GPX3在胃癌中的表達及臨床意義

張海平,李蜀豫

張海平,李蜀豫,湖北省中山醫(yī)院消化內(nèi)科 湖北省武漢市 430000

核心提要：本文通過組織芯片技術(shù)證實谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3,GPX3)在胃癌(gastric cancer,GC)中的表達及其與GC患者的預后聯(lián)系,GPX3在GC中呈低表達,表達越低,預后越好.

0 引言

胃癌(gastric cancer,GC)是人類常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率高、早期診斷率低、預后差[1].據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,GC死亡率居所有腫瘤中第三位,死亡人數(shù)占癌癥總死亡人數(shù)8.2%[2].GC發(fā)病主要集中于亞洲,尤其在部分東南亞國家(如中國、韓國、日本)GC全球發(fā)病率最高,在GC的早期篩查及治療方面,給全球衛(wèi)生經(jīng)濟帶來了沉重的負擔.

谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3,GPX3)是機體抗氧化功能的重要基因,GPX3適度表達對維持機體正常新陳代謝有重要作用.現(xiàn)有證據(jù)表明GPX3異常表達與消化道腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切[3].目前關(guān)于GPX3基因甲基化導致GPX3表達下降的研究較多[4],但GPX3異常表達與GC患者的臨床預后關(guān)系尚不明確.目前生物信息學正飛速發(fā)展,腫瘤研究處于信息大爆炸時代.國外公共基因芯片和RNA測序數(shù)據(jù)庫(如Oncomine、KM Plotter、TCGA等)收集了大量關(guān)于腫瘤基因表達及預后的豐富信息,可供學者挖掘潛在的腫瘤標志物[5-8].本研究中利用國外公共基因芯片和RNA測序數(shù)據(jù)庫分析GPX3在GC中的表達和預后價值,并運用組織芯片技術(shù)對上述結(jié)果進行證實,為后續(xù)GPX3作為GC診治標志物提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 首先,通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中的4個數(shù)據(jù)集(GSE13861、GSE27342、GSE13911和GSE19826)分析GPX3在GC中的表達；利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析GPX3在GC患者中的預后,共6個數(shù)據(jù)集(GSE14210,GSE15459,GSE22377,GSE29272,GSE51105和GSE62254)納入此研究.其次,利用TCGA數(shù)據(jù)集對GPX3在GC患者中的表達和預后再次進行驗證分析.最后通過組織芯片技術(shù)對GPX3在GC中的表達及預后價值進行臨床階段的驗證分析.

1.2 方法

1.2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析：Oncomine數(shù)據(jù)庫(http：//www.oncomine.org)是由美國密歇根大學創(chuàng)建的用于分析基因表達、基因共表達、突變、耐藥、預后等的重要腫瘤數(shù)據(jù)庫,目前共收集715個數(shù)據(jù)集和86733樣本[9].本研究中利用該數(shù)據(jù)庫分析GPX3基因在GC組織與正常組織中的在mRNA水平上的表達情況,共4個數(shù)據(jù)集(GSE13861、GSE27342、GSE13911和GSE19826)納入此次研究.基因表達差異倍數(shù)大于2且P值小于0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義.最后,運用組織芯片技術(shù)對GPX3在GC中的表達和預后進行臨床驗證分析.

1.2.2 KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析：KM Plotter數(shù)據(jù)庫(http：//kmplot.com/analysis/)是專門用于分析基因表達與腫瘤預后的重要數(shù)據(jù)庫,該數(shù)據(jù)庫可分析10461腫瘤樣本中的54675種基因在腫瘤患者中的預后價值[10].截止目前為止,該數(shù)據(jù)庫包含5143個乳腺癌樣本,1618個卵巢癌樣本,2437個肺癌樣本和1065個GC樣本,平均隨訪周期分別為69、40、49、33 mo.本研究中利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析GPX3在GC患者中的預后,共6個數(shù)據(jù)集(GSE14210,GSE15459,GSE22377,GSE29272,GSE51105和GSE62254)納入此次研究中.根據(jù)GPX3表達中位值將GC患者分為低表達組和高表達組,通過計算Log-rankP值和HR及95%CI來估算總體生存期.

1.2.3 TCGA數(shù)據(jù)集驗證：為進一步證實GPX3在GC患者中的表達和預后模式,我們通過UALCAN網(wǎng)站(http：//ualcan.path.uab.edu)對TCGA數(shù)據(jù)庫中GPX3在GC患者中的表達和預后再次進行分析.UALCAN網(wǎng)站包含了TCGA數(shù)據(jù)庫中31種腫瘤的RNA測序數(shù)據(jù)[11].該網(wǎng)站有助于用戶尋找一些潛在的腫瘤標志物,包括診斷標志物、預后標志物和治療靶點.

