從Wnt 通路抑制因子表觀遺傳修飾調(diào)控 研究重樓皂苷Ⅶ抗結(jié)直腸癌機制

陳鳴旺 高舒影 劉海光 唐清珠 羅宏標(biāo)

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。年新發(fā)病例37.63 萬人，年死亡率19.10 萬人。據(jù)統(tǒng)計CRC 在美國的患病率和致死率均排名第三位，盡管在手術(shù)技術(shù)和新輔助化療方面取得了相當(dāng)大的進步，但CRC 的生存率仍未明顯提高［1-3］。結(jié)直腸癌是一個多步驟過程，涉及遺傳和表觀遺傳改變的逐步積累，癌癥發(fā)展的分子機制仍不清楚，因此目前治療選擇有限，塞來昔布等非甾體抗炎藥對大腸腺瘤有一定的預(yù)防作用，而5-氟尿嘧啶等抗代謝物對CRC 患者有治療作用，但非甾體抗炎藥會發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險，抗代謝物的持續(xù)使用對人體會有一定的毒性，包括骨髓毒性和胃腸道毒性，限制其長期使用［4-5］。因此，需要尋找具有更強特異性和更低毒性的新型治療性藥物。天然產(chǎn)物已被證明是抗癌藥物的優(yōu)良和可靠來源［6］，重樓皂苷VII（polyphyllin，PPLVII）是從植物重樓中提取的甾體皂苷類，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗腫瘤等生物活性［7］，已成功應(yīng)用于預(yù)防結(jié)直腸瘤變的IIA 期臨床試驗。重樓是一種百合科植物，重樓根莖中含有多種生物活性成分，如甾體皂苷，從植物中提取的多種皂苷可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［8］， 例如人參皂苷能有效抑制小鼠結(jié)腸癌細胞的轉(zhuǎn) 移［9］。因此，PPLVII 對癌細胞的作用機制值得研究。研究發(fā)現(xiàn)miR-590-3p 在結(jié)腸癌組織和細胞系中表達上調(diào)，miR-590-3p 在體外實驗中可以顯著促進結(jié)腸癌細胞的生長和增殖，研究發(fā)現(xiàn)［10］Wnt 抑制因子1（WIF1）和Dickkopf 相關(guān)蛋白1（DKK1）是miR-590-3p 的直接靶標(biāo)。Wnt 通路抑制因子1可以誘導(dǎo)G1 期細胞周期阻滯，可以caspase-3 依賴性的方式觸發(fā)細胞凋亡，抑制結(jié)直腸癌細胞株SW-620 的生長。在本研究中，我們從重樓中提取了一種甾體皂苷即PPLVII，通過小鼠結(jié)腸直腸癌模型從Wnt 通路抑制因子1（WIF1）表觀遺傳修飾調(diào)控研究其對結(jié)直腸癌細胞影響的機制。

資料與方法

一、實驗動物

從Slaccas 實驗動物公司（中國上海）獲得 30 只5 周齡ICR 雌性小鼠。本實驗根據(jù)動物保護和使用委員會的標(biāo)準在無病原體條件下飼養(yǎng)，所有的實驗動物程序都符合動物護理和使用委員會的審查和批準。

二、建立結(jié)直腸癌小鼠模型和分組

選擇30 只小鼠，將小鼠平均分為3 組：對照組、模型組和PPLVII 治療組。對照組小鼠不作處理。模型組、PPLVII 組小鼠采用腹腔注射1，2-二甲基肼（15 mg/kg），一周后在無菌非酸化飲用水中給予小鼠2%的右旋糖酐硫酸鈉進行小鼠結(jié)直腸癌模型的建立。從第9 周至實驗結(jié)束（第20 周），模型組、PPLVII 組小鼠分別腹腔注射生理鹽水和PPLVII。每天對小鼠進行外觀、食物攝取、體重、糞便濃度、直腸出血的評估，所有小鼠均于第 20 周因過量服用乙醚而死亡。大腸用PBS 沖洗并切除，測量其長度（從回盲交界處到肛門邊緣），取腫瘤組織置于10%中性緩沖福爾馬林固定至少24 小時進行組織病理學(xué)檢查。結(jié)腸黏膜用玻璃片小心地刮掉，快速置于液氮中儲存，直到處理完畢。

