真菌來源的抗微生物多肽研究進展

沈秉正，李雪珂，楊海峰，喻研

(1.武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北 武漢 430060； 2.武漢大學生命科學學院病毒學國家重點實驗室，湖北 武漢 430072； 3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 武漢 430060)

經(jīng)過數(shù)千年的進化，抗微生物多肽(Antimicrobial peptides，AMPs)已成為許多生物先天免疫系統(tǒng)的重要成分。由于廣泛的活性，使得AMPs成為抗病原微生物最有希望的候選藥物之一。AMPs可通過膜裂解、非裂解方式和/或細胞內(nèi)的機制進行獨立或協(xié)同作用而引起微生物的死亡。AMPs又被稱作宿主防御肽，在所有生命形式中幾乎均可以找到。從細菌到植物、無脊椎動物和脊椎動物等所有生物均可產(chǎn)生AMP。

截止至2019年4月，抗菌肽數(shù)據(jù)庫(The Antimicrobial Peptide Database，APD； http://aps.unmc.edu/AP/)收錄了7大來源的3 065種抗菌肽[1]，其中1 085種來自兩棲動物，533種來自節(jié)肢動物，288種來自哺乳動物，131種人類宿主防御肽，126種來自魚類，43來自軟體動物，42種來自鳥類，40種爬行動物，17種來自真菌，6種來自原生動物以及包括人工合成/改造等其他來源的AMPs。

近幾年，隨著三代測序技術(shù)的普及以及四代測序技術(shù)的逐漸完善，對真菌基因組、轉(zhuǎn)錄組測序也逐漸增多，目前已發(fā)現(xiàn)17種真菌來源的AMPs，這些多肽序列、結(jié)構(gòu)各異，生物活性亦有不同。本文從上述17種多肽的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點、抗微生物活性等方面對真菌來源的抗微生物多肽進行系統(tǒng)總結(jié)，以期能為其進一步作為藥品開發(fā)提供參考。

1 真菌來源的抗微生物肽的分類

由于真菌來源的抗微生物肽是一類獨特且多樣的分子，因此對其進行分類顯得非常重要。目前，對于AMPs的分類方式主要是基于多肽序列、空間結(jié)構(gòu)、生物活性或作用機制。由于多肽的活性取決于氨基酸殘基的序列和結(jié)構(gòu)，本文亦基于該特征將來源于真菌的AMPs分為線性多肽和含有分子內(nèi)二硫鍵的多肽兩個大類，見表1所示。

表1 真菌來源的抗微生物多肽Table 1 Fungal-derived antimicrobial peptides

注：括號內(nèi)為多肽在抗菌肽數(shù)據(jù)庫(http://aps.unmc.edu/AP)中多肽的編號。

2 真菌來源的線性抗微生物肽

2.1 來源于毛頭鬼傘的Y3多肽

吳麗萍等[2]利用離子交換層析技術(shù)和凝膠層析法從毛頭鬼傘(C.comatus)中分離提取到了抗植物病毒多肽Y3，其為含有糖基的多肽，在菌絲體和子實體中均能通過Western雜交方法檢測到。當Y3質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時，其對煙草花葉病毒侵染心葉煙的抑制率約為50%，亦可抑制宿主Nicotianatabacumvar. K326中該病毒的復(fù)制。

2.2 來源于白腐真菌杏鮑菇的Eryngin多肽

Wang等[3]從可食用的白腐真菌杏鮑菇(P.eryngii)的子實體中分離出相對分子質(zhì)量為10 000的抗真菌肽，命名為Eryngin，其N末端序列與來自蘑菇Lyophyllumshimeiji的抗真菌蛋白有一些相似性。該多肽能抑制尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和花生球腔菌(Mycosphaerellaarachidicola)中的菌絲體生長，MIC值分別為1.35、3.5 μmol/L。

