蔓荊子炮制前后HPLC指紋圖譜比較研究

李國衛(wèi)，吳文平，索彩仙，孫冬梅，何民友，潘禮業(yè)

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244)

蔓荊子為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham.或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實(shí)。秋季果實(shí)成熟時(shí)采收，除去雜質(zhì)，曬干[1]。炒蔓荊子用藥始見于《圣惠》，以微炒居多，以除去宿萼及白膜等非藥用部位，使之飲片碎制、凈制，尚有緩和藥性、便于制劑、達(dá)到易于煎出有效物質(zhì)的目的[2]。蔓荊子具有疏散風(fēng)熱、清利頭目的功效，炒制之后功效側(cè)重于升清陽之氣，較多的運(yùn)用于耳目失聰及風(fēng)濕痹痛的治療[3]。

蔓荊子的化學(xué)成分主要包括揮發(fā)油、雙萜類化合物、黃酮類化合物、氨基酸、脂肪酸等[4-9]。2015年版《中國藥典》以蔓荊子黃素作為蔓荊子與炒蔓荊子的定量分析指標(biāo)。文獻(xiàn)研究顯示，蔓荊子炮制后黃酮類成分含量會(huì)下降，而水溶性浸出物會(huì)增加，因此采用蔓荊子黃素作為蔓荊子炮制的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不能全面反映蔓荊子炮制品的質(zhì)量[8,10-11]。為進(jìn)一步研究炮制前后蔓荊子化學(xué)成分變化，并有效地控制其飲片的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜法對(duì)蔓荊子、炒蔓荊子指紋圖譜進(jìn)行了研究，為更好地控制蔓荊子和炒蔓荊子的藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與儀器

WatersARC高效液相色譜儀(Waters公司)；Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；ME204E萬分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；XP26百萬分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)；KQ500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HWS28型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

異葒草苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%，批號(hào)：111974-201401)、蔓荊子黃素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，批號(hào)：111554-201304)、香草酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.80%，批號(hào)：110776-201503)均由中國食品藥品檢定研究所提供；磷酸、乙腈為色譜純(默克股份有限公司)；水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)；其他試劑為分析純。

17批蔓荊子樣品來源于江西、云南、湖北、廣東等地，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為馬鞭草科植物單葉蔓荊VitextrifoliaL. var.simplicifoliaCham. 或蔓荊VitextrifoliaL.的干燥成熟果實(shí)，炒蔓荊子為實(shí)驗(yàn)室自制，樣品留存于廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心，其中生品編號(hào)為：S1～S17，對(duì)應(yīng)的炒蔓荊子編號(hào)為：PS1～PS17。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒蔓荊子的制備

取蔓荊子200 g，按2015年版《中國藥典》炒蔓荊子項(xiàng)下規(guī)定：取凈蔓荊子，照清炒法(通則0213)微炒，炒至表面黑褐色，氣特異而芳香，味淡、微辛，符合2015年版《中國藥典》中炒蔓荊子的性狀特征[1]。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent SB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～30 min，5%→20%A；30～40 min，20%→45%A；40～50 min，45%→95%A；50～60 min，95%A)；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長為258 nm；進(jìn)樣體積為10 μL。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

取蔓荊子黃素對(duì)照品、異葒草苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL分別含蔓荊子黃素103.189 5 μg、異葒草苷114.539 0 μg的混合對(duì)照品溶液，即得；另取香草酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含40.538 8 μg的香草酸對(duì)照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取蔓荊子樣品粉末(過三號(hào)篩)適量，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗(yàn) 取上述蔓荊子供試品溶液、混合對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣檢測(cè)，考察實(shí)驗(yàn)方法的專屬性。結(jié)果表明，樣品中各個(gè)色譜峰不受空白溶劑的干擾，其中蔓荊子黃素、異葒草苷、香草酸的保留時(shí)間與對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間一致，表明該方法具有良好的專屬性，結(jié)果見圖1。

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； A.香草酸對(duì)照品溶液； B.蔓荊子黃素與異葒草苷混合對(duì)照品溶液； C.蔓荊子供試品溶液； D.炒蔓荊子供試品溶液。

圖1 對(duì)照品與供試品溶液HPLC圖

Figure 1 The HPLC spectra of the mixed reference substance and the sample

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.4”項(xiàng)下同一供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以蔓荊子黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.02%～0.11%、0.13%～0.53%，表明分析方法精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一蔓荊子樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以蔓荊子黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.03%～0.13%、0.89%～1.86%，表明方法重復(fù)性較好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密吸取“2.4”項(xiàng)下同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以蔓荊子黃素為參照峰，計(jì)算各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別為0.03%～0.17%、0.22%～0.50%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 蔓荊子藥材指紋圖譜的建立

2.6.1 共有峰的確定 精密稱取不同批次蔓荊子及炒蔓荊子約0.5 g，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積大于總峰面積的0.35%篩選色譜峰，通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)”進(jìn)行匹配，共得到15個(gè)穩(wěn)定的共有峰，具有指紋圖譜特征性，可初步擬定為蔓荊子的指標(biāo)成分群，分別得到蔓荊子及炒蔓荊子的指紋圖譜，見圖2、圖3。經(jīng)對(duì)照品對(duì)照，5號(hào)峰為香草酸峰，8號(hào)峰為異葒草苷峰，14號(hào)峰為蔓荊子黃素峰。蔓荊子黃素峰因分離效果好、出峰穩(wěn)定，選定為參照峰。以14號(hào)峰蔓荊子黃素峰為參照峰，計(jì)算各批蔓荊子與炒蔓荊子的共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見表1?？梢?，各共有峰的RSD值范圍為22.86%～87.86%，較為穩(wěn)定，具有特征圖譜特征性，可初步定為蔓荊子的指標(biāo)成分群。