三、觀測指標(biāo)及方法

1.采用硅膠柱色譜、SephadexLH-20 凝膠柱色譜和高效液相色譜等分離方法，從重樓根莖醇提物的正丁醇萃取部位分離得到PPLVII。

2. TUNEL 免疫組織化學(xué)分析：采用TUNEL法檢測小鼠的腫瘤細胞凋亡情況，冷凍切片用4%多聚甲醛固定，用末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶緩沖液孵育，染色切片在尼康顯微鏡下觀察。

3. 免疫蛋白印跡分析檢測β-連環(huán)蛋白的表達：分別取腫瘤組織和結(jié)腸黏膜組織在裂解緩沖液（pH=7.9）中重新懸浮或勻漿10 mM Hepes， 10 mM KCl，0.1 mM EDTA，1 mm DTT，加上蛋白酶抑制劑亮肽素10 mg/mL，抑肽酶10 mg/mL， 0.1 mmol/L PMSF。15% SDS 聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜，用含有TBS 的緩沖液阻斷，0.05%吐溫-20 和5%脫脂牛奶室溫下封閉2 小時。然后在48 ℃的溫度下用不同的一抗孵育過夜，然后用hrp 偶聯(lián)的二抗孵育過夜。在含有0.05%吐溫-20 的TBS 緩沖液中三次洗滌10 分鐘后，使用TMA-6 試劑盒檢測，實驗獨立重復(fù)三次。

4. 應(yīng)用雙抗體夾心法ELISA（sandwich ELISA） 檢測cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2 以及Cdk-4、Cdk-6、Cyclin D1 和p21 的表達：①標(biāo)準品的稀釋與加樣：稀釋后各孔加樣量都為50 μL（濃度分別為24 μg/L， 16 μg/L，8 μg/L，4 μg/L，2 μg/L）。②加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。③溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 分鐘。④配液：將30（48T的20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T 的20 倍）倍稀釋后備用。⑤洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。⑥加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。⑦溫育：操作同③。⑧洗滌：操作同⑤。⑨顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL， 再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘。⑩終止和測定：每孔加終止液50 μL， 終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白孔凋零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后15 分鐘以內(nèi)進行。

5. 流式細胞儀檢測相關(guān)蛋白變化：細胞凋亡檢測采用annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，用冰PBS 洗滌，再懸浮在1 個結(jié)合緩沖液中（10 mM Hepes/NaOH，pH=7.4），140 mM NaCl，2.5 mM CaCl2，在100 mL 細胞懸液中加入V-FITC 溶液 （25 mg/mL）和5 mL 溶解PI（250 mg/mL）。將細胞輕輕渦旋，室溫下置于暗處孵育15 min，加入400 mL 4 ℃結(jié)合緩沖液，輕輕攪拌。為了確定細胞周期的分布，收集細胞，用冰水PBS 洗滌，在20 ℃的75%乙醇中固定過夜，1% RNase A 處理20 min 37 ℃，用50 mg/mL PI 染色，流式細胞儀檢測熒光強度。

6. TOP/FOP 檢測：TOPglow / FOPglow TCF 試 劑盒用于檢測Wnt 信號傳導(dǎo)途徑活性，將細胞接種在6 孔板中，并根據(jù)手冊用TOPglow 和FOPglow 轉(zhuǎn)染，所有轉(zhuǎn)染一式三份進行并重復(fù)至少3 次。

7. 實時熒光定量PCR 檢測OCT4、SOX2、c-Myc 和TCF4 相關(guān)基因的表達：用TRIzol 提取總RNA，將RNA 在50 mL 無RNase 的水中洗脫并儲存在-70 ℃，為了分析基因表達，根據(jù)標(biāo)準方法對含有cDNA 模板，引物和SYBRGreen qPCR Master Mix 的qRT-PCR 混合物系統(tǒng)進行qRT-PCR，使用2-△△Ct方法計算基因表達的倍數(shù)變化。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS20.0 統(tǒng)計分析軟件（美國IBM 公司）進行處理；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P ＜0.05 代表差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TUNEL 免疫組織化學(xué)分析

與模型組相比，PPLVII 明顯誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。見圖1。

圖1 TUNEL 染色確定細胞凋亡水平（×100）。1A：對照組，1B：重樓皂苷VII 治療組

二、PPLVII 影響細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達

研究cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2 在PPLVII 干預(yù)后CRC 細胞中表達的情況，表1 數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，PPLVII 治療后，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 和Bax 表達增加（P 均＜0.05）；Bcl-2在PPLVII 處理后表達降低（P=0.010）。

