(nóng)業(yè)研究組織凡卡尼中心，中央?yún)^(qū) Bet Dagan 50250）

粉紅單端孢（Trichothecium roseum）是一種重要的采后病原真菌，可侵染蘋果、梨甜瓜、杏、番茄等多種果實[1]。由該病原物引起的心腐病是蘋果果實采后的重要病害[2]，心腐病不僅會導致蘋果的品質(zhì)劣變，還會在果實體內(nèi)產(chǎn)生真菌毒素[3]。通過傷口及自然孔口進入是T. roseum侵染果實的主要途徑[2]，但該病原菌侵染后如何在寄主體內(nèi)擴展尚不明了。

采后真菌在侵染果實的早期，會分泌氨或有機酸來調(diào)控侵染點周邊的pH值，從而營造有利于侵染的微環(huán)境[4]。有些真菌會分泌氨使寄主pH值升高，如Colletotrichum屬真菌侵染鱷梨[5]，Alternaria alternata侵染柿子[6]。有些則會分泌有機酸使寄主pH值降低，如Penicillium expansum和Penicillium digitatum侵染蘋果[7]。由于病原真菌的這些酸化或堿化特性，故將其分為酸化菌與堿化菌兩類。當敲除堿化菌Colletotrichum gloeosporioides分泌氨的基因GDH2時，其對番茄的致病性顯著降低[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境pH值直接調(diào)控了病原真菌胞外酶的分泌與活性。當pH值大于5.8時，C. gloeosporioides開始分泌果膠裂解酶，pH值低于5.7時則不分泌[9]。Phomopsis mangiferae在pH 4時分泌的多聚半乳糖醛酸酶活性顯著高于pH 7[10]。編碼Monilinia fructicola的兩個多聚半乳糖醛酸酶基因MFPG2和MFPG3，在pH 3.6～3.7時的表達量顯著高于pH 4.5[11]。A. alternata分泌的內(nèi)切1,4-β-葡聚糖酶在pH 6時的活性明顯高于pH 4[12]。

雖然已有多種采后病原真菌通過改變宿主pH值影響其致病性的報道，但是T. roseum侵染蘋果后病部pH值如何變化，環(huán)境pH值如何調(diào)控該病原菌的致病力和胞外酶活性卻鮮有報道。本研究以“富士”蘋果為試材，采用T. roseum損傷接種果實，觀察接種果實病斑處的pH值變化，研究3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑的影響，分析損傷接種果實病斑處果膠酶及纖維素酶活性變化。以期明確T. roseum的酸堿特性，為揭示該病原物的部分致病機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試T. roseum由甘肅農(nóng)業(yè)大學采后生物學與技術(shù)實驗室提供。

供試“富士”蘋果于2017年10月采自甘肅省景泰縣國營條山集團蘋果生產(chǎn)基地，選取外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷的果實，單果套網(wǎng)套后入瓦楞紙包裝箱，于當天運抵本實驗室，于常溫（20～25 ℃）、相對濕度70%～80%條件下貯藏待用。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；DHP-9272B型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；CX21FSIC光學顯微鏡 奧林巴斯工業(yè)有限公司；PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；H-1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機有限公司；1510-04087型酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同pH值孢子懸浮液的配制

參照Eshel等[6]方法并修改。先將保存的T. roseum回接到果實上以活化其致病力，將活化分離成功的菌種在25 ℃培養(yǎng)7 d，分別加入pH值為3、5、7的無菌磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液10 mL/皿，用涂布器輕輕刮下培養(yǎng)基表面的孢子，經(jīng)4 層紗布過濾后，將濾液轉(zhuǎn)入50 mL三角瓶中，加入大約0.05% Tween-80后搖勻，在旋渦混合器上振蕩數(shù)秒，使孢子分布均勻，采用血球計數(shù)板法將孢子懸浮液濃度調(diào)至1.0×106spores/mL。

1.3.2 損傷接種

參照李燦嬰等[12]的方法。挑選果形端正、大小均勻、成熟度、色澤一致、無病蟲害和機械傷的果實，用自來水沖洗干凈后自然晾干，再用1%的次氯酸鈉對果實表面進行消毒，晾干后，用70%乙醇棉球?qū)臃N部位進行表面擦拭消毒，然后用滅菌鐵釘于果實中部打4 個深3 mm、直徑3 mm的接種孔?？變?nèi)分別接入上述不同pH值的孢子懸浮液10 μL，以接入等量含0.05% Tween-80的無菌水為對照，稍作晾干后裝入聚乙烯袋中（6 個/袋），于室溫（（22±3）℃）、相對濕度85%～90%下貯藏待測。分別在接種后的0、3、6、9 d和12 d測量病斑直徑，每處理每一時間點用果實20 個，重復3 次。

