預(yù)血管化組織工程骨體外構(gòu)建策略

王建，葉岑雪，甄平，樊博

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000； 2.聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院骨科中心，蘭州 730050；3.中日友好醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100029)

臨界尺寸骨缺損的修復(fù)仍然是骨科、頜面外科的一個挑戰(zhàn)。臨床常用的臨界尺寸骨缺損修復(fù)方法，如自體或異體骨移植、骨搬移、支架材料植入，都有其特定的適應(yīng)證和局限性[1]。血管化和礦化是骨發(fā)育過程中的偶聯(lián)過程，血管化在骨形成和再生過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。骨組織工程作為骨缺損修復(fù)的新興策略，面臨著血管化不足的挑戰(zhàn)[3]。傳統(tǒng)骨組織工程血管化策略主要通過優(yōu)化支架材料、增加生長因子遞送系統(tǒng)或接種內(nèi)皮細(xì)胞來刺激宿主血管向移植物內(nèi)長入或內(nèi)皮細(xì)胞生成血管[4]。然而，新生血管的長入速度每周通常不超過1 mm[5]，移植物仍需要較長時間血管化。因此，植入缺損的組織工程骨移植物常因缺乏快速的營養(yǎng)和氧供應(yīng)而壞死。為了克服這一問題，有必要在移植物內(nèi)部預(yù)先構(gòu)建一個成熟的微血管網(wǎng)，這些微血管網(wǎng)可以在移植后與宿主血管系統(tǒng)快速吻合實現(xiàn)移植物快速血液供應(yīng)[6]。因此，預(yù)血管化對工程骨組織植入缺損后的成活及與周圍宿主組織的整合、重構(gòu)至關(guān)重要[7]。現(xiàn)就微血管生成機(jī)制和血管細(xì)胞來源以及預(yù)血管化組織工程骨的體外構(gòu)建策略進(jìn)行綜述。

1 微血管生成機(jī)制

了解血管生成機(jī)制可為構(gòu)建預(yù)血管化工程骨選擇合適的細(xì)胞類型提供參考。微血管由微動脈、毛細(xì)血管和微靜脈組成。其中毛細(xì)血管直接參與周圍組織的物質(zhì)運輸，因此對維持組織成活十分重要。毛細(xì)血管的細(xì)胞成分由構(gòu)成血管腔的內(nèi)皮細(xì)胞和起支持作用的周細(xì)胞組成，周細(xì)胞通過細(xì)胞間連接和縫隙連接附著于內(nèi)皮細(xì)胞[8]，起介導(dǎo)旁分泌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和穩(wěn)定血管的作用[9]。毛細(xì)血管外層為基膜，由多種蛋白質(zhì)和蛋白多糖組成[10]。平滑肌細(xì)胞存在于除了毛細(xì)血管外的其他血管周圍[11]。通過血管平滑肌收縮舒張可調(diào)節(jié)器官組織的血流量[12]。

胚胎原始血管網(wǎng)的形成涉及胚胎中胚層血管母細(xì)胞的分化、遷移和融合，這個過程稱為血管發(fā)生[13]。在成年期，血管發(fā)生則通過從骨髓招募內(nèi)皮前體細(xì)胞來組裝新血管[14]。在形成初始血管網(wǎng)之后，可通過血管生成以發(fā)芽的形式擴(kuò)張原有的血管[4]。其中，血管生成是一個動態(tài)過程，依賴于內(nèi)皮細(xì)胞與血管周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的密切相互作用。簡單來說，血管生成信號激活靜態(tài)內(nèi)皮細(xì)胞，使內(nèi)皮細(xì)胞松弛細(xì)胞間連接[13]，分泌降解基膜的基質(zhì)金屬蛋白酶[15]。隨后內(nèi)皮細(xì)胞遷移到周圍基質(zhì)中，并相互連接形成新的微血管網(wǎng)[4]。這些血管網(wǎng)隨后通過壁細(xì)胞(周細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞)的招募以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積而穩(wěn)定、成熟[14]。

2 血管細(xì)胞來源

合適的內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞類型對血管的結(jié)構(gòu)和功能完整非常重要。血管細(xì)胞來源主要包括內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及血管壁細(xì)胞。組織來源的內(nèi)皮細(xì)胞主要包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(endothelial-colony-forming cells,ECFCs)等。其中，HUVECs由于分離簡單、血管生成潛力大，是最常用的內(nèi)皮細(xì)胞來源[12]。然而，HUVECs來源有限，需要預(yù)先從臍帶獲取并保存。EPCs可從臍帶血或外周血中獲取。然而，由于這些細(xì)胞可以來自不同的組織，EPCs具有可變的譜系和表型，因此很難預(yù)測其血管生成潛力[16]。血管壁細(xì)胞包括周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，起支持和穩(wěn)定血管的作用。

