ETS2在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義

汪軍 黃裕 孫強 魏舒迅 祝徐軍 王長明 李新星 徐健

結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，近年來發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，尤其在年齡超過50 歲的中老年人群中，結(jié)直腸癌更是高發(fā)惡性腫瘤，而且多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期［1］。目前，結(jié)直腸癌的治療仍以手術為主，輔以放化療，但有近40%的患者術后3 年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤的復發(fā)或轉(zhuǎn)移［2-3］。因此，尋找預測結(jié)直腸癌患者術后進展的潛在標記物、以及治療靶點儼然成為了重要的臨床科學問題。轉(zhuǎn)錄因子ETS2 全稱 E-twenty-six proto oncogene 2，位于染色體21q22.2，其蛋白含有469 個氨基酸，在分類上屬于ETS 轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，其最早發(fā)現(xiàn)是在鳥骨髓成紅細胞增多癥中，致病病毒E26表達融合蛋白基因v-ets91，許多ETS 都被證實與癌癥有關。研究表明，ETS2 調(diào)控細胞的增殖和凋亡，導致腫瘤發(fā)生［5］。有學者在人類乳腺癌的樣本中發(fā)現(xiàn)ETS2 高水平表達，并且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關［6］。在前列腺癌中，抑制ETS2 的表達能抑制腫瘤的生長和侵襲［7］。然而，目前對于ETS2 結(jié)直腸癌組織中的臨床意義尚不清楚，因此，本研究收集結(jié)直腸癌新鮮組織和石蠟切片，通過檢測ETS2 mRNA 和蛋白表達情況，探討ETS2在結(jié)直腸癌組織中的表達情況，分析其與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)之間的關系，并評估其臨床預后價值。

資料與方法

一、標本收集

收集2017 年12 月至2018 年12 月期間在寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院接受手術根治的結(jié)直腸癌患者的癌組織、癌旁組織（距離癌組織邊緣2 cm～5 cm）和相應正常組織（距離癌組織邊緣5 cm 以上），液氮冷凍保存。另收集2011 年1 月至2013 年12 月 期間在長征醫(yī)院接受手術根治的結(jié)直腸癌患者癌組織、癌旁組織的石蠟標本。入選條件：所有病例均經(jīng)病理確診屬于Ⅰ～Ⅲ期；均具有完整的臨床資料及病理資料；所有患者術前均未接受放、化療（包括腹腔灌注）。排除條件：合并其他多發(fā)腫瘤疾病史，或合并其他遺傳性疾病；因腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移而行2 次或以上手術；嚴重心血管疾病、或其他無法控制的合并疾病。

依上述標準選取病例，結(jié)直腸癌新鮮組織標本入組32 例，包括配對的癌旁組織、正常組織，其中男性18 例，女性14 例，年齡45～79 歲，平均年齡（58.9±4.5）歲。選取結(jié)直腸癌石蠟切片121 例，其中配對的癌旁組織切片46 例，男性87 例，女性34 例，年齡34～81 歲，平均年齡（60.4±2.8）歲。 對121 例接受根治手術的結(jié)直腸癌患者隨訪時間3～89 個月，末次隨訪時間2018 年6 月30 日，中位隨訪56 個月，完整隨訪89 例，失訪32 例，其中55 例患者出現(xiàn)進展（腫瘤復發(fā)或轉(zhuǎn)移），其中相關性分析納入121 例數(shù)據(jù)分析，生存分析納入有完整隨訪數(shù)據(jù)的89 例病例。

二、實驗方法

實時熒光定量PCR：Trizol RNA 抽提液提取新鮮組織的RNA，將1 μL Oligo dT 和2.0 μg Total RNA 加入到PCR 小管中，混勻后離心，70 ℃溫浴10 min，使Oligo dT 和模板退火，上述體系在PCR儀上完成逆轉(zhuǎn)錄反應，反應條件為37 ℃，15 min； 85 ℃，5 s。熒光實時定量PCR 的反應體系：10 μL反應體系，并加陰性對照；實時熒光定量PCR 的反應條件：95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；40 個 循環(huán)。定量PCR 數(shù)據(jù)分析，分別檢測內(nèi)參β-actin 和目的基因。ΔCt=目的基因Ct 值-β-actinCt 值，根據(jù)每組各個ΔCt 值分別求出每組的均數(shù)。兩組間目的基因表達的變化以ΔΔCt 表示（ΔΔCt=各腫瘤組ΔCt 均數(shù)-對照正常組ΔCt 均數(shù)）。設正常組為1，腫瘤組為2 的-ΔΔCt 次冪作圖。

