CCNA2基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)、信號通路和預(yù)后關(guān)系生物信息分析及驗(yàn)證

楊 結(jié),劉樹業(yè),劉運(yùn)德

楊結(jié),劉樹業(yè),天津醫(yī)科大學(xué)三中心臨床學(xué)院檢驗(yàn)科,天津市肝膽疾病研究所,天津市人工細(xì)胞重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,衛(wèi)生部人工細(xì)胞工程技術(shù)研究中心 天津市 300170

劉運(yùn)德,天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院 天津市 300170

核心提要：CCNA2基因在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,CCNA2蛋白高表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑(P＜0.05)、DC浸潤(P＜0.05)、術(shù)后2年復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移(P＜0.05)和預(yù)后不良有關(guān).CCNA2高表達(dá)可作為HCC預(yù)后不良的分子標(biāo)志物.

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌[1].HCC在歐美等發(fā)達(dá)國家高加索人種中發(fā)病率較低,但在東南亞,尤其是我國發(fā)病率較高[2].雖然年輕人群甚至兒童肝癌臨床中偶爾可見,但HCC主要影響50歲以上的男性.肝也是膽管癌(肝內(nèi)膽管癌)的主要部位,膽管癌相對少見,占所有原發(fā)性肝癌的10%-20%.目前HCC的危險(xiǎn)因素較為明確,包括：乙肝、丙肝病毒感染,肝硬化、黃曲霉毒素暴露和先天性代謝異常如α-1抗胰蛋白酶缺乏癥等[3-6].HCC的一個(gè)共同的特點(diǎn)是肝纖維化和炎癥的存在,低分化的腫瘤表現(xiàn)出明顯的多形性,巨細(xì)胞與正常肝細(xì)胞幾乎沒有相似之處.

已有研究顯示CCNA2基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)[7,8],而CNNA2在HCC的研究未見報(bào)道.本研究首先采用生物信息學(xué)分析CNNA2在HCC中的表達(dá)及相關(guān)信號通路.同時(shí),采用免疫組織化學(xué)法檢測72例HCC患者癌組織中CNNA2的表達(dá)及其與HCC患者預(yù)后的關(guān)系對生物信息分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 CCNA2表達(dá)水平分析：檢索TCGA數(shù)據(jù)庫,對比各組織及實(shí)體腫瘤組織中CCNA2基因的表達(dá)水平.檢索分析條件為“肝細(xì)胞癌”,“肝癌”,“CCNA2”,物種為人類.同時(shí)比較CCNA2基因在HCC患者癌組織和癌旁組織中是否存在差異.存在差異表達(dá)的條件為CCNA2基因mRNA上調(diào)或下調(diào)表達(dá)超過2倍(|Log2FC|＞1),且P＜0.05[9].

1.1.2 CCNA2蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)：應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建CCNA2蛋白相互作用的蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò),CCNA2蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為置信度大于0.7,相互作用來源為共表達(dá)、基因功能和比鄰關(guān)系[10].

1.1.3CCNA2基因共表達(dá)及生存分析：在TCGA數(shù)據(jù)庫中,依據(jù)與CCNA2基因共表達(dá)關(guān)系,對與CCNA2基因存在相關(guān)性的基因進(jìn)行聚類.同時(shí)選取正相關(guān)和負(fù)相關(guān)表達(dá)最為明顯的2個(gè)基因進(jìn)行分析,計(jì)算spearman相關(guān)系數(shù)；根據(jù)CCNA2基因mRNA在HCC患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù),分為高低表達(dá)組,繪制生存分析曲線,并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)比較高低表達(dá)組患者總生存(overall survival,OS)和無疾病進(jìn)展生存(disease free survival,DFS)是否存在差異.

1.2 方法 免疫組化檢測CCNA2蛋白表達(dá)驗(yàn)證生物信息結(jié)果：同時(shí)回顧性分析我院收治手術(shù)之類的HCC患者72例,采用免疫組織化學(xué)法檢測腫瘤組織中CCNA2蛋白表達(dá)水平,分析比較CCNA2蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系.免疫組織化學(xué)檢測CCNA2蛋白表達(dá)按試劑盒操作說明進(jìn)行.CCNA2蛋白表達(dá)高低表達(dá)標(biāo)注：在顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(SP×400)下進(jìn)行觀察.染色強(qiáng)度評分：不著色(0分)、淺黃(1分)、棕黃(2分)、棕褐色(3分)；陽性細(xì)胞比例評分：陽性＜10%(0分)；陽性10到25%(1分)；陽性26-50%(2分)；陽性51-75%(3分)及陽性＞75%(4分).總體評分值=陽性細(xì)胞比例評分×染色強(qiáng)度評分；最終評判：＜6分為低表達(dá),≥6分為高表達(dá).