1.3.3 果實腐爛組織與健康組織pH值的測定

參照Bi Fangchen等[8]方法，用無菌手術(shù)刀取樣組織并在無菌研磨機中研磨，將研磨的組織以10 621×g離心5 min，將上清液用pH計進行測定。每處理每一時間點用果實20 個，重復3 次。

1.3.4 接種部位pH值的維持

參照Eshel等[6]方法，自接種伊始，每隔12 h分別向接種孔中注入pH值為3、5及7的無菌磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，直至取樣結(jié)束。

1.3.5 生化測定取樣

參照李燦嬰等[12]方法。取病斑組織及病健交界處3 mm以內(nèi)的果肉組織。切碎后稱取3 g，鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。每處理每一時間點用果實10 個，重復3 次。

1.3.6 胞外酶活性測定

1.3.6.1 粗酶液的提取

果膠甲基多聚半乳糖醛酸酶（pectin methyl polygalacturonase，PMG）、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、纖維素酶（cellulase，Cx）和β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-Glu）的提取參考劉耀娜等[13]的方法。取3 g冷凍組織，置于預冷的研缽中，加入6 mL預冷的95%乙醇溶液，在冰浴條件下研磨勻漿后，全部轉(zhuǎn)入離心管，然后4 ℃、10 000×g離心10 min，傾去上清液，向沉淀物中再加入3 mL預冷的80%乙醇溶液，振蕩，低溫放置10 min，然后在相同條件下離心，再傾去上清液，向沉淀物中加入5 mL預冷的提取緩沖液，于4 ℃放置提取20 min，再經(jīng)過離心后收集上清液即為粗酶液。

果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）粗酶液的提取參照Hagerman等[14]方法并修改。取3 g冷凍組織，置于冰浴的研缽中，加入5 mL 8.8% NaCl溶液在冰浴條件下研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入到離心管中，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至7.5后即為粗酶液。

果膠裂解酶（pectatelyase，PL）粗酶液提取參照陳夕軍等[15]方法。取3 g冷凍組織，置于冰浴的研缽中，加入6 mL的提取緩沖液（50 mmol/L、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液，含1 mol/L NaCl），在冰浴條件下研磨成勻漿，將勻漿全部轉(zhuǎn)入到離心管中，4 ℃、10 000×g離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。

1.3.6.2 酶活性的測定

PMG活性的測定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到0.5 mL 10 g/L果膠溶液和1.0 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，37 ℃水浴1 h，加入1.5 mL的3,5-二硝基水楊酸并立即沸水浴5 min，迅速冷卻后加蒸餾水8 mL之后混勻，540 nm波長處測定吸光度。PMG活性用每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時將多聚半乳糖醛酸在37 ℃催化水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

PG活性的測定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到0.5mL 10 g/L多聚半乳糖醛酸溶液和1.0 mL 50 mmol/L的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5）中，37 ℃水浴1 h，加入1.5 mL的3,5-二硝基水楊酸試劑并立即進行5 min沸水浴，迅速冷卻，加蒸餾水8 mL之后混勻，540 nm波長處測定吸光度。PG活性用每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時將多聚半乳糖醛酸在37 ℃催化水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

Cx活性的測定參照劉耀娜等[13]方法。取0.5 mL粗酶液，加入到1.5 mL 10 g/L羧甲基纖維素鈉溶液混勻，37 ℃水浴1 h，迅速將1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑加入并進行5 min的沸水浴，迅速冷卻后加蒸餾水8 mL進行混勻，540 nm波長處測定吸光度。Cx活性以每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時將羧甲基纖維素在37 ℃催化水解并生成還原糖（葡萄糖）的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

β-Glu活性的測定參照劉耀娜等[13]的方法。取0.5 mL粗酶提取液，加入1.5 mL 10 g/L水楊苷溶液， 37 ℃水浴1 h，迅速加入3,5-二硝基水楊酸試劑1.5 mL，再進行5 min沸水浴后迅速冷卻，加入蒸餾水8 mL并混勻，在540 nm波長處測定吸光度。β-Glu活性以每克樣品組織（鮮質(zhì)量）每小時將水楊苷在37 ℃水解成還原糖（葡萄糖）的質(zhì)量表示，即mg/（h·g）。