2.3 來源于綠色木霉菌的U-22324多肽

Meyer等[4]從綠色木霉菌(T.viride)的1 600 mL發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)并分離得到了抗菌肽U-22343，在酸性環(huán)境(pH=4.6)中沉淀活性物質(zhì)，用質(zhì)量濃度1%硅藻土收集沉淀物，用400 mL丙酮萃取，30 ℃濃縮除去丙酮，有機相置于4 ℃冰箱中結(jié)晶。將約2.7 g粗品于室溫溶解于最小量的無水乙醇，用活性炭吸附雜質(zhì)，濃縮至約25 mL，加入等體積乙醚，結(jié)晶，得產(chǎn)物約1.7 g，其對細菌具有較強的抑制活性，抑制S.aureusUC-76、S.aureusUC-76、S.faecalisATCC-6057、S.hemolyticusC-203、S.viridansUC-155的MIC值分別為62.5、125、31、31、31 μg/mL。對真菌的抑制作用相對較弱，抑制B.dermatitidis、N.asteroides、C.immitis、H.compactum、H.capsulatum和T.mentagrophytesUC-4860的MIC值分別為100、1 000、1 000、1 000、1 000、1 000 μg/mL。

3 真菌來源的含分子內(nèi)二硫鍵的抗微生物肽

3.1 來源于巨大曲霉菌的抗微生物肽

Wnendt等[5]從巨大曲霉(A.giganteus)中發(fā)現(xiàn)了5 800的多肽，可抑制真菌生長。首先克隆編碼該抗真菌多肽的cDNA，構(gòu)建了cDNA表達文庫，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該抗真菌多肽的cDNA序列由183個核苷酸組成，全長多肽含有60個氨基酸殘基。N-末端存在9個氨基酸的前導序列，可能與多肽分泌到細胞外有關(guān)。而發(fā)揮抗真菌功能的成熟肽由51個氨基酸殘基組成，并通過NMR技術(shù)解析了其空間結(jié)構(gòu)(圖1)。

圖1 來源于巨大曲霉菌的抗微生物多肽空間結(jié)構(gòu)(PDB: 1AFP)

Figure 1 Structure of antimicrobial peptide derived fromA.giganteus(PDB: 1AFP)

3.2 來源于腐生子囊菌的抗微生物肽Plectasin

Mygind等[6]在2005年首次從北歐松樹林中的腐生子囊菌(P.nigrella)中分離出真菌防御素類抗菌肽，命名為Plectasin，對革蘭陽性細菌有較好的抑菌活性，特別是對肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果顯著，對一些常規(guī)抗生素耐藥的菌株亦有作用。Plectasin在體外顯示出較快的殺菌速度，與臨床使用的萬古霉素和青霉素相當，且不易產(chǎn)生耐藥性，因此與臨床使用的傳統(tǒng)抗生素之間不具有交叉耐藥性。更值得關(guān)注的是該多肽對哺乳動物細胞沒有毒害作用，且容易透過血腦屏障，在腦脊液中的滲透能力可達到30%以上，顯著高于其他常規(guī)抗生素。因此，Plectasin具有進一步開發(fā)成為新型的抗菌藥物的潛力，用于治療包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)細菌感染在內(nèi)的感染性疾病，其空間結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 來源于腐生子囊菌抗微生物多肽Plectasin的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 1ZFU)

Figure 2 Structure of antimicrobial peptide Plectasin derived fromP.nigrella(PDB: 1ZFU)

3.3 來源于棒曲霉菌的抗微生物肽AcAMP

Hajji等[7]從棒曲霉(A.clavatusES1)的發(fā)酵液中分離到了大小約為6 000的抗微生物肽，命名為AcAMP。通過分子生物學相關(guān)技術(shù)發(fā)現(xiàn)該基因由285個核苷酸編碼。全長肽由94個氨基酸殘基組成，從N端到C端分別為信號肽(1-21位氨基酸殘基)、前肽(22-43位氨基酸殘基)和成熟肽(44～94位氨基酸殘基)，為具有抗微生物活性的富含半胱氨酸的堿性多肽。AcAMP在50～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍抑制真菌(A.niger、F.solani、F.oxysporum)的抑菌圈直徑在7～15 mm之間。除了抗真菌活性外，AcAMP是第一個來源于真菌的對革蘭陽性和革蘭陰性細菌均具有抗菌活性的多肽，其抑制細菌S.aureus、B.cereus、M.luteus、E.faecalis、E.coli及P.aeruginosa的MIC值均在10～50 μg/mL范圍內(nèi)。

