蔓荊子藥材與炒蔓荊子指紋圖譜對比研究

瞿昊宇，陳光宇，佘義勇，何 群，謝夢洲*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.湖南省藥食同源功能性食品工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410208；3.中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；4.中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療重點(diǎn)研究室，湖南 長沙 410208)

蔓荊子為辛涼解表常用中藥，以“蔓荊實(shí)”之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]，為馬鞭草科植物蔓荊VitextrifoliaL.或單葉蔓荊VitextrifoliaL.var.simplicifoliacham的干燥成熟果實(shí)。主要產(chǎn)于江西、山東、福建、廣西、廣東、浙江、安徽等地，分布廣、產(chǎn)量大，其道地藥材產(chǎn)區(qū)為山東(道地藥材是指具有特定產(chǎn)區(qū)，貨真質(zhì)優(yōu)的中藥材)，味辛、苦，微寒，歸膀胱、肝、胃經(jīng)。具有疏散風(fēng)熱、清利頭目之功效，用于風(fēng)熱感冒頭疼、齒齦腫痛、目赤多淚、目暗不明、頭暈?zāi)垦?。為歷版中國藥典收載，以炮制品(炒蔓荊子)入藥，炒蔓荊子多用于風(fēng)熱感冒頭痛類的中藥處方中?，F(xiàn)代藥理研究表明，蔓荊子具鎮(zhèn)痛、抗炎、降壓、抗菌、祛痰、抗腫瘤等作用[2-3]。蔓荊子主要含揮發(fā)油和黃酮類成分，揮發(fā)油主要有茨烯、蒎烯、α-菲蘭烯、香檜烯、B-蒎烯等；黃酮類成分是蔓荊子鎮(zhèn)痛、抗菌、消炎等藥理作用的主要藥效成分。以蔓荊子黃素為代表，還有紫花牡荊素、木樨草素、篙黃素索多甲氧基黃酮、木揮草索-7-葡萄糖酯、四輕基甲氧基黃酮等。一般認(rèn)為蔓荊子經(jīng)炒制后，其辛散之性較為緩和，質(zhì)變酥脆，利于粉碎和有效成分的煎出。前期對蔓荊子炒制工藝進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，蔓荊子炒制后提高了有效成分的溶出，浸出物含量與蔓荊子黃素含量較生品均有所增加，其量值傳遞率高，表明優(yōu)選出來的炒蔓荊子炮制工藝科學(xué)、合理、穩(wěn)定、可靠、可行，但僅以浸出物含量與蔓荊子黃素含量為評價(jià)指標(biāo)不能全面反映蔓荊子炒制前后質(zhì)量屬性的改變，故為比較蔓荊子炒制前后化學(xué)成分的變化及質(zhì)量傳遞信息，評價(jià)炒蔓荊子的質(zhì)量屬性，本文通過研究蔓荊子炒制前后指紋圖譜的改變，為炒蔓荊子質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 儀器與藥材

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜系統(tǒng)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司；包括G1316A四元梯度泵、G1313A標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A恒溫箱、G1314A紫外檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站)；中文液晶臺(tái)式超聲波清洗器(昆山美美超聲儀器有限公司)；ME204E型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；TCS-100型電子臺(tái)秤(上海乾峰電子儀器有限公司)；PW135型中草藥粉碎機(jī)(天津泰斯特儀器有限公司)；SHH.W21電子三用水箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；QY-1中藥切片機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；HWS-80B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(天津市意博高科實(shí)驗(yàn)儀器廠)；101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；LC-E096P灶頭(電陶爐，廣東順德忠臣電器有限公司)。

1.2 藥材及試劑

28批蔓荊子原藥材經(jīng)王智教授鑒定為單葉蔓荊V.trifoliaL.var.simplicifoliaCham.的干燥成熟果實(shí)；炒蔓荊子(由本實(shí)驗(yàn)室自制)；蔓荊子黃素對照品(批號：111554-201705)購于中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))，供含量測定用(蔓荊子黃素含量98.3%)；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炒蔓荊子炮制方法

取蔓荊子藥材，按2020版《中國藥典》一部363頁蔓荊子藥材項(xiàng)下檢查符合有關(guān)規(guī)定，無蟲蛀、無霉變，有清香味，挑選除去雜草及碎石粒，20目篩篩選，風(fēng)選簸除去雜質(zhì)、灰屑及部分宿萼碎片，凈制處理，將炒藥鍋加熱使其升溫至100 ℃，取100 g前處理的蔓荊子藥材投入鍋中，炒制5 min，取出，晾涼，20目篩篩選，再風(fēng)選簸除去雜質(zhì)、灰屑及部分宿萼碎片。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[4-6]

