麥冬皂苷D通過調(diào)控miR-519d-3p/EIF4E表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的實(shí)驗(yàn)研究

申 鵬,汪正飛

申鵬,汪正飛,衢州市人民醫(yī)院肝膽外科 浙江省衢州市 324000

核心提要：麥冬皂苷D可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其作用機(jī)制與調(diào)控miR-519d-3p/EIF4E表達(dá)有關(guān).

0 引言

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類的生命健康.HCC治療以常規(guī)手術(shù)切除為主,輔助放療和化療.但目前,HCC的治療效果不佳,患者預(yù)后較差,易發(fā)生早期侵襲和轉(zhuǎn)移[1,2].因此,尋找能夠抑制HCC轉(zhuǎn)移和侵襲的藥物具有重要意義.麥冬是百合科沿階草屬植物麥冬的肉質(zhì)塊根,具有保護(hù)血管、抗心肌缺血、降血糖等功效,在中醫(yī)臨床中廣泛使用[3,4].常用的中藥材.麥冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)是麥冬提取物中重要的單體成分,同樣具有多種生物學(xué)效應(yīng)[5].研究顯示,OPD可能通過受體相互作用蛋白1/混合譜系激酶結(jié)構(gòu)區(qū)域樣蛋白通路誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞程序性壞死抑制其生長[6].OPD可能通過下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白B1表達(dá),阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展,抑制人乳腺癌細(xì)胞生長[7].但目前,OPD影響HCC細(xì)胞的生物學(xué)行為的相關(guān)研究還未見報(bào)道.miRNA是一類內(nèi)源性的小分子非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá),進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8].研究顯示,miR-519d-3p在胃癌[9]、乳腺癌[10]等腫瘤中異常表達(dá),上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲,是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn).但目前,miR-519d-3p在HCC中的作用還未知.生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示,真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,EIF4E)是miR-519d-3p的靶基因.EIF4E是真核細(xì)胞翻譯起始因子家族的一員,也參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程.研究顯示,HCC組織中EIF4E表達(dá)升高,其高表達(dá)的患者5年生存率降低,可作為HCC的預(yù)后生物標(biāo)記物[11].Ding等[12]研究顯示,EIF4E參與HCC細(xì)胞的增殖和集落形成.本研究以HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97為研究對象,主要探討了OPD對HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,并以miR-519d-3p/EIF4E軸為切入點(diǎn),分析OPD影響HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的可能機(jī)制,以期為HCC治療藥物的研發(fā)提供新思路.

1 材料和方法

1.1 材料 HCC細(xì)胞株HepG2和MHCC97,ATCC細(xì)胞庫；OPD,上海一飛生物科技有限公司,純度＞98%；胎牛血清,杭州四季青；DMEM培養(yǎng)基,北京索萊寶公司；Trizol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen公司；miR-519d-3p mimics、陰性對照等,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；四甲基噻唑藍(lán)(methylthiazoletrazolium,MTT)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),美國Sigma公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,北京諾博萊德科技有限公司；PCR試劑盒,日本TOYOBO公司；引物序列由上海生工生物技術(shù)公司提供；放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白測定試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒,上海碧云天公司；鼠抗人單克隆抗體細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)和p21抗體,美國Santa Cruz公司；鼠抗人單克隆抗體基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9,福州邁新技術(shù)開發(fā)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：HepG2和MHCC97細(xì)胞,均用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細(xì)胞生長密度達(dá)到80%時(shí),胰酶消化,傳代培養(yǎng).分別取對數(shù)生長期的HepG2、MHCC97細(xì)胞,接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至60%時(shí),參照LipofectamineTM2000說明書.分別轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染miR-519d-3p模擬物(mimics)及陰性對照(miR-NC)、miR-519d-3p抑制劑(anti-miR-519d-3p)及陰性對照(anti-miRNC)、EIF4E小干擾RNA(si-EIF4E)及亂序無意義序列(si-NC).轉(zhuǎn)染24 h后,更換新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞分組處理：未轉(zhuǎn)染的HepG2、MHCC97細(xì)胞均分為對照組：細(xì)胞正常培養(yǎng),不做任何處理；OPD組：含不同濃度[6](2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L)OPD的培養(yǎng)基作用48 h.轉(zhuǎn)染miR-519d-3p mimics、miR-NC、si-EIF4E、si-NC的HepG2和MHCC97細(xì)胞均培養(yǎng)48 h,分別記為miR-519d-3p 組、miR-NC組、si-EIF4E組和si-NC組.轉(zhuǎn)染anti-miR-519d-3p、anti-miRNC的HepG2和MHCC97細(xì)胞均用含10 μmol/L OPD的培養(yǎng)基作用48 h,分別記為OPD+anti-miR-519d-3p組、OPD+anti-miR-NC組.

