自體脂肪干細(xì)胞移植治療復(fù)雜性肛瘺的 臨床觀察

江濱 時(shí)宏珍 史央 張?zhí)K閩 王業(yè)皇 倪敏 周春根 李猛 章陽(yáng) 徐大超

復(fù)雜性肛瘺是結(jié)直腸肛門(mén)外科的難治性疾病，手術(shù)是目前主要的治療方法。但傳統(tǒng)手術(shù)需切開(kāi)正常組織，引流創(chuàng)面大、疼痛劇烈、愈合慢，不同程度損傷肛門(mén)括約?。?-2］；因此，肛瘺手術(shù)趨向微創(chuàng)化［3］。其中干細(xì)胞移植是目前研究熱點(diǎn)，國(guó)外研究已取得良好療效，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。本中心自2018 年1 月起，對(duì)23 例復(fù)雜性肛瘺患者進(jìn)行自體脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）移植治療，結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018 年1 月至2018 年10 月南京市中醫(yī)院肛腸中心收治的復(fù)雜性肛瘺患者23 例，進(jìn)行ADSCs治療，年齡12～51歲，平均（28.86±10.13）歲， 男22 例，女1 例。本研究由南京市中醫(yī)院倫理審查委員會(huì)審查批準(zhǔn)（倫理審查編號(hào)：KY2018011）， 在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心注冊(cè)（注冊(cè)號(hào)：ChiCTR1800014599）。

（一）納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡≥12 歲；②診斷符合美國(guó)結(jié)直腸外科學(xué)會(huì)2016 年肛瘺治療指南標(biāo)準(zhǔn)的非急性感染期復(fù)雜性肛瘺患者，包括腺源性肛瘺（cryptoglandular anal fistulas，CPAF）及克羅恩病肛瘺（Crohn′s disease anal fistulas，CDAF）；③CDAF 患者需在治療前控制克羅恩病處于緩解期或輕度活動(dòng)期，即克羅恩病活動(dòng)指數(shù)（Crohn′s disease activity index, CDAI）≤220 分；④入組前1 年內(nèi)腸鏡檢查無(wú)癌癥或癌前病變證據(jù)；⑤無(wú)其他心腦血管基礎(chǔ)疾病；⑥患者及患者家屬均簽署知情同意書(shū)。

（二）排除標(biāo)準(zhǔn)

①肛瘺急性感染期（未成熟的瘺管）；②CDAF 患者的CDAI ＞220 分；③繼發(fā)于結(jié)核、放療、惡性腫瘤等其他非克羅恩疾病的肛瘺；④對(duì)麻醉劑過(guò)敏；⑤不能耐受抽脂手術(shù)者；⑥懷孕或擬近期懷孕者；⑦研究者認(rèn)為不適合納入研究。

二、治療步驟

（一）瘺管準(zhǔn)備

受試者完善腸鏡、彩色三維腔內(nèi)B 超、MRI等檢查后，在ADSCs 注射前≥2 周接受瘺管準(zhǔn)備，包括瘺管探查、刮除、掛線引流。見(jiàn)圖1～3。

（二）提取、分離、制備ADSCs

瘺管準(zhǔn)備的同時(shí)，進(jìn)行自體脂肪干細(xì)胞的制備，本研究中所采用的ADSCs 均由江蘇德康生物科技有限公司制備。其具體步驟如下：首先將在受試者的腹部或大腿部抽取的脂肪（圖4～5）用無(wú)菌生理鹽水沖洗，然后加入相應(yīng)濃度Ⅰ型膠原酶，37 ℃水浴振蕩消化60 分鐘，離心，吸棄上層脂肪和液體層，加入生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞濾器過(guò)濾，去除未消化完全組織，濾液離心，棄上清，獲得基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）。臺(tái)盼藍(lán)染色行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞數(shù)量和活性，再將SVF 接種至培養(yǎng)瓶中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基和血清替代物，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃。細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)加入胰蛋白酶消化，收集消化的細(xì)胞懸液，接種至培養(yǎng)瓶中，傳代培養(yǎng)。收集第 3 或4 代的ADSCs，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)、活力、細(xì)胞表型、內(nèi)毒素、細(xì)菌、真菌和支原體等指標(biāo)。完成鑒定后， -80 ℃凍存，注射當(dāng)天進(jìn)行解凍復(fù)蘇，15～25 ℃條件下運(yùn)送至手術(shù)室準(zhǔn)備注射。