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理Stata 12.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料應(yīng)用Mean±SD表示,t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n表示,χ2檢驗(yàn),CCNA2基因高低表達(dá)組生存期采用Log-rank檢驗(yàn),P＜0.05為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1CCNA2基因表達(dá) 在正常組織中CCNA2中mRNA在食管組織、睪丸組織和脾臟中表達(dá)最高,而在肝臟、胰腺和骨骼肌中表達(dá)最低(圖1A).在腫瘤組織中,睪丸癌、HCC和宮頸癌中表達(dá)水平相對較高,而甲狀腺癌、前列腺癌和腎癌表達(dá)水平較低(圖1B).在HCC中,CCNA2中mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肝組織(圖1C).

2.2 CCNA2蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 通過STRING數(shù)據(jù)庫,構(gòu)建CCNA2蛋白-蛋白相互作網(wǎng),與CCNA2蛋白相互作用較為緊密的蛋白10個(gè),蛋白間相互作用關(guān)系edge= 50,區(qū)域聚類指數(shù)為0.931,與CCNA2蛋白相互作用較為緊密的10蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)富集顯著(P＜0.05)(圖2).

2.3CCNA2基因共表達(dá)分析 對與CCNA2基因正負(fù)相關(guān)表達(dá)的基因進(jìn)行了聚類分析(圖3),TOP2基因mRNA與CCNA2正向相關(guān)表達(dá)(r= 0.85,P＜0.05)(圖4A).而CCL14基因與CCNA2負(fù)相關(guān)表達(dá)(r= -0.54,P＜0.05)最為顯著[11](圖4B).

2.4 功能富集 CCNA2生物學(xué)過程主要富集于核分裂、染色體分離、有絲分裂細(xì)胞周期過程等(圖5)；細(xì)胞成分主要富集于凝聚染色體、染色體、著絲粒區(qū)和微管細(xì)胞骨架等(圖6).而分子功能分別主要富集于APT酶活性、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ型(DNA水解酶)活性和DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性等(圖7).

2.5 KEGG信號通路CCNA2基因相關(guān)信號通路主要富集于細(xì)胞周期、病毒致癌、乙型肝炎、p53信號通路和PI3K-Akt信號通路等(圖8,表1).

2.6 生存分析 依據(jù)CCNA2基因mRNA在HCC患者癌組織中表達(dá)的中位數(shù)分為高低表達(dá)組,預(yù)后分析提示CCNA2基因mRNA高表患者OS(HR = 1.7,P= 0.0037)(圖9A)和DFS低于低表達(dá)組(HR = 1.6,P= 0.0037)(圖9B).

2.7 免疫組化CCNA2蛋白表達(dá)情況與HCC患者臨床病理特征關(guān)系 免疫組化顯示CCNA2蛋白主要表達(dá)于HCC細(xì)胞核,呈現(xiàn)棕褐色顆粒(圖10).CCNA2蛋白在HCC患者癌組織中的高表達(dá)率為34.7%(25/72).CCNA2蛋白高表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑(P＜0.05)、DC浸潤(P＜0.05)和術(shù)后2年復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移(P＜0.05)有關(guān)(表2).

表1 CCNA2及相關(guān)基因KEGG信號通路

表2 CCNA2蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征關(guān)系

圖1 CCNA2基因在正常組織和不同腫瘤組織中的表達(dá).

圖2 與CCNA2蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)信號通路網(wǎng)絡(luò).

圖3 CCNA2基因共表達(dá)分析.

圖4 CCNA2共表達(dá)正負(fù)相關(guān)基因散點(diǎn)圖.

3 討論

HCC患者的總中位生存期為4 mo左右,總5年生存率為3%.HCC的預(yù)后較差,相關(guān)預(yù)后因素包括腫瘤大小、是否存在癌栓等[12].近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展,越來越多的證據(jù)顯示,HCC的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因多步驟的過程,由肝纖維化逐漸發(fā)展為肝硬化進(jìn)而發(fā)展為HCC.同時(shí)也有研究顯示[13],從肝纖維化到HCC轉(zhuǎn)化的過程中,肝組織中的基因表達(dá)譜呈現(xiàn)明顯的改變,檢測這些基因表達(dá)普的改變,有助于判斷HCC的病理進(jìn)程,同時(shí)也對HCC的診斷和預(yù)后具有一定的預(yù)測價(jià)值.

圖5 CCNA2和共表達(dá)基因生物學(xué)過程富集柱狀圖.