1.2.3 MTT檢測細(xì)胞增殖：未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染后的HepG2、MHCC97細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/mL,接種于96孔板中,每孔200 μL,置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細(xì)胞貼壁后按照1.2.2分組處理.培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)培養(yǎng)4 h.然后吸棄培養(yǎng)基,加入150 μL DMSO溶液,反應(yīng)5 min,混勻后于全自動酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度值.

1.2.3 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲：未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染后的HepG2、MHCC97細(xì)胞,用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取100 μL細(xì)胞懸液加入至Transwell小室的上室,下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,上室細(xì)胞按照1.2.2處理后,吸棄培養(yǎng)基.取出小室,PBS清洗細(xì)胞,經(jīng)甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,倒置顯微鏡下觀察、拍照,計(jì)算遷移細(xì)胞數(shù)目.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠,加入到Transwell小室的上室.然后取100 μL細(xì)胞懸液加入至鋪有Matrigel膠的上室,剩余操作與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同.

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-519d-3p和EIF4E mRNA：Trizol試劑提取各組處理后細(xì)胞中總RNA.紫外分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度,選取A260 nm/A280 nm值在1.8-2.0的范圍內(nèi)的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存.然后以cDNA為模板行PCR擴(kuò)增.PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共45個(gè)循環(huán).miR-519d-3p以U6為內(nèi)參,EIF4E以GAPDH為內(nèi)參,采用2－△△Ct法計(jì)算miR-519d-3p和EIF4E mRNA的相對表達(dá)水平.

1.2.5 Western blot蛋白表達(dá)：RIPA裂解液,提取各組細(xì)胞中總蛋白,于冰上充分裂解30 min,4 ℃、12000g離心10 min,收集上清液,BCA法測定蛋白含量.取適量的蛋白,加入上樣緩沖液,煮沸5 min使蛋白變性.取15 μg變性蛋白上樣進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,使用5%脫脂牛奶室溫條件封閉,封閉時(shí)間2 h.加入一抗,4 ℃孵育過夜.TBST洗膜3次,每次5 min.然后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h.TBST洗膜3次,每次5 min.加入ECL顯影液避光條件下進(jìn)行顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示,EIF4E的3’UTR中存在與miR-519d-3p互補(bǔ)的核苷酸序列.將對數(shù)生長的HepG2細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞融合至60%時(shí),使用LipofectamineTM2000將pmiRGLO-WT-EIF4E、pmiRGLO-MUT-EIF4E質(zhì)粒分別與miR-519d-3p mimics和其陰性對照共轉(zhuǎn)染至HepG2、MHCC97細(xì)胞.轉(zhuǎn)染后6 h,更換新鮮的培養(yǎng)基.繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,收集各組細(xì)胞,參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作,對各組細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行測定.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS.22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).計(jì)量資料以(Mean±SD)表示,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析.以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 OPD對HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較,OPD組HepG2、MHCC97細(xì)胞的抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),遷移和侵襲數(shù)、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05),且不同濃度OPD組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).表明OPD可劑量依賴性抑制HepG2、MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(圖1、表1和表2).

2.2 OPD對HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97中miR-519d-3p和EIF4E表達(dá)的影響 與對照組比,OPD組HepG2、MHCC97細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)顯著升高(P＜0.05),EIF4E mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05),且不同濃度OPD組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),表明OPD可劑量依賴性促進(jìn)HepG2、MHCC97細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá),抑制EIF4E表達(dá)(圖2和表3).

2.3 miR-519d-3p靶向調(diào)控EIF4E的表達(dá) TargetScan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測顯示,EIF4E的3’UTR中含有與miR-519d-3p互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3A).,與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-EIF4E的miR-NC組比較,miR-519d-3p 組HepG2、MHCC97細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05),而與共轉(zhuǎn)染MUT-EIF4E的miR-NC組比較,miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表4),說明miR-519d-3p可與EIF4E的3’UTR序列上的結(jié)合位點(diǎn)靶向結(jié)合.miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞中EIF4E蛋白表達(dá)顯著低于miRNC(P＜0.05),anti-miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞中EIF4E蛋白表達(dá)顯著高于miR-NC(P＜0.05)(表5).表明miR-519d-3p在HepG2、MHCC97細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控EIF4E表達(dá).

2.4 miR-519d-3p過表達(dá)對HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97增殖、遷移和侵襲的影響 miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)水平顯著高于miRNC組(P＜0.05),表明miR-519d-3p mimics轉(zhuǎn)染成功,細(xì)胞中miR-519d-3p過表達(dá).與miR-NC組比較,miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),遷移和侵襲數(shù),及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05),表明miR-519d-3p過表達(dá)可抑制HepG2、MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲(圖4、表6和表7).