PME活性的測定參照Hagerman等[14]方法。反應液包括4 mL 0.5%果膠溶液、0.3 mL 0.01%溴麝香草酚蘭，在加入粗酶液前初始A620nm約為0.091，加500 μL粗酶液，反應2 min后測定其吸光度，酶活性以每分鐘吸光度的變化值ΔA620nm表示。

PL活性參照陳夕軍等[15]方法。取2.0 mL的0.5%果膠溶液于試管中，40 ℃水浴平衡5 min，加入0.5 mL粗酶液，40 ℃水浴平衡10 min，取上述反應混合物0.5 mL，加入4.5 mL 0.01 mol/L的HCl溶液中，充分混和終止反應。在235 nm波長處測定吸光度。每分鐘235 nm波長處吸光度增加1.0定義為1單位PL活性，以ΔA235nm表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 病部組織pH值的變化及3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑直徑的影響

圖1 接種T. roseum后果實病斑處pH值的變化（A）及3 種pH值孢子懸浮液接種對病斑直徑（B）的影響Fig. 1 pH change in lesion of fruit inoculated with T. roseum (A), and effect of inoculation with spore suspensions at three different pH values on lesion diameter (B)

如圖1A所示，果實接種T. roseum后，病部組織的pH值隨接種時間的延長明顯上升，由第0天的3.54增加到第12天的4.84，提高了36.7%。對照組織的pH值雖然也有升高，但增加幅度不大。由于接種病原物的組織pH值在接種3 d后均顯著高于對照（P＜0.05），表明T. roseum堿化了果實傷口處的微環(huán)境，該菌屬堿化菌。

如圖1B所示，不同pH值孢子懸浮液接種后果實的病斑直徑存在顯著差異，其中pH 7的病斑直徑最大，其次為pH 5，pH 3最小。接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種果實的病斑直徑分別高出pH 5和pH 3的35.2%和68.0%（P＜0.05）。

2.2 3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑處果膠酶活性的影響

圖2 3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑處PME（A）、PG（B）、PMG（C）和PL（D）活性的影響Fig. 2 Effects of inoculation with spore suspensions at three different pH values on the activities of PME (A), PG (B), PMG (C) and PL (D)

3 種pH值孢子懸浮液接種后病斑處的果膠酶活性表現(xiàn)各異，整體上以pH 7的活性最大（圖2）。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處的PME活性在第6天和第9天最高，顯著高于pH 5和pH 3孢子懸浮液接種，接種后第9天，分別為pH 5與pH 3處理的2 倍與2.95 倍（P＜0.05）（圖2A）；雖然pH 5孢子懸浮液接種果實病斑處的PME活性在第3、6、9天也高于pH 3孢子懸浮液接種，但兩者之間無顯著差異。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處的PG活性在第9天最大，顯著高于pH 5與pH 3孢子懸浮液接種的活性。接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種的PG活性分別為pH 5與pH 3接種的1.39 倍和1.68 倍（P＜0.05）；第3天與第9天，pH 5孢子懸浮液接種的PG活性也顯著高于pH 3孢子懸浮液（P＜0.05）（圖2B）。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處的PMG活性在第6天和第9天最高，顯著高于pH 5與pH 3孢子懸浮液接種的活性，接種后第9天，pH 7孢子懸浮液接種的PMG活性分別為pH 5與pH 3接種的1.25 倍和1.61 倍（P＜0.05）；第3天與第9天pH 5孢子懸浮液接種的PMG活性也顯著高于pH 3孢子懸浮液接種（P＜0.05）（圖2C）。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處的PL活性在第12天最大，顯著高于pH 5和pH 3孢子懸浮液，pH 5與pH 3孢子懸浮液接種后病斑處PL活性在各時間點均無顯著差異。第12天時pH 7活性與pH 3差異最顯著（P＜0.05）（圖2D）。

2.3 3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑處Cx和β-Glu活性的影響

圖3 3 種pH值孢子懸浮液接種對果實病斑處CX（A）和β-Glu（B）活性的影響Fig. 3 Effects of inoculation with spore suspensions at three different pH values on the activities of Cx (A) and β-Glu (B)