2.6.2 蔓荊子和炒蔓荊子相似度計(jì)算 分別通過17批蔓荊子和17批炒蔓荊子生成的共有模式為對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算各批次之間的相似度，結(jié)果見表2?？梢?，17批蔓荊子的相似度在0.850～0.999之間，17批炒蔓荊子的相似度在0.894～0.997之間，說明蔓荊子與炒蔓荊子的質(zhì)量穩(wěn)定，生品與生品、炮制品與炮制品之間成分組成差異小。

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； S1～S17分別為17批蔓荊子生品。

圖2 17批蔓荊子生品HPLC指紋圖譜疊加圖

Figure 2 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of Viticis Fructus

5.香草酸； 8.異葒草苷； 14.蔓荊子黃素； S1～S17分別為17批炒蔓荊子樣品。

圖3 17批炒蔓荊子樣品HPLC指紋圖譜疊加圖

Figure 3 Superposition chart of HPLC specific chromatograms of 17 batches of fried Viticis Fructus

表1 蔓荊子生品及炒蔓荊子樣品指紋圖譜相對(duì)峰面積分析結(jié)果Table 1 Relative peak area of characteristic spectrum of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

表1 (續(xù))

注：S1～S17為蔓荊子生品，PS1～PS17為炒蔓荊子。

表2 蔓荊子生品及炒蔓荊子指紋圖譜相似度結(jié)果Table 2 Similarity of fingerprints of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

注：S1～S17為蔓荊子生品，PS1～PS17為炒蔓荊子。

2.6.3 蔓荊子與炒蔓荊子各特征峰相對(duì)峰面積差異分析 對(duì)蔓荊子及炒蔓荊子特征圖譜的相對(duì)峰面積進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見圖4。可見，17批蔓荊子與炒蔓荊子特征圖譜的15個(gè)共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積呈整體降低趨勢(shì)；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積呈整體增大趨勢(shì)；峰4、峰10、峰11等3個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積則有升有降，無明顯規(guī)律。運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)蔓荊子及炒蔓荊子各特征峰峰面積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果見表3?？梢?，峰2、峰6、峰7、峰15的相對(duì)峰面積存在明顯差異(P<0.05)?；诮y(tǒng)計(jì)分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致，說明蔓荊子與炒蔓荊子的成分比例存在差異。

MJZ.蔓荊子生品；CMJZ.炒蔓荊子。

A.峰1、峰2、峰3、峰5、峰15相對(duì)峰面積均值圖； B.峰6、峰7、峰8、峰9、峰13相對(duì)峰面積均值圖。

圖4 蔓荊子及炒蔓荊子相對(duì)峰面積均值對(duì)比圖

Figure 4 Comparison charts of relative peak area mean of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

3 討論

本研究采用全波長掃描(190～400 nm)確定檢測(cè)波長，結(jié)果顯示在258 nm波長下色譜峰數(shù)目最多，色譜峰分離度較好，故測(cè)定波長選擇258 nm，并最終建立蔓荊子及炒蔓荊子指紋圖譜；并對(duì)不同提取方法(超聲、回流)及不同提取溶劑(甲醇、乙醇、70%甲醇、70%乙醇、50%甲醇、50%乙醇)進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用50%乙醇回流提取的色譜圖信息量最多，峰響應(yīng)較高，故選用50%乙醇回流提取。

表3 蔓荊子及炒蔓荊子各特征峰相對(duì)峰面積獨(dú)立樣本檢驗(yàn)結(jié)果

Table 3 The independent sample test result of relative peak area of each characteristic peak of Viticis Fructus and fried Viticis Fructus

峰號(hào)t值dfP值峰1-1.98832峰2-2.77132<0.05峰3-1.93432峰40.82332峰5-0.45032峰64.37832<0.05峰73.09032<0.05峰80.87232峰90.70332峰100.56932峰110.89032峰12-0.69032峰130.88332峰15-6.32432<0.05

本研究結(jié)果顯示，17批蔓荊子與炒蔓荊子特征圖譜的15個(gè)共有峰中，峰6、峰7、峰8、峰9、峰13等5個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積呈整體降低趨勢(shì)；峰1、峰2、峰3、峰5、峰15等5個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積呈整體增大趨勢(shì)；峰面積出現(xiàn)明顯變化的色譜峰主要集中在特征圖譜前30 min的部分，其中峰5為香草酸，峰8為異葒草苷，前30 min的成分多為極性較大的水溶性成分，與文獻(xiàn)研究的水溶性浸出物會(huì)增加的結(jié)論有一定關(guān)聯(lián)[10]；但黃酮類成分異葒草苷相對(duì)峰面積呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，提示蔓荊子中部分黃酮類成分炮制后含量可能會(huì)降低。

2015年版《中國藥典》蔓荊子項(xiàng)下并未對(duì)蔓荊子、炒蔓荊子進(jìn)行系統(tǒng)的鑒別，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同產(chǎn)地蔓荊子、炒蔓荊子的指紋圖譜進(jìn)行分析，為蔓荊子及炒蔓荊子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、品質(zhì)評(píng)價(jià)提供一定的科學(xué)依據(jù)，為蔓荊子的質(zhì)量控制提供了參考方法。本研究尚未對(duì)炮制前后產(chǎn)生變化的成分進(jìn)行深入研究，后續(xù)將針對(duì)炮制后產(chǎn)生變化的化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)，并開展蔓荊子炮制前后藥效對(duì)比研究，進(jìn)一步揭示蔓荊子炒制的科學(xué)內(nèi)涵。