3.4 來源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物肽PAF

Kaiserer等[8]從絲狀真菌產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)培養(yǎng)基上清中分離得到了富含半胱氨酸的堿性多肽Penicilliumantifungalprotein(PAF)。該抗微生物多肽可抑制多種絲狀真菌的生長，包括人類條件致病真菌和植物致病真菌，但不抑制細菌和酵母的生長。PAF在50 μg/mL濃度下對A.fumigatus、A.nidulans、A.niger、B.cinerea和T.koningii的抑制率>90%；對A.giganteus、C.carbonum和N.crassa的抑制率在70%～90%之間；對A.flavus、F.oxysporum、G.roseum和P.chrysogenum的抑制率在30%～70%之間。同時PAF亦具有較強的鹽穩(wěn)定性，其空間建構(gòu)見圖3。

圖3 來源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物多肽PAF的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2KCN)

Figure 3 Structure of antimicrobial peptide PAF derived fromP.chrysogenum(PDB: 2KCN)

3.5 來源于產(chǎn)黃青霉的抗微生物肽PgAFP

Rodríguez-Martín等[9]從產(chǎn)黃青霉RP42C(P.chrysogenum)菌株中發(fā)現(xiàn)了抗微生物多肽，命名為PgAFP，其能顯著抑制產(chǎn)毒霉菌的生長。經(jīng)電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)測定，該多肽的分子量為6494 D，理論等電點為9.22，為陽離子多肽。PgAFP多肽的基因由404核苷酸編碼，含有兩個內(nèi)含子(分別為63和62)，cDNA序列由279核苷酸編碼。PgAFP多肽前體由92個氨基酸殘基組成，經(jīng)剪切被加工成含有58個氨基酸殘基的成熟肽。其屬于由子囊菌綱產(chǎn)生的具有抗真菌活性的富含半胱氨酸的多肽。由于P.chrysogenum被認為是食品中常見的安全霉菌，因此PgAFP可能可以用于防止食品和農(nóng)產(chǎn)品中產(chǎn)毒霉菌的生長。通過NMR技術(shù)解析PgAFP的空間三維結(jié)構(gòu)見圖4。

圖4 來源于產(chǎn)黃青霉菌的抗微生物多肽PgAFP的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2NC2)

Figure 4 Structure of antimicrobial peptide PgAFP derived fromP.chrysogenum(PDB: 2NC2)

3.6 來源于黑曲霉的抗微生物肽Anafp

Gun等[10]從絲狀真菌黑曲霉(A.niger)的培養(yǎng)物上清液中分離出了抗真菌肽并將其命名為Anafp。該肽由58個氨基酸殘基組成，其中包括6個半胱氨酸殘基。Anafp抑制絲狀真菌(A.flavus、A.fumigatus、F.oxysporum、F.solani、T.beigelii)的MIC值在4～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)；抑制酵母類真菌的MIC值在8～15 μmol/L濃度范圍內(nèi)。而對細菌的抑制作用較弱，在濃度為50 μmol/L時對細菌E.coli和B.subtilis均無抑制作用。

3.7 來源于阿姆斯特丹散囊菌的抗微生物肽Eurocin

Oeemig等[11]從阿姆斯特丹散囊菌(E.amstelodami)中發(fā)現(xiàn)了具有抗微生物活性的真菌防御素多肽，命名為Eurocin。該多肽由90個氨基酸殘基組成，包括信號肽(1～20位氨基酸殘基)、前肽(21～48位氨基酸殘基)和成熟肽(49～90位氨基酸殘基)。成熟肽由42個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為4 300，且多肽序列中富含甘氨酸(24%)和半胱氨酸(14%)殘基，所含的6個半胱氨酸殘基，可形成分子內(nèi)三對二硫鍵，結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 來源于阿姆斯特丹散囊菌的抗微生物多肽Eurocin的空間結(jié)構(gòu)(PDB: 2LT8)

Figure 5 Structure of antimicrobial peptide Eurocin derived fromP.chrysogenum(PDB: 2LT8)