從血管等人體組織中獲得的血管細(xì)胞存在來源有限、因個體原因?qū)е碌募?xì)胞活性差異等缺點[17]。因此，將間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)誘導(dǎo)分化為血管細(xì)胞越來越受歡迎[18]。與原代內(nèi)皮細(xì)胞相比，iPSCs來源的內(nèi)皮細(xì)胞具有較小的異質(zhì)性[19]。但是，在iPSCs進(jìn)入臨床治療之前，必須解決倫理和安全性問題。

3 預(yù)血管化組織工程骨體外構(gòu)建策略

研究人員已經(jīng)開發(fā)了幾種體外構(gòu)建預(yù)血管化組織工程骨的策略，主要包括共培養(yǎng)、球體、細(xì)胞膜片以及3D打印。

3.1共培養(yǎng) 細(xì)胞共培養(yǎng)是最常用的預(yù)血管化組織工程骨構(gòu)建策略。內(nèi)皮細(xì)胞或EPCs與支持細(xì)胞共培養(yǎng)于支架可實現(xiàn)支架內(nèi)微血管形成。骨髓MSCs(bone marrow MSCs,BMSCs)、脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)、胚胎干細(xì)胞、iPSCs是支持細(xì)胞(壁細(xì)胞)常用來源。雖然作為組織特異性細(xì)胞來源的成體干細(xì)胞(如BMSCs、ADSCs)與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時對新生血管起周細(xì)胞樣作用，但在共培養(yǎng)體系中額外添加周細(xì)胞被證明在骨缺損修復(fù)中促進(jìn)血管生成[20]。已經(jīng)有多種支架材料被用于支持共培養(yǎng)細(xì)胞生成血管，如由膠原、纖維蛋白、甲基丙烯酸?；髂z制成的水凝膠，由聚乳酸-羥基乙酸共聚物、磷酸鈣制成的多孔支架，由聚己內(nèi)酯制成的靜電紡絲支架，以及脫細(xì)胞骨支架等[3,20-26]。Subbiah等[21]將人BMSCs與HUVECs以4∶1的比例在膠原水凝膠中共培養(yǎng)7 d預(yù)構(gòu)了血管化凝膠骨修復(fù)支架，在顱骨缺損修復(fù)模型中，預(yù)血管化水凝膠組的骨體積、覆蓋面積、血管分布等成骨參數(shù)明顯優(yōu)于自體骨陽性對照組。

支架內(nèi)微血管網(wǎng)的形成受到細(xì)胞來源及比例、培養(yǎng)條件、接種策略等因素的影響。王斯琪等[27]分別將人骨髓、脂肪和臍帶血來源的MSCs與EPCs共培養(yǎng)以形成血管，脂肪來源MSCs在體外和體內(nèi)促EPCs形成血管并維持其穩(wěn)定的能力高于骨髓和臍帶血來源MSCs。不同供體來源的細(xì)胞在功能方面存在顯著差異，供體變異會影響細(xì)胞分化，從而影響實驗結(jié)果的重復(fù)性[19]。同時，同一供體不同部位獲取的細(xì)胞在血管生成方面也存在顯著差異。臍帶血來源的人ECFCs被證明在增殖和血管生成方面優(yōu)于外周血分離的ECFCs[19]。在旋轉(zhuǎn)瓶生物反應(yīng)器系統(tǒng)中，研究人員篩選了最佳的共培養(yǎng)細(xì)胞比例，MSCs與HUVECs以1∶1的比例共培養(yǎng)最有利于血管生成[28]。此外，不同類型培養(yǎng)基的使用直接影響共培養(yǎng)體系的血管生成和成骨的結(jié)果。體外共培養(yǎng)7 d形成的血管網(wǎng)在隨后持續(xù)14 d的血管生成培養(yǎng)基、成骨培養(yǎng)基或混合培養(yǎng)基(血管生成培養(yǎng)基與成骨培養(yǎng)基以1∶1混合)刺激下顯示出不同的結(jié)果[23]。在血管生成刺激下血管網(wǎng)繼續(xù)擴(kuò)展，在混合培養(yǎng)基中可以維持血管網(wǎng)，而成骨培養(yǎng)基則促進(jìn)成骨和礦化但會消除血管網(wǎng)?；旌吓囵B(yǎng)基可以支持多相組織形成，但在體外工程骨組織中實現(xiàn)高效的血管生成和成骨仍須尋找其他策略支持。