（三）注射ADSCs

首先用探針仔細(xì)探查瘺管及其內(nèi)、外口，避免遺漏分支和膿腔。探查清楚后，用金屬刷及電凝（美國(guó)庫(kù)克，國(guó)械注進(jìn)20153462399），由內(nèi)至外損毀瘺管內(nèi)上皮化組織，蒸餾水沖洗清除瘺管壁壞死組織。清潔干凈后，用2-0vicryl 縫閉內(nèi)口。用注射器將含有5×106cells/mL 的ADSCs 混懸液均勻注入到內(nèi)口和瘺管壁周?chē)谒邢笙拗羞M(jìn)行多次（≥ 4 次）注射。最后在瘺管中灌注含有1×106cells/mL 的血清混懸液，縫閉外口。見(jiàn)圖6～7。

注射ADSCs 劑量基于術(shù)前測(cè)量的瘺道直徑和長(zhǎng)度，主要依據(jù)術(shù)前MRI 結(jié)果及瘺管準(zhǔn)備時(shí)臨床評(píng)估。瘺管直徑≤1 cm，瘺管內(nèi)注射1 mL ADSCs/cm；1 cm ≤瘺管直徑≤2 cm 的患者，瘺管內(nèi)注射2 mL ADSCs/cm。

三、主要觀察指標(biāo)

（一）有效性

1. 瘺管愈合率：術(shù)后90 天，研究者對(duì)患者進(jìn)行臨床評(píng)估并進(jìn)行MRI 檢查從而評(píng)估瘺管愈合情況（圖8～12）。瘺管愈合的定義為患者的外口完全上皮化（任何情況下外口都無(wú)流出物）且MRI中無(wú)瘺管證據(jù)。

圖1 術(shù)前MRI 圖2 術(shù)前彩色三維腔內(nèi)B 超 圖3 瘺管準(zhǔn)備 圖4 抽取脂肪 圖5 提取的脂肪 圖6 注射前 圖7 ADSCs 注射 圖8 注射術(shù)后當(dāng)天 圖9 注射后3 天 圖10 注射后10 天 圖11 注射后20 天 圖12 注射后MRI注：患者，男，28 歲，高位復(fù)雜性肛瘺（腺源性），于2018-01-11 行ADSCs 治療

2. 外口閉合時(shí)間：術(shù)后第3、7、15、30、60、 90 天，根據(jù)患者的描述及研究者的臨床評(píng)估來(lái)確定外口閉合時(shí)間。外口閉合的定義為外口完全上皮化，無(wú)論正常情況或是手指按壓均無(wú)流出物。

3. 肛門(mén)失禁評(píng)分：術(shù)前及術(shù)后90 天，采用Wexner 評(píng)分量表評(píng)估術(shù)前、術(shù)后肛門(mén)失禁情況的變化，0 分表示正常，20 分表示完全失禁，分值越低，肛門(mén)功能越好。

4. 疼痛評(píng)分：術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、15、30、60、90 天，采用VAS 評(píng)分量表評(píng)估疼痛情況，0 分表示無(wú)痛，3 分以下表示輕度疼痛，4～6 分表示疼痛影響睡眠但尚可忍受，7～10 分表示疼痛難忍，影響食欲、睡眠，數(shù)字越大表示疼痛越明顯。

5. 生活質(zhì)量評(píng)分：術(shù)前及術(shù)后第1、3、7、15、30、60、90 天，采用SF-36 評(píng)分量表評(píng)估生活質(zhì)量，包括生理機(jī)能、生理職能、軀體疼痛、一般狀況、精力、社會(huì)功能、情感職能、精神健康及健康變化等內(nèi)容，得分越高提示生活質(zhì)量越高。

6. 克羅恩病肛瘺患者的肛周病變活動(dòng)指數(shù)（Perianal Disease Activity Index，PDAI）：術(shù)前和術(shù)后90 天，采用PDAI 評(píng)分評(píng)估，包括分泌物、疼痛與活動(dòng)、性生活、肛周病變、硬結(jié)，得分越高表示疾病活動(dòng)越活躍。

（二）安全性

通過(guò)確定不良事件和嚴(yán)重不良事件的發(fā)生率來(lái)評(píng)估安全性。每次隨訪時(shí)監(jiān)測(cè)患者的不良事件，注意肛門(mén)周?chē)鷧^(qū)域的評(píng)估，以篩選異常組織形成、持續(xù)或增加的炎癥跡象，以及任何其他可能提示ADSCs 出現(xiàn)影響的觀察結(jié)果。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 22.0 軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，分析采用t 檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)（構(gòu)成比）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher 精確檢驗(yàn)。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

本研究的實(shí)施流程如圖13 所示。

結(jié) 果

一、基線資料

23 名患者的一般資料見(jiàn)表1。

二、有效性

（一）瘺管愈合率

圖13 試驗(yàn)流程圖

截止2019 年2 月1 日，中位隨訪6 個(gè)月（3～ 12 個(gè)月），總瘺管愈合率為69.57%（16/23）；其中CDAF 90.91%（10/11），CPAF 50%（6/12），見(jiàn)表2。