免疫組化：石蠟標本5 μm 厚連續(xù)切片，切片脫蠟水化：將切片置于60 ℃烤箱中烘烤l 小時；放置100%的二甲苯中脫蠟30 min；再于100%～75%酒精中浸泡各5 min 梯度水化，以0.3%的H2O2孵育10 min，滴加正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min，滴加一抗（鼠抗ETS2 抗體1：100，Abcam 公司），4 ℃冰箱孵育過夜。加生物素標記二抗（DAKO 公司），室溫孵育30 min，加辣根過氧化物標記的三抗，室溫孵育30 min，DAB 顯色。蘇木精復染，脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，PBS 代替一抗作陰性對照。

三、結(jié)果判定

有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師判定免疫組化結(jié)果，ETS2 以胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達, 以細胞染色強度和細胞陽性百分率得分之積判定，選擇 5 個高倍鏡視野計數(shù)細胞判斷：（1）著色強度：無染色記0 分，淺黃色計1 分，棕黃色計2 分，黃褐色計3 分。（2）對陽性細胞所占百分比進行評分 （0～100%）。上述2 項相乘，弱陽性（±）＜50%：中等陽性（2 ＋）：50%～100%，強陽性（3 ＋）：100%～300%。將弱陽性定義為低表達，中等陽性和強陽性為高表達。

四、統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0 軟件進行分析處理。采用Mann-Whitney U-test 分析mRNA 的相對表達量差異，運用χ2檢驗分析ETS2 的表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征之間的關系，生存分析的比較用Kaplan-Meier 生存曲線，多因素分析采用COX 回歸分析法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，所有檢驗和P 值均為雙側(cè)。

結(jié) 果

一、ETS2 的mRNA 在臨床新鮮結(jié)直腸癌組織中的表達

在32 例新鮮結(jié)直腸癌組織中，ETS2 mRNA的相對表達量為（238±15.13），而癌旁組織、正常組織中的相對表達量分別為（4±2.21）和（3±1.39），結(jié)直腸癌組織中ETS2 mRNA 的表達明顯高于癌旁組織和正常組織（P ＜0.001），而癌旁組織和正常組織中的ETS2 mRNA 表達量差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。在病理II～III 期的結(jié)直腸癌組織中，ETS2 mRNA 的相對表達量明顯高于病理Ⅰ期，差異具有統(tǒng)計學意義（243±22.21 vs. 2.00±1.53，P ＜0.001）。見圖1。

二、ETS2 蛋白在結(jié)直腸癌石蠟標本中的表達

免疫組化結(jié)果顯示，ETS2 的表達主要位于胞核，ETS2 在52.07%（63/121）結(jié)直腸癌中表達，而僅在13.04%（6/46）的癌旁組織中表達，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。如圖2 所示，ETS2 蛋白在結(jié)直腸癌組織中高表達，而癌旁組織中的表達量呈現(xiàn)低表達或不表達（P ＜0.001）。

三、ETS2 蛋白與臨床病理參數(shù)之間的關系

圖1 ETS2 mRNA 的表達。1A：結(jié)直腸癌、癌旁和正常配對的新鮮組織。1B：病理分期Ⅰ期和Ⅱ～Ⅲ期結(jié)直腸癌新鮮組織

ETS2 表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否以及錯配修復（MMR）狀態(tài)有關（P ＜0.05），即分化程度越低、病理T 分期越晚、有淋巴轉(zhuǎn)移或MSS 狀態(tài)的結(jié)直腸癌組織中ETS2的表達高，而與年齡、性別、腫瘤直徑和腫瘤位置無關（P ＞0.05），上述結(jié)果提示，ETS2 可能與結(jié)直腸癌惡性程度密切相關，即ETS2 表達越高，惡性程度可能越高。

四、ETS2 是結(jié)直腸癌患者術后無進展生存的獨立預測因子

如表2 所示，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、MMR 狀態(tài)和ETS2 表達與預后密切相關（P ＜0.05），浸潤深度越深和ETS2 高表達的結(jié)直腸癌患者預后更差（P ＜0.05）（圖3）。Cox多因素生存分析提示，ETS2 表達（HR：0.461，95%CI：0.271～0.683，P=0.003）和浸潤深度（HR：0.352，95%CI：0.113～0.769，P=0.015）是結(jié)直腸癌患者術后無進展生存的獨立預測因子。

討 論

圖2 ETS2 蛋白在結(jié)直腸癌、癌旁組織中的表達情況，其中藍色顆粒代表細胞核、不表達ETS2 蛋白，褐色顆粒代表細胞核表達ETS2 蛋白。2A：ETS2 蛋白在癌旁組織和癌組織中的表達（×100 倍）；2B：ETS2 蛋白在癌組織中低表達和高表達圖（×200 倍）