液相色譜柱(月旭，Ultimate?XB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；洗脫方式：線性梯度，0～70 min(20%～80%甲醇)檢測波長為258 nm，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃，理論板數(shù)按蔓荊子黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

2.3 供試品溶液的制備

分別取28批各批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子樣品粉末(過三號篩)約2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，置水浴中加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心7 min，取上清液過0.22 μm濾膜至進(jìn)樣小瓶中，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照供試品溶液的制備

取缺蔓荊子原藥材和炒蔓荊子樣品的甲醇溶劑，按“2.2”項(xiàng)同法制備，即得陰性供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，檢測指紋圖譜峰，各共有峰相對保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.896%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品6份，按“2.2”項(xiàng)方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，測定其HPLC譜圖，各共有峰相對保留時(shí)間和峰面積的比值大體一致，RSD=2.947%，表明本分析方法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，測定其HPLC譜圖，各共有峰相對保留時(shí)間和峰面積的比值基本一致，RSD=1.853%，表明供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 指紋圖譜色譜峰的標(biāo)定[7-8]

取蔓荊子黃素約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，精密加入甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素1.07 mg的母液1；精密移取1 mL蔓荊子黃素母液1置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素0.107 mg的母液2；精密移取3 mL蔓荊子黃素母液2于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含蔓荊子黃素32.1 μg的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜至進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行高效液相色譜分析。照“2.1”項(xiàng)和“2.3”項(xiàng)下處理的蔓荊子藥材及炒蔓荊子供試品溶液，“2.4”項(xiàng)下陰性對照溶液，“2.6”項(xiàng)下蔓荊子黃素對照品溶液的色譜見圖1-圖4。

圖1 陰性對照品(甲醇空白)

圖2 蔓荊子黃素對照品

圖3 蔓荊子原藥材供試品

圖4 炒蔓荊子供試品

2.7 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的HPLC指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)(相似度的計(jì)算)

采用國家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2012版》，對28批單葉蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜進(jìn)行分析[7-9]，設(shè)定時(shí)間窗寬度0.1 min、多點(diǎn)校正、譜峰匹配，以MJZ-01及CMJZ-01色譜圖為藥材及炮制品的參照圖譜，藥材及炮制品各15批不同來源蔓荊子指紋圖譜見圖5-圖6。由圖可知，每批蔓荊子原藥材或炒蔓荊子含有8個(gè)共有色譜峰，其中保留時(shí)間為66.0 min處的8號色譜峰為蔓荊子黃素對照品的色譜峰。

圖5 28批蔓荊子原藥材供試品

圖6 28批炒蔓荊子供試品

28批蔓荊子藥材和炒蔓荊子各樣品指紋圖譜與生成的對照圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果，見表1。

對表1中28批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子指紋圖譜相似度進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，得配對樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.968 4，其均值差異檢驗(yàn)t=0.120 6，df=27，P=0.904 9，結(jié)果表明蔓荊子原藥材和炒蔓荊子指紋圖譜大體一致，蔓荊子炒制前后其化學(xué)成分變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜相似度分析結(jié)果

2.8 蔓荊子藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量分析與比較

15批符合2020版《中國藥典》蔓荊子藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蔓荊子藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量結(jié)果，見表2。

對表2中15批蔓荊子原藥材和炒蔓荊子中蔓荊子黃素含量進(jìn)行配對t檢驗(yàn)，得配對樣本相關(guān)系數(shù)γ=0.959 6，其均值差異檢驗(yàn)t=4.123 7，df=14，P=0.001 0，結(jié)果表明蔓荊子原藥材經(jīng)過炮制后所得的炒蔓荊子，其蔓荊子含量顯著增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 蔓荊子原藥材和炒蔓荊子的指紋圖譜相似度分析結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究建立了以《中國藥典》2020版蔓荊子含量測定項(xiàng)下供試品溶液為原料液的指紋圖譜，與已報(bào)道的蔓荊子指紋圖譜研究中采用氯仿制備供試品溶液相比，所用溶劑僅為甲醇，溶劑毒性低，一步回流提取過濾即可，過程簡單，結(jié)果重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，可作為《中國藥典》收載蔓荊子藥材及炮制品指紋圖譜項(xiàng)目提供參考。

由指紋圖譜可知，蔓荊子炒制前后指紋圖譜相似度基本未改變，說明其化學(xué)成分炒制前后保持一致，質(zhì)量屬性保持一致。

由蔓荊子黃素含量可知，蔓荊子炒制后其蔓荊子黃素含量較生品均有所增加，說明炮制可以除去蔓荊子藥材中的雜質(zhì)，保留藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。