三、PPLVII 影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達

為了研究細胞周期變化，評估了Cdk-4、 Cdk-6、Cyclin D1 和p21 的表達，結(jié)果如表2 所示。PPLVII 處理后，Cyclin D1、Cdk-4、Cdk-6 表達下降（P 均＜0.05）；而p21 表達上調(diào)（P=0.001）。

表1 PPLVII 影響細胞凋亡相關(guān)蛋白的相對表達量（雙抗體夾心法ELISA）（，ng/mL）

表1 PPLVII 影響細胞凋亡相關(guān)蛋白的相對表達量（雙抗體夾心法ELISA）（，ng/mL）

組別 例數(shù) cleaved-caspase-3 cleaved-caspase-8 cleaved-caspase-9 Bax Bcl-2對照組 10 0.75±0.02 0.53±0.04 0.39±0.01 0.26±0.02 0.29±0.04模型組 10 0.19±0.03 0.11±0.03 0.12±0.02 0.15±0.02 0.81±0.02治療組 10 0.61±0.02 0.48±0.03 0.32±0.01 0.25±0.03 0.38±0.03 F 值 22.962 19.281 16.035 16.859 15.364 P 值 0.001 0.001 0.005 0.007 0.010

四、TOP/FOP 測定Wnt 信號通路活性

在PPLVII 干預(yù)治療后，檢測對照組細胞中TOP/FOP 比率為1.86±0.22，模型組為3.48±0.36，治療組為2.17±0.23，三組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=96.072，P ＜0.001）。

五、β-連環(huán)蛋白灰度值檢測結(jié)果

通過提取細胞中的β-連環(huán)蛋白，用免疫蛋白印跡進行檢測，根據(jù)圖2 的結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，模型組的檢測結(jié)果升高（β-連環(huán)蛋白灰度值為2.13±0.03），在PPLVII 進行干預(yù)治療后β-連環(huán)蛋白灰度值下降為1.29±0.02（t=6.331；P=0.020）。

六、PCR 相關(guān)基因表達檢測結(jié)果

在對各組檢測中發(fā)現(xiàn)干細胞相關(guān)基因，OCT4，SOX2 和TCF4 相對于對照組，其在模型組細胞中表達上調(diào)，在PPLVII 進行干預(yù)治療后OCT4、 SOX2、c-Myc 和TCF4 相關(guān)基因的表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.02）。見表3。

討 論

既往研究表明，皂苷對結(jié)直腸癌細胞具有顯著的細胞毒性［11］。本次研究結(jié)果顯示，從重樓中分離得到的皂苷類化合物PPLVII，通過降低Wnt 通路抑制因子的表達對CRC細胞具有生長抑制作用?？紤]由于PPLVII 對DMH/DSS 誘導(dǎo)的CRC 模型小鼠腸道毒性和癌變有潛在的保護作用，PPLVII 細胞存活率下降部分是因誘導(dǎo)細胞凋亡所致，cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9 和Bax 蛋白水平上調(diào)，說明PPLVII 誘導(dǎo)的細胞凋亡與內(nèi)源性凋亡通路密切相關(guān)。本次研究還發(fā)現(xiàn)，Bcl-2 水平在PPLVII 作用下降低，表明Bcl-2 作為Bcl-2 家族主要的抗凋亡蛋白，參與了誘導(dǎo)凋亡［12］。 因為從一個細胞周期向另一個細胞周期的轉(zhuǎn)變是有序進行的，并通過細胞周期蛋白進行調(diào)控，不同的細胞周期蛋白在細胞周期的不同階段達到其最大活性，細胞周期蛋白D1 在結(jié)直腸癌細胞過度表達，它與CDK4 和CDK6 結(jié)合形成CDK4/6-cyclin D1復(fù)合物是細胞進入G1 期所必需的。由于PPLVII在下調(diào)細胞周期蛋白D1、CDK4、CDK6 表達的同時，上調(diào)細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21 的表達，阻止受損DNA 復(fù)制，在CDK 抑制和G1 期阻滯中發(fā)揮重要作用。因此，PPLVII 誘導(dǎo)CRC 細胞G1 期阻滯是通過上調(diào)p21 表達引起的。這與Ghasemi 等［13］研究結(jié)果基本一致。

