Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化蔓荊子總黃酮DES提取工藝研究

王連紅，張建梅，都玲玲，姚明志，陳甘牛，劉瑞珍，孫太元*

（1.煙臺市林業(yè)科學(xué)研究所，山東 煙臺264013；2.寧海街道辦事處，山東 牟平264015；3.煙臺市森林保護(hù)站，山東 煙臺264013）

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊(Vitex trifolia L.var.simplicifolia Cham.)或蔓荊(Vitex trifoli L.)的干燥成熟果實[1]，功能疏散風(fēng)熱、清利頭目，為山東道地藥材之一。單葉蔓荊不僅具固沙改土、蓄水保墑等功能[2-5]，同時還具有藥用價值[6.7]，在《國家重點保護(hù)野生藥材物種名錄》中，單葉蔓荊已被列為國家Ⅲ級瀕危保護(hù)植物[8.9]。蔓荊子含有黃酮、揮發(fā)油、萜類、生物堿等成分[10]，尤其是其總黃酮顯示出顯著的抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、消炎、抗菌等活性。蔓荊子黃酮類以蔓荊子黃素為主，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、氯仿等溶劑，因此一般采用乙醇提取總黃酮[11]。

低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DES）是由氫鍵供體和氫鍵受體組合而成的混合物，熔點遠(yuǎn)低于其組成物，且不易揮發(fā)、安全無毒[12]。作為一類新型綠色溶劑，DES在天然產(chǎn)物提取分離領(lǐng)域備受關(guān)注，研究應(yīng)用日益廣泛。

本文以常用的氯化膽堿為氫鍵供體組份配制一系列DES用于提取蔓荊子總黃酮，以總黃酮提取率為評價指標(biāo)經(jīng)Box-Behnken（BBK）實驗設(shè)計優(yōu)化DES提取工藝，并通過測定DPPH清除率考察所得提取物的抗氧化活性，為工業(yè)化生產(chǎn)蔓荊子提取物提供依據(jù)，并為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

蔓荊子均采自煙臺市芝罘區(qū)幸福林場沿海防護(hù)林地。蘆?。暇┚爸裆锟萍加邢薰?HPLC≥98%,批號：JZ16041802），其他試劑均為分析純。

UV-Vis分光光度計；METTLER PL203型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；LEGNED MICRO 17高速離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)W135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 總黃酮含量測定方法

將蔓荊子藥材分別粉碎過40目篩，準(zhǔn)確稱取藥物粉末0.1g，置10mL容量瓶中，按照試驗條件進(jìn)行提取，提取液經(jīng)0.22μm濾膜過濾。精密吸取上述濾液2.5mL置10mL試管中，加5%NaNO20.3 mL搖勻、放置6 min，加 10%Al(NO3)30.3 mL搖勻、放置 6 min，加 10%NaOH 4 mL搖勻、放置 20 min，在510 nm處測定吸光度(A)，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線（C=0.1186A+0.022，R2=0.9999）計算總黃酮濃度 C[11]。

1.3 DES種類對蔓荊子提取液中總黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱取蔓荊子粉末1g置于離心管中，加入15mL DES，40℃溫浸持續(xù)攪拌 3.5h，3700rpm/min 離心5min，取上清液2 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用1.2項下方法測定總黃酮含量。DES種類對提取液中總黃酮含量的影響結(jié)果見圖1。

圖1 DES種類對提取液中總黃酮濃度的影響

1.4 BBK設(shè)計優(yōu)化蔓荊子總黃酮DES提取工藝

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）三個因素，以提取液中總黃酮含量為響應(yīng)值，優(yōu)化提取工藝條件。BBK實驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 BBK實驗因素水平表

等高線形狀和三維響應(yīng)曲面可以反應(yīng)出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，根據(jù)二次擬合模型的響應(yīng)曲面和等高線模型評價提取時間、提取溫度與料液比及其交互作用對蔓荊子總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

以響應(yīng)值（總黃酮提取率）最高為目標(biāo)計算最優(yōu)提取工藝條件。取蔓荊子粉末3份、每份1g，按最優(yōu)提取條件提取，測定并計算蔓荊子總黃酮提取率，并與預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5 蔓荊子DES提取液DPPH抗氧化實驗研究

取樣品稀釋液100μL加等量0.1mmol/L DPPH溶液，搖勻，孵育30min后在517nm處測定其吸光度A樣品，同時測定樣品溶液吸光度A對照，DPPH溶液吸光度A空白，并按照下列公式計算自由基清除率[14]。相同條件下測定VC的DPPH抗氧化活性。

清除率（%）=[1-（A樣品-A空白）/A對照]×100%

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 DES種類對蔓荊子提取液中總黃酮含量的影響

結(jié)果表明，氯化膽堿-乳酸體系所得提取液中總黃酮含量最高，但其溶液色澤變暗，推測該體系可能影響成分的穩(wěn)定性。氯化膽堿-1.3-丁二醇的提取率次佳，因此以該體系為提取溶劑進(jìn)一步研究。見表2、圖1。

表2 響應(yīng)中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果

2.2 BBK優(yōu)化蔓荊子總黃酮DES提取工藝

使用二次方程式的數(shù)學(xué)模型對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，總黃酮提取率的數(shù)學(xué)模型：

R=-12.04275+1.63162B+0.24709A+0.33639C-5.02500*10-4AB+3.17500*10-3BC+4.34500*10-3AC-0.26010 B2-1.88098*10-3 A2-0.033243 C2,方程相關(guān)系數(shù)R2和R2Adj分別為0.9276和0.8344，說明模型擬合程度較好，回歸方程能較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

對響應(yīng)曲面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型顯著且失擬項無顯著性，表明模型擬合程度良好、誤差小。3個因素中C2、A2、B2對實驗結(jié)果影響顯著，且3因素影響大小依次為：A〉B〉C。

表3 回歸模型系數(shù)顯著性檢測及模型方差分析

圖2 三種因素交互作用對總黃酮提取率影響的響應(yīng)面與等高線

由圖2可知，各因素交互影響的響應(yīng)面曲率不大、等高線均為橢圓形，說明提取溫度、提取時間和料液比的交互作用對蔓荊子總黃酮提取率均有一定的影響、但不顯著。

經(jīng)軟件預(yù)測所得的最優(yōu)提取條件為時間3.12h、溫度77.09℃、料液比1:10.25，此時預(yù)測的總黃酮提取率為1.75%。驗證實驗所得蔓荊子總黃酮提取率為1.68%（RSD=1.33%），與預(yù)測值基本一致。表明上述模型的預(yù)測準(zhǔn)確度較高。

2.3 蔓荊子DES提取液DPPH抗氧化實驗研究

根據(jù)實驗結(jié)果，蔓荊子DES提取液的DPPH自由基清除率為84.76%±0.23，VC的自由基清除率為91.28%±0.58，蔓荊子DES提取液清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。

3 結(jié)論

本文借助BBK設(shè)計優(yōu)化了DES溫浸提取蔓荊子總黃酮工藝條件為：料液比1:10.25條件下77.09℃溫浸提取3.12h，此時總黃酮提取率約為1.7%，體外抗氧化試驗表明所得提取物的DPPH清除率高達(dá)84.76%±0.23。DES溫浸提取操作簡便、提取率高、提取物抗氧化效果顯著，是一種較為理想的生產(chǎn)蔓荊子提取物的新方法。本文為進(jìn)一步開發(fā)和改進(jìn)蔓荊子總黃酮的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。