ETS 蛋白上有保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋DNA結(jié)合區(qū)（ETS 結(jié)構(gòu)域），能夠特異性識別并結(jié)合到DNA 富含嘌呤的GGA（A/T）區(qū)域（EBP 位點），調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄［8］。研究表明，ETS2 調(diào)控細胞的增殖和凋亡，進而涉及腫瘤發(fā)生［4］。ETS2 的許多靶基因都涉及細胞周期調(diào)控，如cyclin D1，Bcl-2，Bcl-XL。ETS2 可結(jié)合靶基因UCA1 參與調(diào)控細胞周期和增殖［8-9］。此外，ETS2 還能夠與染色質(zhì)重組復合物SWI/SNF 相互作用，共同作用于乳腺癌易感基因BRCA1 的啟動子區(qū)。在食管癌的研究中也發(fā)現(xiàn)對EST2 的抑制能導致細胞停滯于 G0/G1 期［4，8，10］。EST2 對細胞周期的調(diào)控有可能是通過對多種細胞周期調(diào)控蛋白的抑制作用來實現(xiàn)的［11-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，ETS2 在結(jié)直腸癌組織中的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均過表達。此外，ETS2 的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤浸潤深度呈正相關。這表明，ETS2 與結(jié)直腸癌的進展密切相關，ETS2 介導的信號通路有可能是結(jié)直腸癌發(fā)病中新的發(fā)病機制。進一步通過對結(jié)腸癌組織中ETS2 作用機制的研究可揭示結(jié)腸癌發(fā)病新的分子機制，能為結(jié)腸癌的診斷提供新的標志物，并為未來靶向治療提供新的治療靶點［4］。

我們還發(fā)現(xiàn)，MMR 狀態(tài)與ETS2 表達相關，低表達ETS2 的癌組織中存在更多的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），與DNA 修復功能正常（MMS）的患者相比，MMR 功能缺陷（dMMR）患者預后相對較好（見表2）。文獻報道，MSI 的患者中腫瘤具有復發(fā)率低、緩解期長、低轉(zhuǎn)移和存活率較高［14-15］。對于具有dMMR/MSI-H 的Ⅱ期患者，給予5-FU輔助化療非但不能帶來生存獲益，反而對患者不利。ASCO 年會研究報告，對于經(jīng)目前所有標準治療均失敗、且為dMMR 的晚期結(jié)直腸癌患者，可給予抗PD-1 單抗Pembrolizumab（帕姆單抗）治療，NCCN 指南也推薦帕姆單抗和Nivolumab（納武單抗）用于MSI-H/dMMR 轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的末線治療［16-18］。研究者推測，dMMR 癌細胞相比于MMR 正常癌細胞，更易累積突變，產(chǎn)生大量異源抗原，可有效地被免疫T 細胞識別，達到更好的免疫治療效果［16，18］。而MMR 狀態(tài)和ETS2 的表達調(diào)控關系，值得我們進一步研究。

表1 ETS2 蛋白的表達與結(jié)直腸癌患者 病理臨床參數(shù)的關系

目前，對于結(jié)直腸癌術后復發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測主要還依賴于血清CEA、腹部增強CT/MRI、結(jié)腸鏡以及PET-CT 等手段，盡管ctDNA、DNA 甲基化以及外泌體等新的檢測手段在腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測的研究上取得一定的成果，但因為缺乏多中心RCT 結(jié)果以及昂貴的費用等原因，也一直未普及于臨床［19-20］。 利用生物分子標志預測術后復發(fā)轉(zhuǎn)移為結(jié)直腸癌術后腫瘤監(jiān)測提供新的方向。我們證實，ETS2 表達（HR：0.461，95%CI：0.271～0.683，P=0.003）是結(jié)直腸癌患者術后無進展生存的獨立預后因素。這提示，ETS2 可能是預測患者術后復發(fā)和進展的潛在標記物。類似的結(jié)果在髓樣白血病、乳腺癌中也得到證實［5-6］。這為ETS2 作為臨床上腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移的生物預測標志物提供理論依據(jù)。但仍需多中心、大樣本量的進一步的驗證，此外，若建立組織——外周血漿同步檢測效能，將ETS2 的血漿檢測動態(tài)化、標準化、簡易化，有助于早期追蹤術后的微小殘留病灶，將具有重要的臨床轉(zhuǎn)化價值。

表2 結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的單因素 和多因素的無進展生存分析

圖3 Kaplan-Meier 生存曲線。ETS2 高表達的結(jié)直腸癌患者無病生存期更差

綜上所述，和癌旁組織相比，ETS2 在結(jié)直腸癌組織中的表達水平明顯升高，而且具有獨立的預后預測意義，這就使ETS2 可能成為重要的治療靶點和有效的術后預測復發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標志物。