在成骨培養(yǎng)基中共培養(yǎng)BMSCs和HUVECs能促進(jìn)骨生成但抑制血管生成[23,29]。這可能是通過兩種不同的機(jī)制實現(xiàn)的。其一，BMSCs可在成骨培養(yǎng)條件下分泌一種血管抑制因子Cxcl9，Cxcl9可拮抗血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，阻止VEGF與HUVECs結(jié)合，從而阻斷共培養(yǎng)體系的血管生成[29]。其二，成骨培養(yǎng)基中的地塞米松可刺激內(nèi)皮細(xì)胞分泌金屬蛋白酶組織抑制劑3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP-3)，TIMP-3與VEGF-A競爭結(jié)合VEGF受體2，從而抑制血管生成[30]。通過雷帕霉素阻斷哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子1信號通路抑制Cxcl9的表達(dá)或經(jīng)缺氧預(yù)處理通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α下調(diào)TIMP-3的表達(dá)，促進(jìn)VEGF受體2的磷酸化，進(jìn)而提高成骨培養(yǎng)條件下共培養(yǎng)體系的成骨分化和血管生成[30]。同樣，在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，相對于長期缺氧，1～2周的短期重復(fù)缺氧(2% O2，8 h)能促進(jìn)共培養(yǎng)體系的血管生成[31]。在培養(yǎng)體系中添加促血管生成成分，如富血小板纖維蛋白、胰島素樣生長因子-1可明顯促進(jìn)VEGF的表達(dá)，并顯著增加血管生成[32-33]。另外，細(xì)胞共培養(yǎng)于動態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中能促進(jìn)血管生成和成骨。然而，靜態(tài)共培養(yǎng)第3天，成骨及血管生成相關(guān)基因的表達(dá)高于動態(tài)共培養(yǎng)第3天，這可能是因為共培養(yǎng)早期細(xì)胞正在適應(yīng)環(huán)境，并釋放旁分泌信號，動態(tài)培養(yǎng)破壞了這種早期生長，因此先靜態(tài)后動態(tài)的培養(yǎng)策略可應(yīng)用于后續(xù)的研究中[34]。在共培養(yǎng)中，細(xì)胞接種順序可影響毛細(xì)血管的形成。與HUVECs共培養(yǎng)對MSCs的成骨分化有抑制作用，而MSCs的延遲接種策略可以減弱這種抑制作用[28]。

3.2球體 球體模擬了自然組織的三維微環(huán)境，被廣泛用于再生醫(yī)學(xué)的血管生成單元[35]。球體可通過不同的技術(shù)方法來制備，包括懸浮培養(yǎng)技術(shù)和非黏附微孔培養(yǎng)技術(shù)[5,36-38]。與單一細(xì)胞培養(yǎng)的球體相比，共培養(yǎng)的球體能更好地模擬天然組織異質(zhì)細(xì)胞間的相互作用。在共培養(yǎng)球體中加入血管形成細(xì)胞可以產(chǎn)生血管化的骨組織[35]。在骨組織工程中，共培養(yǎng)細(xì)胞球體在支架材料內(nèi)部充當(dāng)血管生成的旁分泌刺激因子并直接參與生成微血管網(wǎng)[35]。在不同來源內(nèi)皮細(xì)胞及組織特異性細(xì)胞構(gòu)建球體血管生成的研究中，內(nèi)皮細(xì)胞的主要來源為HUVECs和iPSC，而組織特異性細(xì)胞來源主要為BMSCs和ADSCs。同時，培養(yǎng)的球體通常包裹在水凝膠內(nèi)形成可置入的支架[39]。與細(xì)胞共培養(yǎng)類似，共培養(yǎng)球體的功能同樣受到細(xì)胞來源、比例以及培養(yǎng)條件影響。Heo等[40]發(fā)現(xiàn)與單純BMSCs球體相比，包裹在膠原/纖維蛋白水凝膠中的BMSCs/HUVECs共培養(yǎng)球體顯示出更好的細(xì)胞擴(kuò)散和增殖，能增強(qiáng)成骨分化并促進(jìn)血管網(wǎng)形成。Roux等[41]比較了不同細(xì)胞比例HUVECs/BMSCs球體的血管生成效率，發(fā)現(xiàn)血管網(wǎng)的形成需要BMSCs，并且取決于兩種細(xì)胞類型的比例，含50% BMSCs的球體能形成最廣泛的血管網(wǎng)。同時，Mishra等[36]通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)了1∶1的HUVECs/BMSCs球體，纖維蛋白凝膠包裹的球體在體外預(yù)培養(yǎng)3周后血管顯著增加，裸鼠皮下植入實驗顯示人CD31陽性血管灌注了小鼠的血液。內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞組合的血管網(wǎng)生成高度依賴氧，低氧條件會抑制血管網(wǎng)的自組裝[5]。Nyberg和Grayson[5]研究了ADSCs球體預(yù)血管化所需的最短常氧孵育時間，4 d的常氧孵育期是穩(wěn)定血管形成所需的最短時間。另外，球體制備技術(shù)已實現(xiàn)高通量自動化生產(chǎn)，這為球體作為生物墨水成分進(jìn)行3D生物打印奠定了基礎(chǔ)。Celik等[42]分別使用miR-148b和miR-210轉(zhuǎn)染并誘導(dǎo)ADSCs為成骨細(xì)胞和EPCs球體，并將這些異型球體進(jìn)行了生物打印以模擬骨哈弗斯管結(jié)構(gòu)。