2.5 抑制EIF4E表達(dá)對HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97增殖、遷移和侵襲的影響 si-EIF4E組HepG2、MHCC97細(xì)胞中EIF4E蛋白表達(dá)顯著低于si-NC組(P＜0.05),表明EIF4E小干擾RNA轉(zhuǎn)染成功,細(xì)胞中EIF4E表達(dá)受到抑制.與miR-NC組比較,miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞抑制率、p21蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),遷移和侵襲數(shù),及CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05),表明抑制EIF4E表達(dá)可抑制HepG2、MHCC97細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(圖5、表8和表9).

2.6 抑制miR-519d-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OPD(10 μmol/L)對HCC細(xì)胞HepG2和MHCC97增殖、遷移和侵襲的作用 與OPD+anti-miR-NC組比,OPD+anti-miR-519d-3p組HepG2、MHCC97細(xì)胞抑制率、miR-519d-3p、p21蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.05),遷移和侵襲數(shù),及EIF4E、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.05),表明抑制miR-519d-3p表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)了OPD對HepG2、MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用(圖6、表10和表11).

3 討論

天然產(chǎn)物具有抗腫瘤效果,多數(shù)從植物中提取的天然化合物是抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物[13].OPD是傳統(tǒng)中草藥麥冬的主要活性單體,在心血管、心肌損傷等方面發(fā)揮保護(hù)作用[14,15].研究顯示,OPD通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B和轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1途徑抑制肺癌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)紫杉醇誘導(dǎo)的肺癌死亡[16].OPD可通過抑制p38的磷酸化以及MMP-9的表達(dá)抑制黑素瘤MDA-MB-435細(xì)胞的增殖和侵襲,是黑素瘤治療的候選藥物[17].目前,OPD對HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未知.本研究結(jié)果顯示,OPD可抑制HCCHepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,下調(diào)HepG2細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá),上調(diào)p21蛋白表達(dá),提示OPD在一定程度上發(fā)揮抗HCC的作用,是HCC治療的潛在藥物.

表1 OPD對HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n = 12)

表2 OPD對MHCC97細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響(mean±SD,n = 12)

圖1 OPD對HCCHepG2和MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響.

表3 OPD對HCC細(xì)胞中miR-519d-3p和EIF4E表達(dá)的影響(mean±SD,n = 12)

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(mean±SD,n = 6 )

表5 miR-519d-3p調(diào)控EIF4E蛋白表達(dá)(mean±SD,n = 12 )

圖2 Western blot檢測麥冬皂苷D作用肝癌細(xì)胞后EIF4E蛋白表達(dá).EIF4E：真核細(xì)胞翻譯起始因子4E.

miRNA參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展.miR-519d-3p是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA.有報(bào)道稱,miR-519d-3p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-519d-3p通過直接靶向肌鈣蛋白相關(guān)蛋白表達(dá)顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并阻滯細(xì)胞周期G0/G1期,誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[18].過表達(dá)miR-519d-3p可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,是乳腺癌治療的潛在靶標(biāo)[10].但是,miR-519d-3p對HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響還未知.本研究顯示,過表達(dá)miR-519d-3p可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,提示miR-519d-3p可能是HCC細(xì)胞治療的分子靶點(diǎn).此外,OPD可促進(jìn)HCC細(xì)胞中miR-519d-3p的表達(dá),而抑制miR-519d-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OPD對HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,提示OPD通過上調(diào)細(xì)胞中miR-519d-3p表達(dá)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.

表6 miR-519d-3p過表達(dá)對HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n = 6)

表7 miR-519d-3p過表達(dá)對MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n = 6)

表8 抑制EIF4E表達(dá)對HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n = 6)

表9 抑制EIF4E表達(dá)對MHCC97細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n = 6)

圖3 miR-519d-3p靶向調(diào)控EIF4E的表達(dá).

表10 抑制miR-519d-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OPD對HCCHepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用(mean±SD,n = 12)

表11 抑制miR-519d-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了OPD對HCCMHCC97細(xì)胞增殖、遷移侵襲的作用(mean±SD,n = 12)

圖4 Western blot檢測miR-519d-3p過表達(dá)對HCC細(xì)胞p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響.

圖5 Western blot檢測抑制EIF4E表達(dá)對HCC細(xì)胞p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響.

圖6 Western blot檢測抑制miR-519d-3p表達(dá)對OPD處理的HCC細(xì)胞p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響.

miRNA通常與靶mRNA的3’端UTR區(qū)結(jié)合,抑制mRNA翻譯或裂解mRNA,通過調(diào)控基因的表達(dá)發(fā)揮作用[19,20].本研究首先通過生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn),EIF4E的3’UTR中含有與miR-519d-3p互補(bǔ)的核苷酸序列,提示miR-519d-3p可能調(diào)控EIF4E表達(dá).然后通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)了miR-519d-3p在HCC細(xì)胞中負(fù)調(diào)控EIF4E表達(dá).這也與OPD促進(jìn)HCC細(xì)胞miR-519d-3p表達(dá),而抑制EIF4E表達(dá)的結(jié)果一致.此外,抑制EIF4E表達(dá)可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并下調(diào)細(xì)胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá),上調(diào)p21蛋白表達(dá)進(jìn)一步提示OPD可能通過上調(diào)HCC細(xì)胞中miR-519d-3p進(jìn)而下調(diào)EIF4E表達(dá)抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.