對183種細菌菌株測試了Eurocin的抗微生物活性，對于人類重要的革蘭陽性病原菌參考菌株的MIC值分別為：金黃色葡萄球菌(ATCC29213)，16 μg/mL；表皮葡萄球菌(ATCC12228)，16 μg/mL；屎腸球菌(ATCC49624)，16 μg/mL；糞腸球菌(ATCC29212)，2 μg/mL；肺炎鏈球菌(ATCC49619)，0.25 μg/mL；但在所測試的革蘭陰性菌中沒有觀察到明顯的抗菌活性(MIC≥32 μg/mL)。

3.8 來源于犬小孢子菌的抗微生物肽Micasin

Zhu等[12]從犬小孢子菌(M.canis)中克隆到了真菌防御素樣肽(fungal defensin-like peptide，fDLP)Micasin的基因，通過生物信息學分析確定了其成熟肽由38個氨基酸殘基組成。通過以化學合成的線性多肽為原料，成功的制備了分子內(nèi)二硫鍵定向配對的具有活性御素樣肽Micasin，并利用NMR解析了空間結(jié)構(gòu)(圖6)，其具有典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)(CS/αβ)。

圖6 來源于犬小孢子菌的抗微生物多肽Micasin的空間結(jié)構(gòu)(PDB:2LR5)

Figure 6 Structure of antimicrobial peptide Micasin derived fromM.canis(PDB: 2LR5)

Micasin對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有活性，重要的是它能以微摩爾濃度殺死2株臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和機會致病菌銅綠假單胞菌。以非破膜的機制在3 h內(nèi)殺死幾乎全部被處理過的細菌，同時顯示出極低的溶血活性和高血清穩(wěn)定性。

3.9 來源于海洋真菌費希新薩托菌的抗微生物肽NFAP

Kovács等[13]從費希新薩托菌(N.fischeri)培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了相對分子質(zhì)量約為6 600的抗微生物多肽NFAP及其編碼基因，其成熟肽為由57個氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的堿性蛋白。利用分子模擬所構(gòu)建的該多肽的三級結(jié)構(gòu)表明具有由3個二硫鍵穩(wěn)定的5個反平行片的防御素樣分子相似空間結(jié)構(gòu)。NFAP以劑量依賴性方式表現(xiàn)出對絲狀真菌的生長抑制作用，并且在寬pH和溫度范圍內(nèi)保持較高的抗真菌活性。此外，它還表現(xiàn)出對蛋白水解酶的抗性。所有這些特征使NFAP成為可進一步進行體外和體內(nèi)研究的候選藥物，旨在開發(fā)成為新的抗真菌活性物質(zhì)。

3.10 來源于灰蓋鬼傘菌的抗微生物肽Copsin

Essig等[14]從白腐菌灰蓋鬼傘菌(C.cinerea)中發(fā)現(xiàn)了含有6對分子內(nèi)二硫鍵的抗微生物多肽Copsin，其成熟肽由57個氨基酸殘基組成，通過NMR所解析了該多肽的空間結(jié)構(gòu)(圖7)，其分子內(nèi)二硫鍵的配對方式為Cys18-Cys48、Cys22-Cys50、Cys10-Cys40、Cys3-Cys32、Cys25-Cys57和Cys35-Cys54。Copsin對多種革蘭陽性細菌具有殺菌作用，包括人類病原菌如屎腸球菌(E.faecium)和單核增生性李斯特菌(L.monocytogenes)。抗菌機制研究表明，Copsin可以與肽聚糖前體脂質(zhì)II五肽特異性結(jié)合，從而干擾細胞壁的生物合成，該多肽的空間結(jié)構(gòu)見圖7。

圖7 來源于灰蓋鬼傘菌的抗微生物多肽Copsin的空間結(jié)構(gòu)(PDB:2MN5)

Figure 7 Structure of antimicrobial peptide Copsin derived fromC.cinerea(PDB: 2MN5)