已有研究顯示[8]CCNA2基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),而CNNA2在HCC的研究未見報(bào)道.CCNA2定位于人4號染色體,q27區(qū),基因全長7489 bp,該基因編碼蛋白屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族,在人體幾乎所有組織中均有表達(dá)[14].它在G1/S期和G2/M期的細(xì)胞周期控制中起著關(guān)鍵作用.同時(shí)又研究報(bào)道,miR-22在HCC中對其具有調(diào)控作用[15,16].來自人類蛋白質(zhì)圖譜的數(shù)據(jù)顯示[17],CCNA2在人體多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過度表達(dá),表明其在癌癥轉(zhuǎn)化和進(jìn)展中的潛在作用.也有報(bào)道稱,CCNA2可能參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的過程[18].然而,CCNA2在HCC中的研究未見報(bào)道,其在HCC組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平、生物學(xué)功能及與患者預(yù)后的關(guān)系并不清楚.在本研究中,首先采用生物信息學(xué)分析CNNA2在HCC中的表達(dá)及相關(guān)信號通路.我們發(fā)現(xiàn)在HCC中,CCNA2中mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肝組織,提示CCNA2在HCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用,這與既往CCNA2在其他腫瘤中的研究結(jié)果基本一致；CCNA2基因相關(guān)信號通路主要富集于細(xì)胞周期、病毒致癌、乙型肝炎、p53信號通路和PI3K-Akt信號通路等,上述信號通路符合HCC已知在HCC中的作用機(jī)制.共表達(dá)分析顯示,TOP2基因mRNA與CCNA2正向相關(guān)表達(dá)(r= 0.85,P＜0.05),而CCL14基因與CCNA2負(fù)相關(guān)表達(dá)(r= -0.54,P＜0.05)最為顯著.提示TOP2基因可能在生物學(xué)功能方面與CCNA2具有協(xié)同效應(yīng),而CCL14與CCNA2具有拮抗作用.但上述協(xié)同和拮抗作用有待相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí).

預(yù)后分析提示CCNA2基因mRNA高表患者OS(HR= 1.7,P= 0.0037)；和DFS低于低表達(dá)組(HR = 1.6,P=0.0037).免疫組化顯示CCNA2蛋白在HCC患者癌組織中的高表達(dá)率為34.7%.CCNA2蛋白高表達(dá)者腫瘤直徑較大、DC浸潤較為嚴(yán)重及術(shù)后復(fù)發(fā)率較高.上述因素佐證了CCNA2高表達(dá)是HCC患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素.

CCNA2基因在HCC患者癌組織中表達(dá)水平上調(diào),并可作為HCC預(yù)后不良的分子標(biāo)記物.同時(shí),CCNA2也可作為HCC靶向藥物開發(fā)的潛在靶點(diǎn),進(jìn)一步對其調(diào)控HCC相關(guān)分子生物學(xué)功能開展相關(guān)研究,有望開發(fā)出抑制HCC的靶向藥物.

圖6 CCNA2和共表達(dá)基因細(xì)胞成分富集柱狀圖.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

已有研究顯示CCNA2基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá),而CNNA2在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的研究未見報(bào)道,其生物學(xué)功能及其作為HCC預(yù)后分子標(biāo)志物可行性不清.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

通過生物信息學(xué)分析和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),分析CCNA2在HCC中的表達(dá)情況,判斷其表達(dá)與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系及其作為HCC預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討CCNA2在HCC中的表達(dá)及其作為HCC預(yù)后分子標(biāo)志物的臨床價(jià)值.

實(shí)驗(yàn)方法

比對TCGA數(shù)據(jù)庫中CCNA2基因mRNA在HCC組織和癌旁組織中表達(dá)水平；構(gòu)建CCNA2蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),并對相關(guān)蛋白功能和KEGG信號通路進(jìn)行富集.比較CCNA2高低組患者總生存和無疾病進(jìn)展生存是否不同.采用免疫組織化學(xué)法檢測患者癌組織中CCNA2蛋白表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系,對生物信息分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.

圖7 CCNA2和共表達(dá)基因分子功能富集柱狀圖.

圖8 CCNA2及相關(guān)基因功KEGG信號通路氣泡圖.

圖9 CCNA2基因mRNA表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者總生存和無疾病進(jìn)展生存的關(guān)系.

圖10 免疫組化CCNA2蛋白表在肝細(xì)胞癌和癌旁正常肝組織中的達(dá)情況.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCNA2基因在HCC患者癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,CCNA2蛋白高表達(dá)與HCC患者腫瘤直徑(P＜0.05)、DC浸潤(P＜0.05)、術(shù)后2年復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移(P＜0.05)和預(yù)后不良有關(guān).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

CCNA2基因在HCC患者癌組織中表達(dá)水平上調(diào),并可作為HCC預(yù)后不良的分子標(biāo)記物.

展望前景

CCNA2在干細(xì)胞癌患者癌組織中高表達(dá),且高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān).研究結(jié)果為開發(fā)抑制HCC中CCNA2表達(dá)靶向治療藥物提供了新的潛在靶點(diǎn).