綜上所述,OPD可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞miR-519d-3p表達(dá)進(jìn)而下調(diào)EIF4E表達(dá)有關(guān),是潛在的HCC治療藥物.但本研究還存在不足之處,僅在細(xì)胞層面進(jìn)行了初步探討,接下來將通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證OPD抑制HCC發(fā)生發(fā)展的作用及其他可能的作用機(jī)制.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,缺乏有效的治療藥物.麥冬皂苷D(ophiopogonin D,OPD)是中藥麥冬提取物中重要的單體成分,在乳腺癌、肺癌、黑素瘤等腫瘤中發(fā)揮抗癌作用,但是對HCC的影響還未知.本研究探討OPD對HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機(jī)制,以期為HCC治療藥物的研發(fā)提供新思路.

原文包含封號、地域等大量文化負(fù)載詞，譯文在處理時(shí)補(bǔ)充了公元紀(jì)年、地理方位等文化背景信息，便于讀者更好地理解楚國的發(fā)展史和疆土變遷。增加這些信息對于跨文化交流是有必要的，然而譯文多次用括號加注信息，會打破讀者的閱讀節(jié)奏，不利于讀者消化。可以采用尾注的形式在文末體現(xiàn)出來，這樣既保證了流暢的閱讀體驗(yàn)，又補(bǔ)充了文化內(nèi)涵。

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

本研究的主題是OPD是否抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲及其是否通過調(diào)控miR-519d-3p/真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E,EIF4E)軸表達(dá)發(fā)揮作用,目的是為了探究OPD是否發(fā)揮抗HCC作用及其可能的作用機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究的主要目標(biāo)是探討OPD是否具有抗HCC作用及作用機(jī)制,通過實(shí)驗(yàn)明確了OPD可可能通過調(diào)控miR-519d-3p/EIF4E抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,接下來進(jìn)一步通過動物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證OPD的抗HCC作用,可能為臨床HCC治療藥物的研發(fā)提供新途徑.

實(shí)驗(yàn)方法

(3) CC采用了NTP，同時(shí)CC同步的上層時(shí)鐘為網(wǎng)關(guān)服務(wù)器A與網(wǎng)關(guān)服務(wù)器B；2臺網(wǎng)關(guān)服務(wù)器均采用SNTP同步應(yīng)用服務(wù)器A與應(yīng)用服務(wù)器B(SNTP的精度僅能到秒級)；當(dāng)網(wǎng)關(guān)服務(wù)器A與網(wǎng)關(guān)服務(wù)器B相差超過50 ms，CC將不再同步網(wǎng)關(guān)服務(wù)器，而采納本地時(shí)間,從而導(dǎo)致CC時(shí)間與ATS網(wǎng)關(guān)時(shí)間不一致。

本研究采用四甲基噻唑藍(lán)染色法檢測了細(xì)胞增殖,Transwell檢測了細(xì)胞遷移和侵襲,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了細(xì)胞中miR-519d-3p和EIF4E mRNA表達(dá),Western blot檢測了細(xì)胞周期蛋白D1、p21、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、MMP-9和EIF4E蛋白表達(dá),雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-519d-3p與EIF4E的3’端UTR能否靶向結(jié)合.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本研究達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OPD可抑制HCC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,在一定程度上發(fā)揮抗HCC作用,同時(shí),OPD通過調(diào)控上調(diào)miR-519d-3p表達(dá),進(jìn)而抑制EIF4E表達(dá)來抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn)OPD可抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,且其作用機(jī)制與調(diào)控miR-519d-3p/EIF4E軸表達(dá)有關(guān).OPD可能具有開發(fā)為治療HCC藥物的潛在價(jià)值.

展望前景

本研究不足之處是還未進(jìn)行動物相關(guān)實(shí)驗(yàn),僅在細(xì)胞層面進(jìn)行了探討,接下來將通過動物實(shí)驗(yàn)探討OPD對HCC小鼠腫瘤生長的影響及其他可能的作用機(jī)制.方法是通過二乙基亞硝胺腹腔注射和CCl4灌胃方法構(gòu)建小鼠HCC模型,灌胃OPD,探究OPD對腫瘤生長的影響,以及建立接種miR-519d-3p過表達(dá)等HCC細(xì)胞建立移植瘤裸鼠,探討miR-519d-3p過表達(dá)對移植瘤裸鼠腫瘤生長的影響.