（二）外口閉合時(shí)間

瘺管完全愈合患者的外口平均閉合時(shí)間（17.06±4.54）天，其中CDAF（17.90±4.53）天，CPAF（15.67±4.59）天，二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.950，P=0.358），見(jiàn)表3。

（三）肛門(mén)失禁評(píng)分

如圖14 所示，所有受試者治療前后的肛門(mén)失禁評(píng)分基本保持不變。有1 位CDAF 患者的肛門(mén)失禁評(píng)分由術(shù)前的5 分變?yōu)樾g(shù)后2 分，考慮是由于患者的主觀誤差所致。

（四） 疼痛評(píng)分

如圖15 所示，總體上患者的疼痛情況在術(shù)后3 天即得到較大程度的緩解，并持續(xù)好轉(zhuǎn)。研究中有4 位患者在治療后第一天疼痛評(píng)分上升，但短時(shí)間內(nèi)（1～3 天）即恢復(fù)至術(shù)前水平；其余患者無(wú)變化或下降。

（五）生活質(zhì)量評(píng)分

如圖15 所示，患者的生活質(zhì)量評(píng)分在術(shù)后第一天降低最為明顯，但在術(shù)后7 天即可恢復(fù)至術(shù)前水平。

（六）克羅恩病肛瘺治療前后PDAI 評(píng)分比較

克羅恩病肛瘺患者治療前的PDAI 評(píng)分為（8.55±1.37）分，而治療后90 天的評(píng)分為（1.27± 1.10）分，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.033，P ＜0.01），見(jiàn)表4。

表1 基線資料

表2 ADSCs 注射后患者瘺管愈合情況

表3 肛瘺愈合患者的外口閉合時(shí)間

三、安全性

本研究中沒(méi)有因不良事件而導(dǎo)致的研究終止；7 名受試者報(bào)告了14 例不良事件；3 名注射后第 1 天出現(xiàn)低熱，最高體溫＜38 ℃，考慮與手術(shù)應(yīng)激有關(guān)，未處理，自然消退；7 名出現(xiàn)輕度疼痛，考慮與瘺管處理有關(guān)，未處理，3～7 天消退；4 名出現(xiàn)疲勞、乏力，與麻醉相關(guān)，術(shù)后1～2 天緩解。無(wú)直接歸因于ADSCs 注射的不良事件，無(wú)嚴(yán)重不良事件。見(jiàn)表5。

討 論

肛瘺手術(shù)治療原則是最大限度保護(hù)肛門(mén)功能的前提下治愈肛瘺，降低復(fù)發(fā)率［4］。傳統(tǒng)手術(shù)不可避免損傷肛門(mén)括約肌，導(dǎo)致不同程度肛門(mén)失禁，多次手術(shù)的患者，肛門(mén)失禁風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加并引起更多并發(fā)癥［5］。

圖14 肛門(mén)失禁評(píng)分

圖15 生活質(zhì)量、疼痛評(píng)分

表4 克羅恩病肛瘺治療前后PDAI 評(píng)分比較

表5 不良事件

為保護(hù)患者肛門(mén)功能，新技術(shù)、新材料逐漸應(yīng)用于肛瘺治療。文獻(xiàn)報(bào)道，肛瘺栓治療低位肛瘺的早期成功率70%～100%，但后期愈合率低于 50%［6-9］；纖維蛋白膠成功率14%～63%［10-11］。直腸推移瓣術(shù)治愈率66%～87%，復(fù)發(fā)率高［12-14］，35%術(shù)后出現(xiàn)輕到中度失禁，直腸肛管壓力測(cè)定顯示靜息壓和收縮壓下降［15］。Kontovounisios 等［16］報(bào)道759 例括約肌間瘺管結(jié)扎術(shù)（LIFT）回顧性分析發(fā)現(xiàn)，成功率51%～94%，不適合復(fù)雜性肛瘺的治療。因此，上述方法仍存在治愈率低、愈合時(shí)間長(zhǎng)或復(fù)發(fā)率高等不足。