1.2.4 組織芯片技術(shù)：90對胃腺癌及癌旁組織標本取自上海芯超生物科技有限公司組織庫2009-04/2009-11新鮮手術(shù)切除標本,全部病例術(shù)前均未作化療或放療.其中男性62例,女性28例,年齡32-89歲,平均年齡64歲；AJCC第七版臨床分期：Ⅰ期10例,Ⅱ期24例,Ⅲ期54例,Ⅳ期2例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；遠處轉(zhuǎn)移2例,無遠處轉(zhuǎn)移78例.隨訪周期3-75 mo.所有患者均知情同意,本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過.所有組織標本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定,常規(guī)脫水、石蠟包埋備用.

免疫組化染色劑結(jié)果判讀,抗GPX3單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,二抗由上海芯超生物科技有限公司提供.組織芯片由上海芯超生物科技有限公司制作.將組織芯片放入烘箱中,溫度調(diào)至63 ℃,烘蠟一小時,脫蠟處理后檸檬酸進行抗原修復.滴加一抗,室溫孵育,4 ℃冰箱過夜,經(jīng)PBS沖洗液沖洗；滴加二抗即用工作液,室溫孵育,計時30 min.經(jīng)DAB、蘇木紫復染后,Aperio軟件進行掃描.免疫組化評分參考表達陽性率和染色強度兩個指標：陽性率≥50%記1分,＜50%記0分；陰性染色記0分,輕度染色記1分,中等染色記2,強染色記3分.兩項乘積即為該例組織的免疫組化評分,0-1分為低表達組,2-3分為高表達組.免疫組化評分參考文獻[12]

統(tǒng)計學處理應用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù),計數(shù)資料采用t檢驗,計量資料采用χ2檢驗.GPX3表達與GC預后的關(guān)系采用Kaplan-Meier模型分析,采用Logrank檢驗法.以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 GPX3在GC中的表達模式 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫分析GPX3mRNA的表達,發(fā)現(xiàn)GPX3基因在GC組織中的表達顯著低于正常胃黏膜組織(P= 8.83E-10,FC =-2.140)(圖1A).對不同類型GC中GXP3mRNA的表達進行分析,發(fā)現(xiàn)GPX3在彌漫型GC(P= 5.29E-13,FC =-3.586)、腸型GC(P= 5.67E-8,FC = -3.658)的表達均顯著低于正常胃黏膜組織(圖1B-C).

2.2 GPX3低表達在GC的預后價值 利用KM Plotter數(shù)據(jù)庫分析GPX3的預后價值,發(fā)現(xiàn)GPX3低表達與GC患者的預后呈負相關(guān),GPX3表達越低,GC患者總體生存期越長(HR = 2.53,95%CI：2.0-3.2)(圖2A).進一步分析發(fā)現(xiàn),GPX3表達在彌漫型GC患者(HR = 2.30,95%CI：1.44-3.68)和腸型GC患者(HR = 2.85,95%CI：2.02-4.00)中均有預后價值(圖2B-C),GPX3表達越低,總體生存率越好.此外,GPX3表達在Her2陰性GC患者(HR = 2.57,95%CI：1.14-2.17)和Her2陽性GC患者(HR = 2.24,95%CI：1.75-2.86)中均有預后價值,GPX3表達越低,總體生存率越好(圖3).

2.3 GPX3的表達模式和預后價值在TCGA數(shù)據(jù)庫中的驗證 對TCGA數(shù)據(jù)庫中GC患者GPX3的表達和預后模式進行分析發(fā)現(xiàn),GPX3在GC中呈低表達狀態(tài),GPX3的低表達提示GC患者總體生存期更長(圖4).上述結(jié)果提示GPX3的低表達可能正常胃上皮黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)镚C的重要分子生物學事件,GPX3或可作為GC診治的新靶點.

2.4 GPX3的表達模式和預后價值在組織芯片中的驗證 GPX3在GC組織中低表達為55.6%(50/90)、高表達為44.4%(40/90)；癌旁組織中GPX3低表達為40%(36/90)、高表達為60%(54/90)；GPX3在GC組織中表達較癌旁組織明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P= 0.037),但與患者的年齡、性別、脈管浸潤、腫瘤臨床分期無關(guān)(表1).生存分析提示GPX3表達與GC患者預后顯著相關(guān)(HR =0.48,95%CI：0.28-0.85,P= 0.019)(圖5).

3 討論

GC作為全球最常見的消化道惡性腫瘤之一,盡管藥物治療在不斷改進,然而GC總體生存期仍不容樂觀.因此尋找GC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點,有助于GC早期診斷和GC的新靶向治療方案具有重要的理論和臨床意義.