3.3細(xì)胞膜片 細(xì)胞膜片是一種無支架組織。細(xì)胞膜片保存了完整的細(xì)胞連接和細(xì)胞外基質(zhì)，從而在促進(jìn)細(xì)胞間交流的同時可為血管化提供良好的微環(huán)境[43]。通過在溫度響應(yīng)皿內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞可制作出細(xì)胞膜片[44]。溫度響應(yīng)皿中涂覆了溫度響應(yīng)聚合物聚N-異丙基丙烯酰胺[poly(N-isopropylacrylamide，PNIPAM)]。PNIPAM在37 ℃時疏水并允許細(xì)胞黏附。在形成完整的細(xì)胞膜片后，將溫度降低到32 ℃，PNIPAM返回親水狀態(tài)并導(dǎo)致細(xì)胞膜片脫離[44]。在培養(yǎng)皿壁安放錨定裝置能防止細(xì)胞膜片在培養(yǎng)和收獲時收縮[45-46]，而將培養(yǎng)皿放置于軌道平臺上進(jìn)行波浪式運動可促進(jìn)細(xì)胞膜片形成[45]。通常，將內(nèi)皮細(xì)胞接種于成骨細(xì)胞膜片上，或?qū)?nèi)皮細(xì)胞膜片夾于成骨細(xì)胞膜片之間，通過層層堆疊來構(gòu)建預(yù)血管化組織工程骨[18，47]。Pirraco等[48]將一層MSCs膜片覆蓋在接種或未接種HUVECs的MSCs膜片上形成雙層的細(xì)胞膜片復(fù)合結(jié)構(gòu)，接種HUVECs的復(fù)合細(xì)胞膜片植入裸鼠皮下后生成的骨組織較未接種HUVECs組更快、更多。MSCs和胚胎干細(xì)胞等多能干細(xì)胞在血管生成條件下可增殖分化為內(nèi)皮細(xì)胞或壁細(xì)胞，可作為細(xì)胞膜片堆積形成血管化組織的替代細(xì)胞來源。Wang等[18]在成骨分化ADSCs膜片上接種ADSCs來源的EPCs，3個堆疊后形成厚的復(fù)合細(xì)胞膜片，復(fù)合細(xì)胞膜片植入裸鼠皮下形成了致密且血管分布良好的新骨組織，植入顱骨缺損后的重建范圍較單純ADSCs膜片組更大。細(xì)胞膜片可作為生物紙用于3D生物打印，并且當(dāng)生物紙細(xì)胞排列方向與打印線平行時，有利于血管結(jié)構(gòu)的形成[46]。因此，細(xì)胞膜片表面微圖案化可能會促進(jìn)接種的內(nèi)皮細(xì)胞形成血管。另外，相較于未成骨分化的BMSCs膜片，成骨分化的BMSCs膜片接種HUVECs的血管形成能力更強(qiáng)[47]。

3.43D打印 3D打印又稱增材制造，通過在計算機(jī)輔助設(shè)計下逐層沉積材料來構(gòu)建物體。目前，可通過基于生物墨水的3D生物打印(直接打印)或基于犧牲網(wǎng)絡(luò)的犧牲打印(間接打印)來構(gòu)建預(yù)血管化組織工程骨。