3 種pH值孢子懸浮液接種后病斑處的纖維素酶整體上以pH 7的活性最大，pH 5次之，pH 3最?。▓D3）。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處Cx活性在第9天時最大，分別為pH 5和pH 3接種的1.33 倍與1.97 倍（P＜0.05），且pH 5孢子懸浮液接種的Cx活性也高于pH 3接種的51.5%（圖3A）。pH 7孢子懸浮液接種后果實病斑處β-Glu活性在第9天最大，分別為pH 5與pH 3接種活性的1.3 倍與1.64 倍，pH 5孢子懸浮液接種高出pH 3接種的26.9%（P＜0.05）（圖3B）。

3 結(jié)論與討論

接種了T. roseum的蘋果果實，病斑處的pH值顯著升高，表明該菌屬堿化菌。采用3 種pH值孢子懸浮液接種后發(fā)現(xiàn)，pH 7處理蘋果果實的病斑直徑最大，表明高pH值環(huán)境更有利于T. roseum致病。

pH 7孢子懸浮液接種導致了蘋果果實病健交界處最高的果膠酶和纖維素酶活性，而pH 3接種導致了最低的活性，表明高pH值有利于T. roseum胞外酶的活化。果實受到真菌侵染后大多發(fā)生組織潰爛，真菌分泌的胞外酶在其中發(fā)揮了重要作用[16]。傷口侵染性真菌分泌的胞外酶主要由果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等組成，其中以果膠酶的功能最為強大。果膠酶是一組復合酶，由PME、PG、PMG、PL等組成，主要在降解細胞壁及中膠層的果膠物質(zhì)中發(fā)揮作用[17]。果實細胞壁和中膠層中果膠主鏈的多聚半乳糖醛酸結(jié)構(gòu)單位被甲醇高度酯化，故PME先催化主鏈的脫甲酯化并產(chǎn)生自由羧基群，同時釋放甲醇[18]。甲醇的釋放導致細胞壁pH值降低，從而更有利于PG發(fā)揮作用[19]。PG可水解細胞壁和中膠層中的多聚半乳糖醛酸中的α-1,4糖苷鍵，生成低聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸，從而導致中膠層破壞和細胞壁結(jié)構(gòu)松散，致使果實組織軟化、潰爛[20]。本研究pH 7孢子懸浮液接種果實的病斑處具有較高的PME和PG活性，與前人研究結(jié)果類似。Sakai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，PME作用的最佳pH值為7左右。陳夕軍[22]和宋丹丹[23]等也發(fā)現(xiàn)，PG在pH 7時的活性顯著高于pH 3時的活性。PMG是一種專一水解底物糖苷鍵的水解酶，對底物的酯化度具有高度的選擇性，可水解高度酯化的果膠酸酯的α-1,4糖苷鍵[24]。本研究pH 7孢子懸浮液接種后病斑處PMG活性較高，表明PMG在T. roseum的侵染中后期發(fā)揮了重要作用，該結(jié)果與楊迎青等[24]研究類似。PL能夠催化降解半乳糖醛酸，通過β消除作用，在其非還原端產(chǎn)生帶有4-脫氧-α-D-半乳糖-4-烯醛酸基團的不飽和低聚糖，本研究pH 7孢子懸浮液接種后病斑處PL活性較高，與周人綱等[25]研究結(jié)果類似。不同pH值導致的果膠酶活性差異與編碼果膠酶的不同基因家族成員在不同的pH值環(huán)境水平下被激活有關(guān)[7]。例如，堿化菌C. gloeosporioides僅在pH值高于5.7時，編碼PL的基因pel才會表達，并表現(xiàn)出更強的PL活性[26]。當敲除C. gloeosporioides產(chǎn)生氨的基因GDH2后，突變株接種后病斑處pH值未發(fā)生顯著變化，編碼PG的基因表達量也明顯降低[27]。

纖維素酶主要由Cx和β-Glu等組成[28]，通常是在腐爛發(fā)生的后期發(fā)揮作用[29]，Cx可分解纖維素中的β-1,4糖苷鍵，最終形成纖維二糖[30]。本研究pH 7孢子懸浮液接種的Cx活性顯著高于pH 3和pH 5孢子懸浮液接種，該結(jié)果與耿麗平等[31]研究的草酸青霉（Penicillium oxalicum）在pH 4～7時均可產(chǎn)生Cx，但在pH 7時酶活性最高的結(jié)果一致。β-Glu主要水解非還原性末端的β-D-糖苷鍵生成β-D-葡萄糖[32]。本研究pH 7孢子懸浮液接種的β-Glu活性較高，與周進等[33]的結(jié)果相似。不同的環(huán)境pH值會激活纖維素酶基因家族的不同成員[7]。