Wnt 通路在結(jié)腸腫瘤發(fā)生中起著重要作用，在60%～70%的結(jié)腸癌病例中，Wnt 信號被激活，Li 等［14］人研究表明PPLVII 不僅降低了異種移植瘤小鼠模型的腫瘤大小，而且抑制DMH/DSS 誘導(dǎo)的CRC 小鼠模型的腫瘤發(fā)生。Wnt 通路抑制因子是miR-590-3p 的潛在靶標(biāo)， miR-590-3p 直接抑制WIF1 和DKK1 mRNA 轉(zhuǎn)化為成熟蛋白，癌癥特異性miRNA 對于理解腫瘤發(fā)生中的作用和探索新的治療靶點有重要的意義。本次研究發(fā)現(xiàn)，PPLVII干預(yù)治療通過降低Wnt 通路抑制因子的表達對結(jié)直腸癌有一定的改善和治療作用。Wnt 通路抑制因子下調(diào)降低細胞球體形成，WIF1 和DKK1 在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞腫瘤發(fā)生中起重要作用［15］。WIF1 是一種脂質(zhì)結(jié)合蛋白，可與Wnt 蛋白結(jié)合并阻止它們觸發(fā)Wnt/β-連環(huán)蛋白途徑，目前WIF1 基因在人結(jié)腸癌的外周血中被證實是失調(diào)的，并且可以做為有希望的標(biāo)志物。筆者推測，WIF1 可能參與結(jié)腸癌細胞增殖和腫瘤發(fā)生，DKK1 通過與LRP 和Kremen蛋白結(jié)合阻止β-連環(huán)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進細胞分化和凋亡［16］。DKK1 在結(jié)腸癌中下調(diào)，多個分子通過下調(diào)DKK123-32 促進結(jié)直腸腫瘤發(fā)生，已經(jīng)證明Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)參與結(jié)腸癌的發(fā)展和促進。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)可被幾種與Wnt 配體或降解復(fù)合物結(jié)合的因子抑制，WIF1、卷曲蛋白相關(guān)蛋白和DKK130。WIF1 和DKK1 在結(jié)腸癌組織和細胞中受miR-590-3p 的負調(diào)控，導(dǎo)致Wnt 信號傳導(dǎo)的異常激活［17-18］。

表2 PPLVII 影響細胞周期相關(guān)蛋白的相對表達量（雙抗體夾心法ELISA）（，ng/mL）

表2 PPLVII 影響細胞周期相關(guān)蛋白的相對表達量（雙抗體夾心法ELISA）（，ng/mL）

組別 例數(shù) Cdk-4 Cdk-6 Cyclin D1 p21對照組 10 0.31±0.04 0.19±0.01 0.15±0.03 0.47±0.02模型組 10 0.79±0.04 0.76±0.05 0.66±0.03 0.12±0.01治療組 10 0.39±0.03 0.24±0.03 0.19±0.01 0.41±0.03 F 值 19.205 15.331 20.749 15.668 P 值 0.001 0.005 0.001 0.003

圖2 蛋白印跡檢測β-連環(huán)蛋白水平（WB）

表3 PCR 相關(guān)基因表達檢測結(jié)果（）

表3 PCR 相關(guān)基因表達檢測結(jié)果（）

組別 例數(shù) OCT4 SOX2 c-Myc TCF4對照組 10 1.00±0.05 1.00±0.05 1.00±0.05 1.00±0.05模型組 10 2.82±0.08 2.21±0.08 3.12±0.22 3.96±0.65治療組 10 1.34±0.02 1.36±0.02 1.15±0.01 1.11±0.01 F 值 13.762 16.375 20.236 15.766 P 值 0.010 0.016 0.014 0.011

本研究進一步證明，PPLVII 在小鼠模型中通過對WIF1 表達的影響能有效預(yù)防結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的發(fā)生。筆者分析認為，WIF1 表達降低促進干細胞相關(guān)標(biāo)志物的表達，例如OCT4、SOX2 和TCF4。 WIF1 和DKK1 參與Wnt /β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)。WIF1 被抑制可以促進β-catenin 核轉(zhuǎn)位，提高TOP / FOP 比率，降低β-catenin 等與MMP-9 啟動子的結(jié)合，表明WIF1 在調(diào)節(jié)Wnt /β-catenin 信號通路中起重要作用，可以導(dǎo)致多個下游基因通過Wnt /β-連環(huán)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活；WIF1 表達降低還可以增強Cyclin D1、RUNX2 和DMP1 蛋白的表達，促進結(jié)直腸癌細胞的凋亡。