3D生物打印使用包含細(xì)胞的生物墨水直接打印血管網(wǎng)，實現(xiàn)細(xì)胞在3D構(gòu)建物中準(zhǔn)確定位，而無需接種細(xì)胞。將HUVECs與BMSCs共培養(yǎng)的纖維蛋白凝膠作為生物打印墨水可實現(xiàn)血管網(wǎng)的直接打印[6]。使用負(fù)載成體干細(xì)胞的骨生物墨水和負(fù)載內(nèi)皮細(xì)胞的血管生物墨水混合生物打印可實現(xiàn)復(fù)雜人工骨組織高空間分辨率打印[49]。在預(yù)先打印的明膠納米羥基磷灰石支架連通大孔內(nèi)滴入負(fù)載HUVECs和人BMSCs的凝膠生物墨水可獲得血管化人工骨[50]。作為血管化單元的細(xì)胞球體或脂肪組織基質(zhì)血管碎片可取代單細(xì)胞用作生物墨水成分[51-52]。將負(fù)載脂肪組織基質(zhì)血管碎片的水凝膠沉積打印于預(yù)打印的聚己內(nèi)酯/羥基磷灰石支架通道內(nèi)，短期低氧培養(yǎng)后構(gòu)建了血管化工程骨組織，短期缺氧調(diào)節(jié)可促進(jìn)支架內(nèi)微血管的形成，并促進(jìn)支架內(nèi)微血管與宿主血管系統(tǒng)整合[52]。另外，生物墨水中的MSCs對血管生成至關(guān)重要，與單純HUVECs相比，打印含1∶1比例的MSCs/HUVECs的生物墨水能阻止膠原生物紙上內(nèi)皮細(xì)胞過分?jǐn)U散，從而保存血管走行圖案[53]。

犧牲打印利用犧牲材料如Pluronic F127、海藻酸鹽，打印微通道網(wǎng)絡(luò)并包埋于含或不含種子細(xì)胞的支架材料中，犧牲材料通過降解、液化或物理取出等方法去除后便留下空心微通道，之后通過在空心微通道內(nèi)接種內(nèi)皮細(xì)胞(和支持細(xì)胞)可實現(xiàn)支架血管化[54-55]。Zheng等[54]采用Pluronic F127 作為打印墨水打印了血管網(wǎng)圖案，并包埋于負(fù)載真皮成纖維細(xì)胞的甲基丙烯酸?；髂z水凝膠中，4 ℃時Pluronic F127液化去除后形成微通道，通過在微通道內(nèi)灌注接種HUVECs實現(xiàn)了預(yù)血管化組織的構(gòu)建。Twohig等[55]通過雙打印系統(tǒng)使用磷酸鈣墨水和藻酸鹽犧牲墨水打印了堆疊的磷酸鈣纖維框架和微通道網(wǎng)絡(luò)，打印結(jié)構(gòu)包埋于負(fù)載MSCs的GelMA水凝膠中，物理取出藻酸鹽犧牲材料后留下了空心微通道，通過在微通道內(nèi)接種共培養(yǎng)MSCs和內(nèi)皮細(xì)胞實現(xiàn)了組織工程骨預(yù)血管化。

4 小 結(jié)

組織工程骨體外預(yù)血管化策略是通過允許自身微血管網(wǎng)與宿主微血管系統(tǒng)快速吻合來提高移植物成活率。組織特異性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)是工程骨支架獲得血管網(wǎng)、增加血管密度以及與宿主血管快速吻合的關(guān)鍵。此外，植入前的體外預(yù)培養(yǎng)可以為血管網(wǎng)的形成提供時間，短期重復(fù)低氧處理可促進(jìn)支架內(nèi)微血管的形成。然而，根據(jù)骨缺損類型、大小及部位選擇最佳的預(yù)血管化策略仍須進(jìn)一步研究。除了工程技術(shù)，不同策略的最佳共培養(yǎng)細(xì)胞來源和比例、培養(yǎng)基成分、低氧調(diào)節(jié)時機(jī)和時間均是后續(xù)研究的重點。此外，這些策略需要在大動物模型和大體積移植物上驗證之后才可應(yīng)用于臨床。

總之，體外構(gòu)建預(yù)血管化組織工程骨為臨界尺寸的骨缺損的修復(fù)帶來了新的思路。雖然尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用，但這些策略解決了傳統(tǒng)骨組織工程血管化不足的問題。