3.11 來源于費希新薩托菌的抗微生物肽NFAP2

Tóth等[15]從費希新薩托菌(N.fischeri)中發(fā)現(xiàn)了第2個富含半胱氨酸的陽離子抗真菌多肽NFAP2(第2個多肽為NFAP[13])。基于產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum)表達系統(tǒng)來批量獲得重組NFAP2多肽，同時應(yīng)用多肽固相合成、天然化學連接以及分子內(nèi)二硫鍵定向配對同樣制備了完整的NFAP2。重組和合成NFAP2的平均產(chǎn)量分別比天然生產(chǎn)者約分別高40和16倍。兩種方式制備的多肽都經(jīng)過正確加工、折疊，并具有熱穩(wěn)定性。它們顯示出與天然NFAP2相同的最小抑制濃度，MIC值分別為：C.albicansATCC10231，6.25 μg/mL；C.glabrataCBS138，1.56 μg/mL；C.guilliermondiiCBS566，1.56 μg/mL；C.kruseiCBS573，12.5 μg/mL；C.lusitaniaeCBS6936，3.125 μg/mL；C.parapsilosisCBS604，1.56 μg/mL；C.tropicalisCBS94，1.56 μg/mL；S.cerevisiaeSZMC0644，3.125 μg/mL；S.pombeSZMC0142，1.56 μg/mL。

3.12 來源于指間毛癬菌的抗微生物肽Triintsin

Shen等[16]分離自臨床樣本的病原真菌指間毛癬菌(T.interdigitale)中克隆了防御素類抗微生物肽Triintsin的基因，通過基因序列與cDNA序列的比對確定了該基因組織結(jié)構(gòu)，即由2個內(nèi)含子分隔的3個編碼外顯子組成。Triintsin的前體肽含有85個氨基酸殘基，包括21個殘基的N-末端信號肽，26個殘基的前肽和38個氨基酸殘基的成熟肽。通過同源建模建立的3D結(jié)構(gòu)，Triintsin呈現(xiàn)典型的半胱氨酸穩(wěn)定的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)(圖8)。該肽顯示出對革蘭陽性和革蘭陰性細菌廣譜的抗菌活性，同時也顯示出一定的抗真菌活性，對臨床分離的病原菌亦有顯著作用。

圖8 來源于指間毛癬菌的抗微生物多肽Triintsin的空間結(jié)構(gòu)

Figure 8 Structure of antimicrobial peptide Triintsin derived fromT.interdigitale

3.13 來源于禾谷鐮孢菌的抗微生物肽FgAFP

3.14 來源于皮炎芽生菌的抗微生物肽Bldesin

Luo等[18]通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)了皮炎芽生菌(B.dermatitidis)中存在真菌防御素樣抗微生物多肽，并通過生物工程技術(shù)進行了原核表達并成功制備了重組多肽Bldesin?？咕鷮嶒灉y定Bldesin對革蘭陽性菌(如金黃色葡萄球菌)具有良好的抑菌活性，而對革蘭陰性菌如大腸桿菌等沒有作用。電生理實驗表明，Bldesin具有Kv1.3通道抑制活性，1 μmol/L濃度的多肽能抑制約40%的Kv1.3通道電流。絲氨酸蛋白酶抑制相關(guān)實驗表明，Bldesin同時具有獨特的胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制活性。

4 小結(jié)與展望

因微生物感染死亡，特別是那些由耐藥微生物引起的死亡，已經(jīng)成為一個全球性問題，估計到2050年每年將導致1 000萬人死于微生物感染[19]。真菌在地球上存在了多長時間至今還不清楚，對真菌的起源也沒有確切的結(jié)論。真菌的有些特點和植物相似，然而在某些方面又和動物有相似之處。在長期的進化過程中，真菌進化出了獨特的抗微生物系統(tǒng)，已經(jīng)從真菌次生代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了包括青霉素在內(nèi)的一系列抗生素[20]。除了小分子抗生素外，真菌亦可分泌表達抗微生物多肽，本文對目前發(fā)現(xiàn)的來源于真菌的抗微生物多肽進行了系統(tǒng)的總結(jié)，這類多肽具有廣泛的抗微生物活性(抗細菌、抗真菌、抗病毒)和結(jié)構(gòu)多樣性(線性多條、含分子內(nèi)二硫鍵的多肽)。希望通過進一步的研究能從中發(fā)現(xiàn)具有作為候選藥物潛在價值的多肽分子。