GPX3在人體清除過氧化氫及脂質(zhì)過氧化物中起重要作用,是人體維持穩(wěn)態(tài)的重要過氧化物分解酶.越來越多的證據(jù)表明GPX3異常表達是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素.現(xiàn)有研究表明,GPX3異常表達與消化道腫瘤[3]、前列腺癌[13]、卵巢癌[14]、子宮內(nèi)膜癌[15]、甲狀腺癌[16]、乳腺癌[17]、肺癌[18]密切相關(guān),且GPX3表達異常與前列腺癌[19]、卵巢癌[14]、甲狀腺癌[16]、肺癌[18]、膀胱癌[20]、口咽癌[21]、肝癌[22]預后顯著相關(guān).但GPX3的異常表達與GC患者的臨床預后關(guān)系尚不明確.

表1 GPX3在胃癌中的表達與胃癌患者臨床病理聯(lián)系

圖1 GPX3在胃癌中的表達.

本研究為探索GPX3基因作為GC診治標志物的價值,利用數(shù)據(jù)挖掘的方法分析了GPX3在GC患者中的表達模式和預后價值.我們發(fā)現(xiàn)GPX3在GC中呈低表達狀態(tài),且在彌漫型和腸型GC中均呈現(xiàn)出低表達狀態(tài).進一步分析GPX3作為GC預后標志物的價值,我們發(fā)現(xiàn)GPX3對不同亞型GC患者(Luraen亞型、Her2亞型)的預后均有一定的指導意義.組織芯片技術(shù)是近年來較為成熟技術(shù)并廣泛運用于腫瘤標志物的研究.我們通過組織芯片技術(shù)證實GPX3低表達與GC患者預后顯著相關(guān),但GPX3與GC患者的年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤、遠處轉(zhuǎn)移等無明顯相關(guān)性.鑒于本研究中樣本數(shù)量偏小,GPX3表達與GC患者的臨床病理預后需進一步去證實.

與抑癌基因的預后模式相略有不同,本研究提示GPX3表達越低,預后越好.關(guān)于GPX3參與GC進展的機制尚有待于進一步去挖掘.部分研究還提示GPX3可通過誘導氧化應激是使癌細胞細胞周期停滯在G2/M期[23].另有證據(jù)提示GPX3可通過FAK/AKT信號通路調(diào)控癌細胞的侵襲遷移[24],并影響順鉑類藥物的化療療效[25].上述結(jié)果表明GPX3的表達變化可能正常胃上皮黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)镚C的重要分子生物學事件,GPX3或可作為GC診治的新靶點.

圖2 GPX3在不同組織類型的胃癌患者的預后價值,GPX3表達越低表達越低,總體生存率越高.

圖3 GPX3在不同Her2狀態(tài)下的胃癌患者的預后價值,GPX3表達越低表達越低,總體生存率越高.

圖4 GPX3的表達和預后模式在TCGA數(shù)據(jù)庫中的驗證.

綜上所述,GC組織中GPX3低表達與GC患者的預后顯著相關(guān).結(jié)合目前已有的研究結(jié)果.我們推測GPX3在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,有望成為GC診治的新靶點.關(guān)于GPX3在GC疾病發(fā)展中的具體作用機制,尚需要更多的實驗來探索證明.

文章亮點

研究背景

目前關(guān)于谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase3,GPX3)在胃癌(gastric cancer,GC)中的研究主要集中于GPX3基因甲基化狀態(tài),GPX3在GC中程高度甲基化導致GPX3表達下降,但GPX3表達與GC患者預后的聯(lián)系尚不明確.

圖5 GPX3 在胃癌中的表達及預后.

研究動機

明確GPX3在GC中的表達及預后模式,尋找GC早診早治的新靶點.

研究目的

本研究旨在分析GPX3在GC中的表達與GC患者預后的聯(lián)系,為GC患者的診斷、預后治療策略提供政證據(jù).

研究方法

本研究中運用大量芯片數(shù)據(jù)從GPX3的表達、預后兩方面同時進行科學分析,并通過組織芯片技術(shù)對芯片數(shù)據(jù)進行驗證.

研究結(jié)果

GPX3在GC組織中表達較癌旁組織明顯降低,但與患者的年齡、性別、脈管浸潤、腫瘤臨床分期無關(guān),生存分析提示GPX3表達與GC患者預后顯著相關(guān).

研究結(jié)論

我們分析了GPX3在GC中的表達及預后模式,GC組織中GPX3低表達與GC患者的預后顯著相關(guān).GPX3的表達變化可能正常胃上皮黏膜轉(zhuǎn)變?yōu)镚C的重要分子生物學事件,GPX3或可作為GC診治的新靶點.

研究展望

GPX3在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用,有望成為GC診治的新靶點.關(guān)于GPX3在GC疾病發(fā)展中的具體作用機制,尚需要更多的實驗來探索證明.