ADSCs 是從脂肪組織中分離的具有多向分化潛能的干細(xì)胞［17］。相比其他來(lái)源干細(xì)胞，優(yōu)點(diǎn) 有［18-21］：①脂肪來(lái)源充足；②患者痛苦小，供區(qū)損傷低；③干細(xì)胞分離方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)量高，是骨髓干細(xì)胞的1 000倍；④體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，易傳代培養(yǎng)；⑤有跨胚層分化能力；⑥免疫排斥低。該方法自2003 年Garcia-Olmo 等［22］首次報(bào)道后，一直是研究熱點(diǎn)。2012 年隨機(jī)、雙盲、多中心三期200 例 復(fù)雜性肛瘺臨床研究表明，ADSCs 單獨(dú)或聯(lián)合纖維蛋白膠治療復(fù)雜性肛瘺是安全的，1 年愈合率超過(guò)50%［23］。2016 年一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、平行、安慰劑對(duì)照Ⅲ期臨床試驗(yàn)，納入212 例CDAF，隨訪52 周，表明同種異體ADSCs（Cx601）治療組聯(lián)合緩解率明顯優(yōu)于安慰劑組，復(fù)發(fā)率低；相關(guān)不良事件發(fā)生率低［24］。相關(guān)研究結(jié)果顯示：無(wú)論自體或異體ADSCs 治療肛瘺，均有不切開(kāi)正常組織、創(chuàng)傷小、無(wú)括約肌損傷、疼痛輕、修復(fù)快、復(fù)發(fā)率低、住院時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，安全性與有效性得到了認(rèn)證，是目前括約肌切開(kāi)術(shù)和保留括約肌手術(shù)等方法所不具備的。2017 年美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)ADSCs 作為治療CDAF 的方法之一，2018 年歐洲也批準(zhǔn)了該方法［25］。

本研究瘺管總閉合率69.57%， 其中CDAF90.91%，CPAF50%；與國(guó)外研究相類(lèi)似［26-35］。 ADSCs 治療的可能機(jī)制為：定向誘導(dǎo)分化、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、旁分泌和免疫調(diào)節(jié)以及促血管生成和成纖維細(xì)胞激活［36］；CPAF 成功率低可能和肛腺隱窩處反復(fù)感染以及ADSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)弱有關(guān)［37］。DelaRosa 等［38］認(rèn)為ADSCs 在炎癥介質(zhì)（特別是IFN-γ）存在下，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并抑制T-淋巴細(xì)胞功能和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖；導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子（如IFN-γ 和TNF-α）減少，抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）增加。感染是CPAF 發(fā)病的關(guān)鍵因素［39］， 經(jīng)ADSCs 治療后，肛腺隱窩處的感染可能未能有效控制，仍產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致CPAF 的愈合率偏低；如果局部感染受到良好控制，CPAF 的愈合率可能會(huì)有所提高。Cho 等［32］和Choi 等［33］也提出了類(lèi)似的觀點(diǎn)。由于本研究是首次在中國(guó)人群中使用ADSCs 治療復(fù)雜性肛瘺，出于安全性考慮，ADSCs 的注射濃度為5× 106cells/mL，遠(yuǎn)低于Cao 等［40］的2～4×107cells/mL， 所發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)度可能無(wú)法完全清除肛腺隱窩處感染，是CPAF 愈合率低可能的原因之一。此外，治療中的清創(chuàng)流程及術(shù)后的基礎(chǔ)治療仍然有待細(xì)化和研究。

本研究顯示ADSCs 治療后患者生活質(zhì)量高，肛門(mén)括約肌保護(hù)好，沒(méi)有患者因治療出現(xiàn)肛門(mén)失禁，優(yōu)于傳統(tǒng)術(shù)式。安全性數(shù)據(jù)也表明，ADSCs 耐受良好，無(wú)與ADSCs 相關(guān)特異性不良事件證據(jù)，與國(guó)外研究結(jié)果一致［27-36］。

本研究樣本量小，治療復(fù)雜性CPAF 仍有不足；但對(duì)CDAF 取得了優(yōu)于目前現(xiàn)有治療手段的效果。由于當(dāng)前ADSCs 治療的成本仍然過(guò)高，尚無(wú)法廣泛推廣；且患者須接受兩次手術(shù)。雖有上述局限，但我們的研究表明，該方法安全、不切開(kāi)正常組織、肛門(mén)功能損傷小、耐受性好、可重復(fù)、術(shù)后恢復(fù)快、疼痛輕、患者圍手術(shù)期生活質(zhì)量高，是治療復(fù)雜性肛瘺尤其是CDAF 的有效方法。

肛瘺的外科治療從毀損性切除發(fā)展到修復(fù)再到如今的重建、再生，ADSCs 治療復(fù)雜性肛瘺很好地體現(xiàn)了重建和再生的外科學(xué)發(fā)展理念和趨勢(shì)。該方法作為一種符合肛瘺治療原則的新型治療技術(shù)，對(duì)于復(fù)雜性肛瘺特別是CDAF 的初期臨床療效及安全性令人滿意，也給將來(lái)治療復(fù)雜性腸瘺、直腸陰道瘺等提供了新的思路和方法。